Клонування генів, функціональна ідентифікація, структурний аналіз та аналіз експресії сахарозосинтази з Cistanche Tubulosa Ⅱ

Результати та аналіз

1 Видобуток генів сахарозосинтази в Cistanche tubulosa та клонування гена CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>надземна частина.

Високоякісний Cistanche Tubulosa для чоловічого здоров'я

Таким чином, значення FPKM рівня експресії двох кандидатів на гени сахарозосинтази, отримані під час початкового скринінгу в даних транскриптомів різних частин Cistanche tubulosa, нормалізували за допомогою Z-Score та проводили диференційний аналіз (рис. 1A). Результати показали, що ген CtSus мав найвищий рівень експресії в гаусторії, а рівень експресії в підземній частині був вищим, ніж у надземній частині, що узгоджувалося з характером накопичення глікозидних сполук у різних частинах Cistanche tubulosa, при цьому рівень експресії гена CtSus1 в гаусторії був низьким. Таким чином, на основі наведених вище результатів ген CtSus був обраний для подальшої ампліфікації послідовності, екзогенної експресії та функціональної ідентифікації. Використовуючи кДНК Cistanche tubulosa як матрицю, було отримано односмуговий продукт при ~2500 bp після ПЛР-ампліфікації (рис. 1B). Продукт ПЛР витягували з гелю та лігували з вектором клонування, а повнорозмірну кодуючу область цільового гена отримували шляхом секвенування. Довжина послідовності CtSus становила 2418 bp.

Малюнок 1 Дослідження гена та клонування CtSus з C. tubulosa та біоінформаційний аналіз кодованого ним білка. A: Рівні експресії генів CtSus і CtSus1 у різних частинах C. tubulosa нормалізовані як Z-показники на основі їх значень FPKM; B: Ампліфікація гена CtSus; M: маркер ДНК; C: консервативний домен білка CtSus, передбачений SMART; D: множинне вирівнювання послідовностей синтаз CtSus і сахарози, ідентифікованих з інших рослин, включаючи Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum і Albuca bracteata. Домен синтезу сахарози та домен перенесення цукру представлені червоними та синіми прямокутниками відповідно; E: Філогенетичний аналіз CtSus і сахарозинтаз інших рослин; F: SDS-PAGE аналіз гетерологічної експресії CtSus з використанням вектора pCold™ I в E. coli. Доріжка 1: білковий маркер; Доріжка 2: фракція супернатанту; Доріжка 3: Фракція осаду. Червона стрілка показує білок CtSus. G: ПЛР колонії одного клону, що містить дві рекомбінантні плазміди. М: маркер ДНК; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Таблиця 2 Подібності амінокислотної послідовності між CtSus і синтазою сахарози, ідентифікованими з іншої рослини

2.3 Філогенетичний аналіз

Філогенетичне дерево, побудоване програмним забезпеченням MEGA, було використано для аналізу філогенетичного зв’язку між синтазою сахарози CtSus з Cistanche tubulosa та синтазами сахарози рослинного походження. Результати показані на малюнку 1E. Синтази сахарози рослинного походження демонструють чіткі еволюційні гілки у дводольних (регіони I і II) і однодольних (регіон III). CtSus знаходиться в гілці дводольних, а послідовності, які найбільш тісно пов’язані з CtSus, походять з рослин Lamiaceae (Cistanche tubulosa є рослиною Lamiaceae Orobanchaceae), тоді як інша гілка в основному складається з рослин Solanales, що додатково вказує на високу збереженість і гомологія генів сахарозосинтази рослинного походження в еволюції рослин в тому ж порядку. Серед них синтаза сахарози PrSus (AEN79500.1) з Phelipanche ramosa рослини Orobanchaceae найбільш тісно пов’язана з CtSus.

