Дослідження захисного ефекту загальних глікозидів Cistanche Deserticola на алкогольне пошкодження первинно культивованих гепатоцитів миші
Mar 10, 2023
Мета: Вивчити захисну дію сумарних глікозидів цистанки пустерної на первинно культивовані гепатоцити. Методи. Первинні гепатоцити були зібрані методом перфузії in situ, і вплив загальних глікозидів Cistanche deserticola на рівень виживання первинно культивованих гепатоцитів, пошкоджених алкоголем, оцінювався методом МТТ; Вплив загальних глікозидів Cistanche deserticola на морфологію первинно культивованих гепатоцитів і ядер, пошкоджених алкоголем, оцінювали за допомогою флуоресцентної мікроскопії; Методом проточної цитометрії виявлено вплив загальних глікозидів Cistanche deserticola на апоптоз первинно культивованих гепатоцитів, пошкоджених алкоголем; Імуноцитохімічне фарбування використовували для виявлення впливу загальних глікозидів Cistanche deserticola на експресію bcl-2 і c-fos. Результати: після алкогольного ушкодження відсоток виживаності первинних гепатоцитів знизився, були явні зміни апоптозу та некрозу. Експресія інгібуючого апоптоз гена bcl-2 знижувалася, а експресія гена c-fos, що стимулює апоптоз, зростала. Загальні глікозиди Cistanche deserticola можуть значно підвищити рівень виживання клітин, покращити апоптоз і некроз, посилити експресію bcl-2 і пригнічувати експресію c-fos. Ефект був дозозалежним. Висновок: глікозиди Cistanche deserticola можуть захищати первинно культивовані гепатоцити, збільшуючи експресію гена bcl-2, що інгібує апоптоз, зменшуючи експресію гена c-fos, що сприяє апоптозу, зменшуючи апоптоз і некроз, а також підвищуючи рівень виживання клітин.
Ключові словазагальні глікозидицистанка пустирська; Первинна культура; гепатоцит; Алкогольне ураження печінки; Апоптоз
Порошок цистанчі
В останні роки з підвищенням рівня життя людей споживання алкоголю швидко зросло, що супроводжувалося збільшенням різноманітних захворювань, пов'язаних з алкоголем, і алкогольне ураження печінки є однією з важливих проблем. Дослідження показали, що Cistanche deserticola має захисну дію на посилення імунної функції, запобігає старінню, радіації, антиоксиданту, перекисного окислення ліпідів і ураження печінки, спричинене алкоголем [1]. Глікозиди є основними діючими речовинами Cistanche deserticola.У попередніх експериментах експериментами на тваринах було підтверджено, що загальна кількість глікозидівCistanche deserticola maможе зменшити вироблення вільних радикалів, підвищити здатність поглинати вільні радикали та їх метаболіти, тим самим пригнічуючи перекисне окислення ліпідів, і відігравати захисну роль при пошкодженні печінки, викликаному алкоголем[2]. Цей експеримент досліджуватиме захисну дію сумарних глікозидів Cistanche deserticola на алкогольне ураження печінки на клітинному рівні через первинну культуру гепатоцитів.
1 Матеріал і методи
1.1 Реактив і приладЗагальні глікозидиCistanche deserticola, темно-коричневий порошок, наданий Школою фармації Університету Ланьчжоу, містить 88,6 відсотка загальних глікозидів фенілетанолу. Розчиніть у подвійній дистильованій воді та розведіть культуральний розчин до необхідної концентрації. Ферментний маркер (Beckman Coulter AD340), флуоресцентний мікроскоп (Olympus, BX51), інвертований фазово-контрастний мікроскоп (Leica DMI3000B), проточна цитометрія (Beckman colter cell, CellLabQuanta SC) тощо.
Натисніть тут, щоб переглянути Cistanche deserticolaзахистити печінкупродуктів
【Попросіть більше】 Email: xue122522@foxmail.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1.2 Первинні гепатоцити виділяли та культивували методом перфузії in situ [3].
