Націлювання на лактатдегідрогеназу А за допомогою катехіну повторно сенсибілізує клітини раку шлунка SNU620/5FU до 5-фторурацилу, частина 2

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

2.5. Спільне лікування CA та 5Fu індукує мітохондріальний АФК-залежний апоптоз

Оскільки інгібування LDHA безпосередньо збільшує мітохондріальну ROS і втрату її мембранного потенціалу, згодом індукуючи апоптоз [16,29], були досліджені фактори, пов’язані з мітохондріальним ROS-опосередкованим апоптозом. Одноразова обробка CA або 5FU дещо підвищила мітохондріальний рівень ROS у клітинах SNU620/5FU за результатами вимірювання проточною цитометрією з використанням MitoSOX. Однак спільне лікування CA та 5FU значно посилювало виробництво мітохондріальних АФК. Це збільшення виробництва АФК було скасовано Mito-TEMPO, антиоксидантом, спрямованим на мітохондрії (рис. 5A-C). Пригнічення росту після обробки CA і 5FU також було відновлено після обробки Mito-TEMPO в клітинах SNU620/5FU (рис. 5D). Крім того, апоптоз оцінювали за допомогою фарбування аннексином V-FITC/PI у клітинах SNU620/5FU. Спільне лікування CA та 5FU збільшило кількість апоптичних клітин серед клітин SNU620/5FU (рис. 6A, B). Ядерна морфологічна фрагментація з’являється під час апоптозу, і її можна спостерігати за допомогою 4',6-діамідіно-2-феніліндолу (DAPI) фарбування [30,31]. Було виявлено, що фрагментація ДНК значно зросла в групі спільного лікування порівняно з групою контролю (рис. 6C). Нарешті, досліджували біомаркери апоптозу, включаючи Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 і PARP. Проапоптотичний каскад збільшився після спільної обробки CA та 5FU у клітинах SNU620/5FU (рис. 6D). Ці результати свідчать про те, що одночасне лікування СА та 5FU індукує апоптоз у клітинах SNU620/5FU.

Рисунок 5. Спільне лікування катехіном (CA) і 5-фторурацилом (5FU) збільшує виробництво мітохондріальних АФК: (A)SNU620/5FU клітини обробляли зазначеними концентраціями CA, 5FU (10 мкМ) і Mito -TEMPO (20 мкМ) протягом 48 год. Мітохондріальну ROS клітин вимірювали за допомогою аналізу FACS з використанням MitoSOXTM Red; (B) гістограма показує швидкість клітин, які були позитивними за фарбуванням MitoSOX; (C) зображення флуоресцентної мікроскопії (X100) клітин SNU620/5FU, пофарбованих MitoSOX були представлені; (D) життєздатність клітин вимірювали за допомогою аналізу MTT. Результати показані як середнє ± SEM.*стор<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Рисунок 6. Збільшення апоптозу при одночасному лікуванні катехіном (CA) і 5-фторурацилом (5FU); Клітини SNU620/5FU обробляли CA （10 мкМ） та/або 5FU （10 мкМ） протягом 48 годин∶（A） кількість апоптотичних клітин аналізували за допомогою FACS-аналізу з використанням фарбування PI-Annexin V; (B) гістограма вказує на відсоток клітин у ранній та пізній фазах апоптозу. Результати показані як середнє ± SEM.**стор<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

3. Обговорення

У цьому дослідженні для характеристики та оцінки хіміорезистентності до 5FU ми використовували клітини SNU620/5FU, які були встановлені шляхом тривалої експозиції 5FU з серійним збільшенням концентрації препарату [32]. Повідомлялося, що батьківські клітини SNU620 містять мутант p53 з гомозиготною делецією в екзоні 5 [33]. На основі ДНК-мікроматриці кілька генів, залучених до хіміорезистентності, включаючи тимідилатсинтетазу, специфічний для пошкодження ДНК-зв’язуючий білок 2, кластерин і мідкін, підвищені в клітинах SNU620/5FU [32]. Кілька попередніх досліджень використовували клітинну лінію SNU620/5FU як модель для оцінки in vitro ефективності ліків проти резистентності до 5FU через антимітоз, активацію AMPK і передачу сигналів каннабіноїдних рецепторів [34-36]. Однак метаболічні характеристики та рівні експресії пов’язаних з метаболізмом генів у клітинах SNU620/5FU та їхня роль у хіміорезистентності не були в основному досліджені.