3 Екзогенна експресія та аналіз активності CtSus

3.1 Екзогенна експресія гена CtSus Плазміди pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus і pCold™ I-CtSus, перевірені шляхом секвенування, були перенесені в E. coli Transetta (DE3), здатну до експресії. і позитивні клони перевіряли за допомогою ПЛР колонії для перевірки секвенування. Отримані рекомбінантні експресійні штами індукували IPTG при низькій температурі для експресії білка, бактерії збирали центрифугуванням і додавали буфер для лізису, щоб розщепити бактерії, щоб отримати супернатант і осад, і проводили SDS-PAGE для виявлення. Результати показали, що коли pET-28a і pET-24b використовували як вектори експресії, CtSus не експресувався в E. coli, тоді як коли pCold™ I використовувався як вектор експресії, чіткий CtSus смуга рекомбінантного білка була виявлена ​​в області ~100 кДа, що узгоджувалося з його теоретично передбаченою відносною молекулярною масою 92,2 кДа (рис. 1F).

3.2 Повноклітинна трансформація

Для того, щоб попередньо перевірити каталітичну функцію CtSus, був сконструйований штам спільної експресії CtSus і гена глікозилтрансферази UGT71BD1. UGT71BD1 був клонований та ідентифікований з Cistanche tubulosa і є UDP-глюкозилтрансферазою, яка може широко приймати ароматичні сполуки, такі як фенілетаноїдні глікозиди, різні типи флавоноїдів, стильбен і кумарин, як рецептори та каталізувати реакцію глюкозилювання субстратної фенольної гідроксильної групи за допомогою UDP-глюкози як донор цукру [18]. Введення CtSus теоретично може забезпечити більшу достатню кількість UDP-глюкози-донора глікозилу для реакції глюкозилювання, що каталізується UGT71BD1, таким чином сприяючи рівновазі реакції в напрямку утворення продуктів глікозилювання, тим самим збільшуючи вихід продуктів глікозилювання. Плазміду pCold™ I-CtSus і плазміду pET-28a-UGT71BD1 одночасно трансформували в E. coli Transetta (DE3), здатну до експресії. Поодинокі клони, що містять обидві рекомбінантні плазміди, перевіряли за допомогою ПЛР колоній, і шляхом перевірки секвенування отримували позитивні рекомбінантні експресійні штами (рис. 1G). Подвійну спільну експресію генів індукували in vitro, а штам експресії одного гена pET-28aUGT71BD1 використовували як контрольну групу. Активність CtSus у каталізуванні генерації донора UDP-глюкози була попередньо підтверджена трансформацією цілої клітини. Результати ВЕРХ і мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю показали, що коли реакцію трансформації цілої клітини проводили з аконітином 1 і ресвератролом 2 як субстратами, утворення очевидних продуктів глікозилювання було виявлено після 24 годин трансформації, як показано на малюнку 2.

Малюнок 2 Цільноклітинна біотрансформація субстрату 1 або 2 рекомбінантним штамом, що містить UGT71BD1 або рекомбінантним штамом, що містить UGT71BD1, зчепленим із CtSus відповідно. A: ВЕРХ-хроматограми біотрансформації цільної клітини субстрату 1. Довжина хвилі виявлення становила 360 нм; B: спектри HRESI-MS і MS2 продукту 1a; C: ВЕРХ-хроматограми біотрансформації цільної клітини субстрату 2; Довжина хвилі детектування становила 330 нм. D: спектри HRESI-MS продуктів 2a і 2b