Одна миша Куньмін була анестезована внутрішньоочеревинною ін’єкцією {{0}}.5% пентобарбіталу 0.5 мл. Після звичайної дезінфекції шкіри розкрийте живіт, перемістіть шлунково-кишковий тракт вліво, оголіть ворітну вену, обережно проколіть інфузійну голку інфузійного пристрою з дальнього кінця ворітної вени, перев’яжіть і зафіксуйте її. Увімкніть потік інфузійного набору до максимуму (приблизно 4 мл/хв) і закапайте вільний від кальцію розчин для попередньої перфузії, попередньо нагрітий до 37 градусів. Коли печінка набрякла, швидко відріжте дистальний кінець нижньої порожнистої вени та періодично стискайте проксимальний кінець нижньої порожнистої вени, щоб печінка по черзі втягувалася і розширювалася. Коли залишки крові вимиваються і печінка стає рівномірно жовто-білою, теплий 0,05-процентний перфузійний розчин колагенази (Sigma) використовують для перфузії травлення. Травлення припиняється, коли печінка стає м'якою і нееластичною, під печінковою капсулою з'являються дрібні вакуолі або навіть тріщини в тканині печінки. Обережно відокремте печінку, перенесіть її на стерильну чашку, що містить належну кількість культурального середовища DMEM з високим вмістом цукру (Sigma), зніміть печінкову оболонку та обережно струсіть її, потім розсипте гепатоцити в культуральному середовищі, зберіть їх у конічний пробірку, струшуйте та культивуйте протягом 10 хв (частота вібрації 100 разів/хв), центрифугуйте протягом 3 хв (4 градуси, 1000 об/хв) і видаліть супернатант. Клітини суспендували в культуральному середовищі, фільтрували за допомогою нейлонової сітки розміром 200 меш, і фільтрат повторно центрифугували 3 рази (4 градуси, 1000 об/хв), щоб отримати клітини паренхіми печінки. Відрегулюйте концентрацію клітин до 5 × після 106 клітин/мл, інокулюйте їх у культуральний флакон об’ємом 25 мл, попередньо оброблений колагеном з хвоста щура, а потім інкубуйте їх в інкубаторі при 37 градусах, 5% CO2. Через 24 години змініть розчин, викиньте неприклеєні клітини та продовжуйте культивувати для використання в наступних експериментах.
1.3 Визначення кривої росту первинно культивованих гепатоцитів миші
Доведіть очищені гепатоцити до 5 × 106 клітин/мл, інокулювавши в 24-лунковий планшет, і 1 мл клітинної суспензії вносили в кожну лунку. Загалом було засіяно 21 лунку, і культуральне середовище DMEM з високим вмістом цукру, що містить 10 відсотків фетальної бичачої сироватки (Sigma), культивували протягом 7 днів. Щодня вибирайте 3 отвори навмання, переварюйте та рівномірно видуйте 0,25% трипсину, рахуйте на дошці для підрахунку та малюйте криву зростання
1.4 Створення моделі алкогольного ураження гепатоцитів.
Логарифмічні гепатоцити, отримані вищевказаним методом, інокулюють у {{0}}лунковий планшет, попередньо оброблений колагеном хвоста щура, і 100 клітин інокулюють у кожну лунку µ 50. Культуральне середовище DMEM містить 10 відсотків фетальної бичачої сироватки. культивували протягом 24 годин, а потім змінювали ще на 24 години. Було створено порожню групу та п’ять груп алкогольного втручання (50, 75, 100, 125, 150 ммоль/л), і кожна група була створена з п’ятьма реперфораціями. Після того, як гепатоцити культивували з різними концентраціями спирту протягом 24 годин, до кожної лунки µ 50 додавали 0,5 відсотка MTT (Sigma) 20. Продовжуйте культивувати протягом 4 годин, видаліть супернатант і додайте ДМСО150 у кожну лунку µ 50. Помістіть його в струшувальний стіл і перемішуйте протягом 15 хвилин, виміряйте значення поглинання при 570 нм і обчисліть рівень виживання клітин. Значення рівня виживання клітин групи введення/контрольної групи × 100 відсотків
1.5 Вплив сумарних глікозидів цистанки пустерної на виживаність первинно культивованих гепатоцитів
Пошкоджені алкоголем. Інокулюйте гепатоцити, отримані вищевказаними методами, на {{0}}лунковий планшет, попередньо оброблений колагеном з хвоста щура, і інокулюйте кожну лунку 100 мк50. DMEM культуральне середовище з 10% ембріональної бичачої сироватки культивували протягом 24 годин, а потім змінювали. Ще через 24 години ГХ з кінцевою концентрацією 0,2, 0,4 і 0,8 г/л були додані до групи введення відповідно. Модельна група етанолу та холоста група продовжували культивувати без додавання ліків, і кожній групі було встановлено п’ять множинних лунок. Через 24 години в модельну групу та групу втручання ГХ додавали спирт із кінцевою концентрацією 100 ммоль/л відповідно. Через 12 годин культивування виживаність клітин вимірювали методом МТТ.