Тут ми продемонстрували, що клітини SNU620/5FU мають розширені гліколітичні фенотипи, включаючи підвищене виробництво лактату та експресію ферментів, пов’язаних із перетворенням пірувату в лактат, таких як LDHA. Фосфорилювання PDHA1, що представляє знижену активність PDH через підвищення PDK2 і PDK3, також збільшилося в клітинах, стійких до SNU620/5FU, порівняно з тим у батьківських клітинах SNU620. Однак OCR не було суттєво знижено в резистентних клітинах. Можливим поясненням цієї невідповідності є поживна пластичність ракових клітин для циклу ТЦА, тобто амінокислоти або ацетил-КоА, отримані з жирних кислот, а не тільки ацетил-КоА, отримані з глюкози, можуть постачати субстрати для циклу ТЦА [37]. ]. У зв’язку з цим 5FU-резистентні клітини раку шлунка сприяють стовбуруванню через мітохондріальне окислення жирних кислот [38]. Крім того, резистентність до 5FU пов’язана зі збільшенням маси та активності мітохондрій, включаючи експресію ферментів ланцюга транспортування електронів (ETC) і споживання кисню [39, 40]. Таким чином, ми зосередилися на модуляції LDHA для ресенсибілізації 5FU-резистентності. Виходячи з наших результатів, інгібування активності LDHA за допомогою оксамату або СА успішно пригнічувало ріст резистентних клітин SNU620/5FU та ресенсибілізувало їх до лікування 5FU. Ці результати показали хорошу кореляцію з результатами попередніх досліджень, які повідомляли, що генетичне або фармакологічне інгібування LDHA успішно знижувало стійкість до хіміотерапії, включаючи 5FU [19,41,42]. Таким чином, ми припустили, що інгібування LDHA може бути достатнім для придушення стійкості проти 5FU в клітинах SNU620/5FU.

Цистанхе може підвищити імунітет

Кілька синтетичних молекул, таких як оксамат, FX11, PSTMB і GNE-140, були встановлені як низькомолекулярні інгібітори LDHA [11,43]. Серед них повідомлялося про FX11 як сенсибілізатор до хіміотерапії в резистентних пухлинних клітинах [44]. Однак, незважаючи на те, що багато інгібіторів LDHA знаходяться під пильною увагою для схвалення як нових протипухлинних препаратів, жоден з них ще не був схвалений. Таким чином, для створення нових інгібіторів ЛДГК потрібно більше препаратів-кандидатів [45]. Природні сполуки розглядаються як потенційні ресурси для протипухлинних препаратів, особливо для подолання хіміорезистентності як комбінованої терапії [46,47]. Таким чином, націлювання на метаболізм раку, особливо на метаболізм глюкози, за допомогою натуральних продуктів рослинного походження є новою тенденцією досліджень для розробки нових терапевтичних засобів проти раку [48].

Крім того, кілька звітів припускають, що природні продукти, такі як госипол, галофлавін, кроцетин, машина А та EGCG, є потужними інгібіторами LDHA [43,49,50]. Хоча серед них госипол має найпотужнішу інгібіторну дію на LDHA (IC50=9,8 мкМ), він також пригнічує активність LDHB, яка перетворює лактат на піруват [51]. Наші результати продемонстрували, що EGCG, встановлений інгібітор LDHA та сенсибілізатор до хіміотерапії 5FU [22-25], справляє інгібіторну дію як на LDHA, так і на LDHB. Серед інгібіторів LDHA, отриманих із натуральних продуктів, які виявляють специфічну інгібіторну активність щодо LDHA, такі як машина A(IC50 =84 мкМ), кроцетин （IC50 =54.9 мкМ） і CA （IC{{13} }.69 мкМ）【49,50】, CA продемонстрував найкращий супресивний ефект на активність LDHA щодо значення ICsn.Хоча хімічні структури CA та EGCG дуже подібні, за винятком додаткового фрагмента галової кислоти, їх інгібуюча селективність була Крім того, незважаючи на те, що CA є найпростішою сполукою, порівняно з його похідними, він показав найкращу інгібіторну дію як на виробництво лактату, так і на активність LDHA. Таким чином, необхідно провести широке дослідження взаємозв'язку структура-активність, щоб продемонструвати CA як потенційна нова основа для розробки специфічних і потужних інгібіторів LDHA.