Коли 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, молекулярна формула C9H6O4) використовувався як субстрат, хроматографічний пік продукту 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, передбачена молекулярна формула C15H16O9) був виявлений на 5,39 хв, що узгоджувалося з УФ поглинання субстрату та контрольного продукту. У той же час пік фрагмента m/z 179.033 4 [M+H]+ був виявлений у спектрі MS2 1a, який був утворений втратою 1a молекули глюкози (162 Da), що вказує на те, що 1а був продуктом субстрату 1, з’єднаного з молекулою глюкози. Коефіцієнт конверсії був розрахований шляхом інтегрування площі піку. Було виявлено, що швидкість конверсії цілих клітин UGT71BD1, які каталізують субстрат 1 для генерування глікозильованого продукту 1a, становила 71,87%, тоді як додавання CtSus збільшило швидкість конверсії реакції до 95,84%, що в 1,3 рази перевищує показник контрольної групи. Коли субстратом була сполука 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, молекулярна формула C14H12O3), хроматографічні піки продукту 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, прогнозована молекулярна формула C20H22O8) і 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, прогнозована молекулярна формула C26H32O13), що відповідає характеристиці УФ-поглинання субстрату та контрольного продукту, було виявлено на 10,32 та 6,52 хв відповідно . Пік фрагмента був виявлений при 3 [MH]-, який був утворений втратою однієї молекули глюкози (162 Да), що вказує на те, що 2a був продуктом субстрату 2, з’єднаного з однією молекулою глюкози. Шляхом порівняння з даними в літературі [18] та прогнозованою інформацією мас-спектрометрії було визначено, що продукт 2b був продуктом субстрату 2, з’єднаного з двома молекулами глюкози. Коефіцієнт конверсії був розрахований за допомогою інтегрованої площі піку. Було виявлено, що додавання CtSus може підвищити швидкість перетворення реакції глікозилювання субстрату 2 з 64,01% до 78,51%, серед яких вихід моносахаридного продукту 2а зріс з 45,09% до 63,58%, а вихід дисахаридного продукту 2b змінився з 18,92% до 14,93%.

3.3 Очищення рекомбінантного білка CtSus та ідентифікація ферментативної активності in vitro

Результати експерименту з трансформації цілої клітини свідчать про те, що CtSus каталізує виробництво активного донора глюкози UDP-глюкози. Для подальшої безпосередньої перевірки цієї каталітичної активності через ферментативну каталітичну реакцію in vitro злитий білок гена CtSus у системі експресії pCold™ було розділено та очищено за допомогою афінної хроматографії. Результати показали, що при використанні pCold™ I як вектора експресії рекомбінантний білок експресувався у великих кількостях, але переважно в осаді. Коли pCold™ TF використовувався як вектор експресії, ген CtSus експресувався у великій кількості в E. coli (рис. 3A). Злитий білок очищали за допомогою афінної хроматографії HisTrap FF і піддавали ферментативній каталітичній реакції in vitro. Результати показані на малюнку 3B. Коли сахарозу та UDP використовували як субстрати, порівняно з групою негативного контролю, новий пік продукту був виявлений на 10,32 хв. Його час утримання та поглинання УФ-променів відповідали UDP-глюкозі. У порівнянні зі стандартом було доведено, що продукт є УДФ-глюкозою. Однак, оскільки злитий білок, що експресується вектором експресії pCold™ TF, містить велику розчинну мітку тригерного фактора (розмір білка мітки становить 48 кДа), він матиме великий вплив на каталітичну активність білка. Таким чином, мітка злитого білка була додатково розрізана ферментом фактора Xa, і білок CtSus без екзогенних міток був очищений (рис. 3A). Білок піддали ферментативному каталізу in vitro, і результати показали, що вихід UDP-глюкози збільшився з 3,53% до 10,66%

(Малюнок 3B). Наведені вище результати підтвердили активність CtSus у каталізації виробництва UDP-глюкози за допомогою ферментативного каталізу in vitro, а також показали, що наявність великої афінної мітки сприяє розчинній експресії CtSus, але це також суттєво вплине на каталітична активність ферменту vitro.

Рисунок 3. Гетерологічна експресія та функціональна ідентифікація CtSus. A: SDS-PAGE аналіз білків CtSus. Доріжка 1: білковий маркер; Доріжка 2: рекомбінантний CtSus із тригерним фактором; Доріжка 3: Розщеплення мітки тригерного фактора за допомогою протеази фактора Xa для отримання білка CtSus, позначеного червоною стрілкою. B: Ферментативні аналізи invitro з використанням злитого білка та білків CtSus, вільних від тригерних факторів, для каталізації синтезу UDP-глюкози в присутності сахарози та UDP, відповідно, з еталонним стандартом UDP-глюкози. Як контрольну групу в тих же умовах використовували варений білок. Довжина хвилі детектування становила 260 нм