1.6 Вплив загальних глікозидів цистанки пустерної на морфологію первинно культивованих гепатоцитів і ядер, пошкоджених алкоголем
Помістіть попередньо простерилізоване покривне скло в 6-лунковий планшет з концентрацією інокуляції 5 × 106 клітин/мл клітинної суспензії, модельна група, група Cistanche deserticola（0.2 , 0.4, {{20}}.8 г/л) і пуста група. Через 24 години культивування додайте 100 ммоль/л спирту з кінцевою концентрацією. Через 24 години посіву вийміть 95% етанол із предметного скла та зафіксуйте його протягом 15 хвилин. PBS двічі промивають, а потім знову диспергують у PBS. Відрегулюйте концентрацію клітин до 5 × 104 клітин/мл, додайте 10 мкл суміші акридинового оранжевого та етиліденброміду (Sigma) (0,01 мкг/мл розчину акридинового оранжевого, 0,02 мкг/мл розчину прометазину, змішане об’ємне співвідношення: 1/ 1), інкубували протягом 30 хвилин, спостерігали та фотографували під флуоресцентним мікроскопом.
1.7 Вплив загальних глікозидів Cistanche deserticola на апоптоз первинно культивованих гепатоцитів, пошкоджених алкоголем
Відрегулюйте щільність розщепленої клітинної суспензії до 5 × 106 клітин/мл, інокульуйте в шестилунковий планшет і культивуйте протягом 24 годин, створіть модельну групу, групу Cistanche deserticola (0).2 , 0.4, 0,8 г/л) і пуста група. Після 24 годин культивування додайте спирт з кінцевою концентрацією 100 ммоль/л, інкубуйте протягом 24 годин, переваріть і зберіть клітини, двічі промийте їх PBS, зафіксуйте їх при 4 градусах протягом ночі 70-відсотковим попередньо охолодженим етанолом, промийте їх PBS розчин двічі, додайте фермент РНК (Sigma), PI (100 мкг/мл) (Sigma) і помістіть у водяну баню 37 градусів на 30 хв. Швидкість апоптозу вимірювали проточною цитометрією.
1.8 Загальні глікозиди Cistanche deserticola можуть інгібувати апоптоз первинно культивованих гепатоцитів, пошкоджених алкоголем, bcl-2 і проапоптотичним геном c-fos
Ефект експресії fos був взятий з трьох шестилункових культуральних планшетів, кожна з яких була групою з трьох лунок. Було створено модельну групу, групу Cistanche deserticola (0.2, 0.4, 0.8 г/л) і порожню групу. У кожну лунку поміщали одне стерильне предметне скло. Були взяті клітини логарифмічної фази росту, розщеплення трипсином було використано для приготування одноклітинної суспензії, щільність клітин була доведена до 5 × 106/мл і засіяна на 6-лунковий планшет, 2 мл/лунку. Після 24 годин культивування додайте спирт з кінцевою концентрацією 100 ммоль/л і продовжуйте культивування протягом 24 годин. Вийміть предметні скла, заповнені клітинами, двічі промийте їх PBS і пофарбуйте звичайним імуногістохімічним методом ABC. Короткі кроки такі: зафіксуйте їх 40-відсотковим параформальдегідом протягом 10 хвилин, закрийте їх нормальною овечою сироваткою протягом 30 хвилин, опустіть і додайте поліклональне антитіло bcl-2 (Invitrogen) (1:75) або c-fos поліклональне антитіло (Invitrogen) (1:50), прореагувати при кімнатній температурі протягом 1,5 годин, додати комплекс ABC при кімнатній температурі протягом 2 годин, забарвити DAB і запечатати їх желатином. Експресію білка Bcl-2 і c-fos порівнювали за допомогою світлової мікроскопії та фотографії.
1.9 Статистична обробка Експериментальні дані обробляли за програмою SPSS13.5. Він виражається як середнє ± стандартне відхилення (x ± s), а t-тест використовується для порівняння між групами. П<0.05 indicates that the difference is statistically significant.
2 Результати
2.1 Крива росту первинно культивованих гепатоцитів миші показана на малюнку 1. Можна побачити, що кількість гепатоцитів збільшувалася з часом інкубації та увійшла в логарифмічну фазу росту на 4-й день.
Рис. 1 Крива росту первинно культивованих гепатоцитів миші
2.2 Вплив різних концентрацій алкоголю на виживаність первинно культивованих гепатоцитів миші
З таблиці 1 видно, що алкоголь має сильний ушкоджувальний ефект на первинно культивовані гепатоцити, і цей ефект є дозозалежним. Згідно з потребами тесту, 100 ммоль/л буде використано як робоча концентрація в наступному тесті, а рівень виживання клітин становить 43,40 відсотка.