Відомо, що EGCG є конкурентним інгібітором NADPH. Крім того, EGCG пригнічує транслокацію та репродукцію НАДФН-оксидази [52-54]. Однак, згідно з результатами молекулярного моделювання, CA та EGCG структурно розташовані в різних місцях (рис. 3A, B). Крім того, вони не показали кореляції в специфічності інгібування активності LDHA та LDHB, які використовують NADH та NAD плюс як кофактор відповідно. З цих даних ми припустили, що КА не має прямої кореляції з EGCG у механізмі конкуренції з NAD(P)H. До речі, інгібування LDHA декількома інгібіторами, такими як FX11, GSK 2837808A, NCI-737 і NCI-006, зменшувало вироблення NADt і збільшувало накопичення NADH, тим самим зменшуючи співвідношення NAD плюс /NADH[16,17,55]. Апоптоз, індукований p53/NAD-залежним шляхом пошкодження ДНК, також посилюється інгібуванням LDHA за допомогою siRNA або хімічного інгібітора NH-2 [56]. Також повідомляється, що сигнальний шлях GCN2-ATF4 є іншим механізмом, відповідальним за апоптотичну загибель клітин, спричинену інгібітором LDHA, GSK 2837808A [17]. Оскільки співвідношення NAD/NADH відіграє ключову роль в окислювально-відновному гомеостазі та проліферації клітин [5758], КА як інгібітор LDHA може впливати на 5FU-стійкі ракові клітини через модуляцію співвідношення NAD плюс/NADH.

CA індукував загибель клітин як у батьківських SNU620, так і в 5FU-стійких SNU620/5FU клітинах. Однак загибель клітин, викликана CA, залежала від LDHA через виснаження shRNA у клітинах SNU620/5FU. Крім того, спільне лікування CA та 5FU продемонструвало додаткові протипухлинні ефекти на 5FU-стійкі клітини. Як повідомлялося раніше [16, 59], інгібування LDHA збільшує АФК і, отже, пригнічує ріст ракових клітин. Коли LDHA інгібувалася, енергетичний метаболізм перетворювався з гліколізу на цикл TCA та мітохондріальне окисне фосфорилювання [60]. Таким чином, ракові клітини виробляють більше АФК, що призводить до пошкодження мітохондріальної мембрани та мітохондріально-індукованого апоптозу [61,62]. Як добре узгоджується з попередніми дослідженнями, КА індукує апоптотичну смерть клітин через мітохондріальний АФК-залежний шлях. Підвищена захисна здатність АФК і знижені апоптотичні сигнали є загальними властивостями хіміорезистентних ракових клітин, особливо 5FU-резистентних клітин 3,63]. Крім того, зміни в метаболізмі раку, зокрема в метаболізмі глюкози, також призводять до резистентності до хіміотерапії через зміну клітинної діяльності, таку як аномальна репарація ДНК, посилена аутофагія, знижений апоптоз, захист від АФК і підвищена секреція екзосом [9,64,651]. . Таким чином, націлювання на гліколітичні ферменти, включаючи LDHA, з CA може бути альтернативною стратегією для подолання хіміорезистентності, особливо при 5FU-резистентному раку шлунка. Як правило, злоякісні пухлини, що швидко діляться, є високочутливими до інгібіторів синтезу ДНК, включаючи 5FU, порівняно з нормальною тканиною. Однак деякі ракові клітини можуть виробити резистентність до лікування за допомогою кількох механізмів, як описано раніше [34-36]. Одночасне лікування біологічно активними сполуками та традиційною хіміотерапією має більший ефект, порівняно з одним препаратом, щодо уповільнення розвитку резистентності |66. Таким чином, біологічні ефекти специфічних фітохімічних речовин із доведеною цитотоксичною дією, що застосовуються разом із звичайною хіміотерапією для націлювання на ширший спектр сигнальних шляхів у ракових клітинах, включаючи метаболізм раку та функції мітохондрій, мають перевершувати окремі сполуки в лікуванні раку, оскільки вони можуть затримувати розвиток резистентності [67]. У цьому дослідженні комбінація CA і 5FU показала більш високе пригнічення життєздатності клітин порівняно з одноразовою обробкою. Крім того, ми продемонстрували, що інгібування активності LDHA та наступний мітохондріальний АФК-опосередкований апоптоз може бути механізмом, що лежить в основі сенсибілізуючого ефекту КА на 5FU-стійкі клітини (рис. 7).