2.3 Вплив загальних глікозидівцистанка пустирськана виживаність первинно культивованих гепатоцитів, пошкоджених алкоголем
Можна побачити в таблиці 2. Після алкогольного ушкодження виживаність гепатоцитів значно знижується. Сумарні глікозиди цистанки пустерної можуть значно збільшити виживаність гепатоцитів (P<0.05), and the effect is dose-dependent (P<0.05).
Пустельний живий цистанх
2.4 Вплив загальних глікозидівцистанка пустирськапро морфологію первинно культивованих гепатоцитів і ядер, пошкоджених алкоголем.
Азидин оранжевий показує зелену флуоресценцію після проникнення в клітини, тоді як прометазин може забарвлювати лише некротичні клітини з неповною клітинною мембраною. Під час спостереження (рис. 2) було виявлено, що гепатоцити в контрольній групі були рівномірно зеленими, а некротичні клітини не забарвлювалися бромно-червоним (А); Після обробки спиртом гепатоцити зменшилися, з’явилася велика кількість некротичних клітин, забарвлених бромним червоним, і апоптичних клітин із концентрацією хроматину в ядрі (ядро яскраво-зелене) (Б). Тому вважається, що алкоголь також може викликати некроз клітин, індукуючи апоптоз гепатоцитів. ГК можуть значно зменшити некроз і апоптоз, і ефект позитивно корелює з дозою (C, D, E).
Рис. 2. Спостереження впливу загальних глікозидів цистанки пустирної на морфологію первинно культивованих ядер печінки під флуоресцентним мікроскопом (фарбування акридиновим оранжевим, 400)
A: Пуста група; Б: Зразкова група; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GC; E: 0,8 г/L-GC
2.5 Вплив сумарних глікозидівцистанка пустирськана апоптоз первинно культивованих гепатоцитів, пошкоджених алкоголем
Порошок екстракту цистанчі
【Попросіть більше】 Email: xue122522@foxmail.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Як видно на малюнку 3-B, швидкість апоптозу гепатоцитів після алкогольного ушкодження значно збільшується (34,7 відсотка), а загальні глікозиди цистанки пустирної можуть значно підвищити рівень виживання гепатоцитів залежно від дози, що узгоджується з результатами, отриманими під флуоресцентним мікроскопом.
Рис. 3 Вплив загальних глікозидів Cistanche deserticola на апоптоз первинно культивованих гепатоцитів, пошкоджених алкоголем
A: Пуста група; Б: Зразкова група; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GC; E: 0,8 г/L-GC
За допомогою імуноцитохімії було встановлено, що експресія фактора, що інгібує апоптоз bcl-2, знижується (4-B), а експресія c-fos підвищується (5-B) після пошкодження клітин печінки алкоголем. Загальні глікозиди Cistanche deserticola можуть значно посилювати експресію bcl-2 (4-C, D, E) і пригнічувати експресію c-fos (5-C, D, E). Результати показано на рис. 4-5.
Рис. 4 Вплив загальних глікозидів Cistanche deserticola на експресію bcl-2 у первинно культивованих гепатоцитах, пошкоджених алкоголем (400)
A: Пуста група; Б: Зразкова група; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GC; E: 0,8 г/L-GC
Рис. 5. Вплив загальних глікозидів Cistanche deserticola на експресію c-fos у первинно культивованих гепатоцитах, пошкоджених алкоголем (400)
A: Пуста група; Б: Зразкова група; C:{{0}}.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GC; E: 0,8 г/L-GC
3 Обговорення
Китайська трава цистанка
Беррі та ін. вперше створив метод перфузії in-situ з використанням колагенази для перфузії печінки для отримання гепатоцитів у фізіологічних умовах, а пізніше розробив Seglen et al. [4], щоб зробити цю технологію колагеназної перфузії більш досконалою. Цей метод має високий вихід клітин і високу виживаність. У цьому експерименті первинні гепатоцити були отримані шляхом перфузії in situ гепатоцитів миші та культивовані. Метод був стабільним і активність клітин була високою. За допомогою тесту кривої росту було виявлено, що отримані первинні гепатоцити увійшли у фазу логарифмічного росту через 4 дні.
Колориметричний мікроаналіз MTT є чутливим методом виявлення росту та виживання клітин із хорошою повторюваністю. Сукцинатдегідрогеназа в мітохондріях живих клітин може відновлювати жовтий МТТ до синьо-фіолетових кристалів, тоді як мертві клітини такої функції не мають [5]. Активність клітини можна відобразити за допомогою вимірювання оптичної щільності. У цьому експерименті метод МТТ був використаний для виявлення того, що рівень виживання гепатоцитів після алкогольного ушкодження був значно знижений, а загальні глікозиди Cistanche deserticola могли значно збільшити рівень виживання гепатоцитів (P<0.05), and the effect was dose-dependent (P<0.05).