На додаток до потужності та специфічності інгібування ЛДГК, КА є безпечнішим, ніж інгібітори ЛДГ, отримані з природних продуктів. Крім того, CA є добре відомим хімічним інгредієнтом зеленого чаю, і його безпека та фармакодинамічні властивості були підтверджені в попередніх дослідженнях [68-70]. Проте точна оцінка токсичності одночасного введення КА та 5ФУ ще не проводилася. Крім того, у цьому дослідженні не досліджували ефективність КА in vivo в ракових клітинах, стійких до 5FU. Однак попередні дослідження повідомляють про протипухлинну ефективність КА та його похідних in vivo для подолання хіміорезистентності, включаючи резистентність до 5FU у раку шлунка та товстої кишки людини [71-77]. У цьому дослідженні ми зосередилися на інгібуванні LDHA як основного молекулярного механізму КА подолання резистентності до 5FU. Таким чином, щоб розробити CA як новий ад’ювант для хіміорезистентних ракових клітин, ефективність і безпеку одночасного лікування CA і 5FU in vivo слід оцінити за допомогою широких досліджень на тваринах, включаючи моделі ксенотрансплантата та хороші лабораторні оцінки токсичності.

4. Матеріали та методи

4.1.Матеріали

Антитіла проти полі(АДФ-рибозо)полімерази, каспази-3 і каспази-9 були придбані в Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Денверс, Массачусетс, США). Антитіла проти LDHA, гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) і PDHA1 були придбані в Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Каліфорнія, США), а антитіла проти фосфор-PDHA1 і PDK3 були придбані в Abcam ( Abcam, Кембридж, Массачусетс, США). Крім того, антитіла проти PDK2 і PDK4 були придбані у Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), антитіла проти PDK1 були отримані від Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), а антитіла проти B-клітин лімфома-2(Bcl-2) і Bcl-2-асоційований білок X були придбані у Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX був придбаний у Invitrogen (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). Хімічні речовини та реагенти, включаючи 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію бромід (МТТ),4',{{22} }діамідіно-2-феніліндол, оксамат, нікотинамідаденіндинуклеотид, CA та похідні CA (EC GC, EGC та EGCG) були придбані у Merck (Merck, Дармштадт, Німеччина). -нікотинамідаденіндинуклеотид (окислена форма) був придбаний у Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Токіо, Японія).

4.2. Культура клітин

Рак шлунка людини SNU620, SNU620/5FU та AGS, рак підшлункової залози Panic-1 та MIA PaCa-2, а також клітини LS174T та RKO раку товстої кишки були отримані з Корейського банку клітинних ліній (KCLB, Сеул, Корея). ).Клітини SNU620, SNU620/5FU, AGS і LS174T культивували в середовищі 1640 Меморіального інституту Розвелла Парку (RPMI-1640) (Велген, Тегу, Корея), доповненому 10-відсотковою інактивованою нагріванням ембріональною бичачою сироваткою (FBS). )(Gibco, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США) та 1% пеніциліну/стрептоміцину (Invitrogen), а також клітини Panc-1, MIA PaCa-2 та RKO культивували в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (Welgene ), що містить 10 відсотків термоінактивованого FBS і 1 відсоток пеніциліну/стрептоміцину. Усі клітини культивували у зволоженому CO2, інкубаторі при 37 градусах і 5% CO2.

4.3. Аналіз життєздатності клітин

Рівні цитотоксичності CA і 5FU в клітинах SNU620 і SNU620/5FU вимірювали за допомогою аналізу MTT. Клітини культивували в 24-лункових планшетах (2 × 104 клітин/лунку) із зазначеними концентраціями CA та 5FU протягом зазначеного дня. Розчин МТТ (2,0 мг/мл) додавали до кожної лунки з наступною 3-4 годиною інкубації при 37 градусах і 5% CO в інкубаторі для клітинних культур. Згодом культуральне середовище видаляли, а абсорбцію кристалів формазану проводили з живих клітин. ДМСО додавали для розчинення кристалів формазану, і вимірювали при 540 нм за допомогою Spectramax M2 Microplate Reader (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія, США).

4.4. Швидкість позаклітинного підкислення (ECAR) і швидкість споживання кисню (OCR)

ECAR та OCR, що вказують на клітинні швидкості гліколізу та окисного фосфорилювання відповідно, контролювали за допомогою аналізатора Seahorse XF (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США), як описано раніше [78,79]. Коротко, 60,000 клітин SNU620 або SNU620/5FU на лунку висівали в шестилункові планшети Seahorse XF у середовище RPMI з додаванням 1% пеніциліну/стрептоміцину. Після 30-хвилинної інкубації середовище з кожної лунки замінювали 80 мкл попередньо підігрітого безсироваткового середовища з 5 мМ оксамату, стандартного інгібітора ЛДГ [11]. Потім клітини інкубували при 37°C протягом 24 годин. Після інкубації середовище з кожної лунки замінювали 180 мкл попередньо підігрітого середовища XFbase (містить 10 мМ глюкози, 2 мМ глутаміну та 1 мМ пірувату натрію; pH 7,4) для вимірювання ECAR та OCR. Результати аналізували за допомогою програмного забезпечення Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція зворотної транскрипції (qRT-PCR)

Загальну РНК екстрагували за допомогою набору для екстракції загальної РНК RiboEx (GeneAll Biotechnology, Сеул, Корея), а кДНК синтезували за допомогою набору для зворотної транскриптази (Promega, Медісон, Вісконсин, США). Для зворотної транскрипції використовували 1 мкг загальної РНК , а загальна кількість синтезованої кДНК становить 20 мкл.Кожен набір використовували відповідно до інструкцій виробника.Кількісну ПЛР проводили за допомогою StepOneTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), з Real HelixgPCR Набір (NanoHelix, Daejeon, Корея), для 40 циклів, що складаються з 15 секунд при 95 градусах і 1 хвилини при 60 градусах Відносні рівні мРНК були нормалізовані до рівнів 18S рибосомальної РНК, яка служила ендогенним контролем. Послідовності праймерів які використовуються для QRT-PCR, перераховані в таблиці 1.

4.6.Блот-аналіз Вестера

Клітини промивали 1× PBS, і загальні білки екстрагували з клітин за допомогою буфера RIPA та 1% буфера для лізису NP-40, що містить коктейльні таблетки інгібітора протеази (Roche, Basel, Швейцарія). Концентрацію кожного білка вимірювали за допомогою аналізу білка Bio-Rad. Рівні кількості білка фракціонували з кожного зразка через 8-15% SDS-PAGE, а потім білки переносили на нітроцелюлозні мембрани (GE Healthcare, Мюнхен, Німеччина) за допомогою електрофорезу. Мембрани блокували при кімнатній температурі (20-25°) протягом 1 години з використанням 5% знежиреного сухого молока та інкубували з первинними антитілами при 4° протягом ночі. Згодом ці мембрани тричі промивали 1 × трис-буферним фізіологічним розчином протягом 10 хв. Специфічні смуги білків вимірювали за допомогою системи хемілюмінесцентної візуалізації (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Експресію білків регулювали за допомогою GAPDH. 4.7. Аналіз виробництва лактату

Виробництво лактату вимірювали в культуральних середовищах клітин SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T і RKO. Ці клітини інкубували протягом 1 дня при 37 градусах, а культуральне середовище згодом замінювали середовищем без фенолового червоного з подальшою інкубацією протягом 1 години при 37 градусах. Потім середовище кожної клітини оцінювали за допомогою комерційного набору для флуорометричного аналізу лактату (BioVision, Мілпітас, Каліфорнія, США).