Апоптоз - це особлива форма загибелі клітин. Коли клітини піддаються апоптозу, відбуваються особливі морфологічні та біохімічні зміни [6-8]. Експеримент підтвердив, що більшість гепатоцитів були апоптичними після обробки алкоголем, і клітини показали явні морфологічні зміни, які полягали в наступному: клітини зменшилися, мікроворсинки на поверхні клітини зникли, поверхня клітини зменшилася, з’явилися вакуолі, ядра. конденсація та утворення апоптичних тілець; Супроводжується некрозом. Після обробки загальними глікозидами Cistanche deserticola швидкість апоптозу значно знизилася, а також полегшилася ситуація некрозу.
Ген bcl-2 є протоонкогеном. На даний момент знайдено п'ять сімейств генів bcl-2 (bcl-2, bcl-2 x, bax, mcl-1 і A1), в яких bcl{{7 }} може пригнічувати запрограмовану клітинну смерть (PCD). Робота bcl-2Механізм може включати: (1) інгібування вивільнення Ca2 plus. Bcl-2 — це трансмембранний білок, який переважно розташований на ядерній мембрані. Внутрішня і зовнішня ядерні мембрани з’єднані просвітом ендоплазматичної сітки. Останній є основним місцем зберігання внутрішньоклітинного Са2 плюс, який відіграє важливу роль у процесі апоптозу клітин. За допомогою трансгенних методів було виявлено, що висока експресія bcl-2 може пригнічувати вивільнення Ca2 plus з ендоплазматичного ретикулуму, тому було припущено, що інгібуюча дія bcl-2 на апоптоз може бути пов’язана до Са2 плюс в ендоплазматичному ретикулумі [9]. (2) Bcl-2 відіграє антиапоптотичну роль, блокуючи передачу сигналу проапоптотичних генів або блокуючи ці індуцибельні генні продукти. Дослідження показали, що білок bcl-2 може пригнічувати апоптоз, індукований P53 і c-fos [10]. (3) Bcl-2 може відігравати антиапоптозну роль, пригнічуючи вільні радикали. bcl-2 відіграє роль антиоксиданту, який може пригнічувати виробництво та дію супероксиду, таким чином перешкоджаючи виникненню апоптозу [11].
Ранні негайні гени (IEG) — це гени, які з’являються рано і мають короткий термін дії під впливом різних шкідливих подразників. c-fos є одним із протоонкогенів, розташований на хромосомі 14q21-q31. Це 9kb ДНК, що складається з чотирьох екзонів і трьох інтронів [12]. Основна транскрипція низька, але вона може бути ініційована різними молекулами другого месенджера для швидкої та тимчасової експресії. Білковим продуктом c-fos є FOS, а білком, який кодується протоонкогеном c-Jun, є JUN. FOS містить лейциновий антиланцюг (LZ) [13]. FOS і JUN утворюють гетеродимер у ядрі через структуру LZ, що називається транскрипційним фактором AP-1, який поєднується з сайтом AP-1 цільового гена та діє як третій месенджер ядра, уможливлюючи експресія гена ефекту протягом тривалого часу [14]. Морган вважає, що різні прояви c-fos вказують на різноманітність і складність його функцій. Тимчасова експресія може брати участь у захисті, відновленні, ремоделюванні та регенерації клітин, тоді як стійка надмірна експресія пов’язана з вторинним пошкодженням. Механізм експресії цих двох різний. Таким чином, можна вважати, що IEG, такі як c-fos, відіграють подвійну роль. Коли захисна система відновлення повністю пригнічена, вони беруть участь в апоптозі; Коли він не інгібується, він має захисну дію на клітини навколо ураження та бере участь у процесі відновлення та регенерації клітин [15]. WebsterKR використовує антисмислові нуклеотиди для зменшення транскрипції c-fos і запобігання виникненню апоптозу, що вказує на те, що надмірна експресія c-fos нерозривно пов’язана з виникненням і розвитком різних захворювань [16].
У цьому експерименті після пошкодження клітин печінки алкоголем експресія фактора, що інгібує апоптоз bcl-2, була значно знижена, а експресія c-fos зросла, що свідчить про те, що загальні глікозиди Cistanche deserticola можуть захистити печінку клітин шляхом посилення експресії bcl-2, пригнічення експресії c-fos, зменшення пошкодження клітин печінки та апоптозу.
【Попросіть більше】 Email: xue122522@foxmail.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