4.8. Аналіз активності LDHA та LDHB

Щоб виявити активність LDHA, зазначені концентрації CA інкубували протягом 20 хв у буфері, що містить 2 мМ пірувату, 20 мМ NADH і 20 мМ HEPES-K плюс （pH7,2）. Для LDHBactivity використовували буфер, що містив 1 М Tris-HCl (pH8,0), 25 мМ NAD плюс і 2 М L-лактат натрію. Коротко, 10 нанограмів кожного з очищених рекомбінантних білків LDHA і LDHB використовувалися для аналізів активності LDHA і LDHB in vitro. Один мікрограм загального білка з клітинних лізатів використовувався для аналізів внутрішньоклітинної активності LDHA і LDHB як джерело ферменту. Флуоресценцію NADH при довжині хвилі збудження 340 нм і довжині хвилі випромінювання 460 нм було виявлено за допомогою спектрофлуорометра (Spectramax M2; Molecular Devices), як описано раніше [80]. Активність LDHA вимірювали за зменшенням кількості NADH, тоді як активність LDHIB оцінювали шляхом вимірювання кількості NADH, перетвореної з NAD плюс.

4.9. Взаємодія білок-мала молекула

Взаємодія між білком і малими молекулами була передбачена за допомогою програми Pyrex. Молекули LDHA (PDB ID:1l10) і 2D структури CA і EGCG, отримані з бази даних сполук NCBI PubChem, використовувалися в Pyrex. Ідентифікатор CA був 9064, а EGCG – 65064. Відносний розподіл поверхневого заряду було показано з кислотною областю червоним, основною областю синім і нейтральною областю білим. Водневі зв'язки в комплексах LDHA з CA або EGCG, відповідно, були показані чорними пунктирними лініями. Послідовності було отримано з UniProt (https://www.uniprot.org, доступ 9 листопада 2020 р.) з номерами доступу P00338(LDHA).

4.10. Трансфекція короткої шпилькової РНК (shRNA)

Були використані макетний вектор pLKO.1 і вектор LDHA, націлений на shRNA, як описано раніше [50]. Клітини висівали в шестилункові планшети (2 × 10 клітин на лунку) та інкубували протягом ночі. Клітини SNU620/5FU трансфікували за допомогою гена поліетиленіміну (PED) (Polyplus-transfection, llkirch, Франція), а співвідношення PEI становило 1:3. Потім трансфіковані клітини обробляли 1 мкг/мл пуроміцину протягом 1 тижня. Контрольна клітинна лінія була створена після зараження зашифрованою плазмідою.

4.11. Надмірна експресія LDHA

Плазміду pDEST27-LDHA було сконструйовано шляхом субклонування кДНК LDHA (придбаної в Korea Human Gene Bank, Daejeon, Korea) у вектори pDEST27 (Invitrogen). Було проведено два набори субклонованих для LDHA. Для реконструкції LDHA клітини SNU620/5FU-shLDHA трансфікували pDEST27-LDHA та порожньою плазмідою pDEST27. Коротко кажучи, клітини культивували до 70-відсоткового злиття. Потім клітини обробляли сумішшю, що включає 3 мкг ДНК і Lipofectamine 2000 (Invitrogen) протягом 48 годин. Після інкубації клітини відбирали з 200 мкг/мл G418 протягом 1 тижня. Потім, щоб підтвердити ефективність трансфекції, ми провели Вестерн-блот.

4.12. Аналіз апоптозу

Апоптозні клітини виявляли за допомогою набору для виявлення апоптозу Annexin V-FITC (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США), згідно з інструкцією виробника. Коротко, клітини висівали в шестилункові планшети (2×10 клітин на лунку) і обробляли зазначеними концентраціями CA і 5FU протягом 2 днів. Через 2 дні обробки клітину промивали 1 × PBS. Клітини суспендували в 500 мкл буфера для зв’язування та обробляли 5 мкл аннексину V-FITC і 5 мкл пропідію йодиду (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) з подальшою інкубацією протягом 15 хвилин при кімнатній температурі в темно. Інтенсивність флуоресценції досліджували за допомогою BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Аналіз виявлення мітохондріальних активних форм кисню (АФК).

Виробництво мітохондріальних АФК було виявлено за допомогою індикатора мітохондріального супероксиду MitoSOX Red (Thermo Fisher Scientific). Клітини висівали в шестилункові планшети （2 × клітини по 10 градусів/лунку） і Mito-TEMPO（20 мкМ; Sigma-Aldrich） попередньо обробили протягом 1 години перед лікуванням препаратом. Клітини ресуспендували в 1 мл 1× забуференого фосфатом фізіологічного розчину (PBS), після чого додавали 5 мкМ MitoSOX. Потім клітини інкубували протягом 10 хвилин при 37 градусах. Інтенсивність флуоресценції аналізували за допомогою BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Флуоресцентне зображення було виявлено за допомогою флуоресцентного мікроскопа (збільшення, 100 ×) (мікроскоп Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, Німеччина).

4.14. Фарбування ядра DAPI

SNU620/5FU висівали в 24-лунковий планшет (5 × 104 клітин/лунка) і обробляли зазначеними концентраціями CA і 5FU протягом 48 годин. Після промивання 1× PBS клітини ресуспендували в 1- мл 1× PBS. Потім клітини фарбували 4 мкг/мл DAPI протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та досліджували під флуоресцентним мікроскопом (збільшення 200×) (Carl Zeiss).

4.15. Статистичний аналіз

Результати життєздатності клітин, продукції лактату, активності ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, LDHB, апоптозу та мітохондріальних АФК були вказані відносно контрольних значень і виражені як середнє ±стандартна помилка середнього значення трьох незалежних експериментів. Відмінності вище середнього значення в кожній групі аналізували за t-критерієм Стьюдента, тоді як відмінності між групами аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу за допомогою тесту Tukey, який використовував GraphPad Prism (Версія 5.0, GraphPad Software, Сан. Дієго, Каліфорнія, США).

5. Висновки

Взяті разом, клітини резистентного раку шлунка SNU620/5FU мають гліколітичні фенотипи, включаючи підвищене виробництво лактату та вищу експресію LDHA, ніж у батьківських клітинах SNU620. Обмеження гліколізу CA, як специфічного інгібітора LDHA, підвищує чутливість клітин SNU620/5FU до 5FU. Крім того, одночасне лікування CA та 5FU посилило мітохондріальну ROS та апоптотичну загибель клітин у стійких до 5FU клітинах. Наші висновки свідчать про те, що CA може бути перспективним кандидатом для розробки ад’ювантного препарату, який знижує стійкість до хіміотерапії на основі 5FU шляхом обмеження активності LDHA.

Додаткові матеріали: наведені нижче матеріали доступні в Інтернеті за адресою https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22105406/s1, Рисунок S1: Вплив 5FU на життєздатність клітин SNU620/5FU, Рисунок S2: Ріст SNU620 і клітини SNU620/5FU, виміряні шляхом підрахунку клітин, Рисунок S3: Рівні виробництва лактату в клітинах SNU620 і SNU620/5FU, Рисунок S4: Експресії ізотипів PDK у клітинах SNU620 і SNU620/5FU, Рисунок S5: Вплив оксамату на життєздатність SNU620 і Клітини SNU620/5FU, Рисунок S6: Вплив EGCG на активність LDHA та LDHB, Рисунок S7: Вплив катехіну (CA) на рівні експресії білків p-PDHA1, PDHA1 та PDKs, Рисунок S8: Аналіз калориметрії з ізотермічним титруванням (ITC) LDHA і CA, Рисунок S9: Експресія LDHA в клітинах SNU620/5FU, трансфікованих shLDHA, Рисунок S10: Вимірювання гліколітичних фенотипів і життєздатності клітин у різних ракових клітинах, Рисунок S11: Необроблені дані аналізу Вестерн-блот.

Ця стаття взята з Int. J. Mol. наук. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms