Дослідження впливу актеозиду (діюча речовина в Cistanche Deserticola) на NAFLD, індукуючи аутофагію

Анотація:

 

Завдання:Дослідження функції, що індукує аутофагію активного інгредієнта актеозиду (ACT) у Cistanche Deserticola та його вплив на безалкогольну хворобу жирної печінки (NAFLD).

МетодиЩоб прийняти ехінакозид і діяти як об'єкти досліджень, 1 0 0 мкмоль/л ACT та ехінакозид (ECH) поєднувались з інгібітором аутофагії-лізисоми блеоміцином А1 для лікування інтервенції. Білок імуноблоттінг був використаний для виявлення відносного рівня експресії маркера аутофагії маркера білка, пов'язаного з мікротрубочкою, білка 1 легкий ланцюг 3 (LC 3- II). Клітини HEPG2 втручалися з різними концентраціями ACT in vitro, а життєздатність клітин виявляли за допомогою методу тетразолію солі. Втрупенція клітин HEPG2 з різними концентраціями ACT у поєднанні з балофлоксацином А1 та виявлення рівня експресії білка LC 3- II за допомогою білкової технології імуноблоттінгу. Модель NAFLD, побудована in vitro з втручанням лікарських засобів, була використана для фарбування ліпідних крапель за допомогою методу фарбування нафти O та виявлення внутрішньоклітинних тригліцеридів. Дотримуйтесь локалізації білка LC3 та ліпідних крапель за допомогою технології імунофлуоресценції. Закон про результати може суттєво індукувати аутофагію в клітинах HEPG2, а рівень експресії LC 3- білка II значно збільшується порівняно з контрольною групою (обробляється лише ACT) (1,36 ± 0. 11, 0. 28 ± 0}. відповідно) зі статистичною значимістю (P0.05). 50 мкмоль/л діють значно індуковані аутофагію в клітинах HEPG2, а рівень експресії LC 3- білка II значно збільшувався (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18 відповідно). Рівень TG клітин HEPG2 у групі втручання ACT (19,11 ± 1,68) був значно нижчим, ніж у групі клітинної моделі NAFLD in vitro (34,15 ± 1,90), а відмінності були статистично значущими (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Ключові слова:Неалкогольні жирні захворювання печінки;Cistanche deserticola;Актерозид; Аутофагія

 

TCM Herb Cistanche для лікування безалкогольних захворювань жирної печінки (NAFLD)

Клацніть на малюнку, щоб отримати більше деталей

 

За останні кілька десятиліть, безалкогольний жирзахворювання печінки(NAFLD) став найпоширенішимхронічні захворювання печінки, з глобальною поширеністю приблизно 25% дорослого населення і вважається тісно пов'язаним з метаболічним синдромом [1]. Незважаючи на те, що ймовірність ускладнень, пов'язаних з печінкою у пацієнтів з НАФЛД, становить менше 10%, NAFLD є фактором ризику виникнення захворювань, пов'язаних з печінкою, таких як цироз та первинний рак печінки, що накладає величезне економічне навантаження на пацієнтів [2-5]. Незважаючи на зростаючу увагу, що приділяється NAFLD, NAFLD як важливе хронічне захворювання не приділяло достатньої уваги. Тому подальше поглиблене розуміння патогенезу NAFLD та пошук ефективних стратегій лікування стало терміновими проблемами, які слід вирішити [6-7].

Останні дослідження показали, що клітинна автофагія відіграє важливу роль у фізіології та патології печінки [8]. Дисфункція аутофагії або дисрегуляція пов'язана з різними захворюваннями печінки, такими якЗахворювання печінки, пов’язаних з алкоголем[9], NAFLD [10], безалкогольний стеатогепатит [11] та гепатоцелюлярна карцинома [12]. Патологічні характеристики NAFLD-це надмірне осадження тригліцеридів (ТГ) та інших нейтральних ліпідних крапель (LD) у гепатоцитах при безалкогольній стимуляції. Для печінки два основні шляхи, що регулюють катаболізм цих ЛД, є ліполізом та аутофагією.
Шлях ліполізу регулюється цитоплазматичними нейтральними ліпазами, такими як гормонна ліпаза та жирова ліпаза ТГ. У відповідному шляху ліповофагії ЛД може вибірково прийняти шляхом безпосереднього набору білків, пов'язаних з аутофагією, для утворення аутофагосом, а потім ЛД, інкапсульовані аутофагосоми, подальше подаються до лізосом і розкладаються кислотною ліпазою в лізосомах. Тому активізація ліпоавтофагії в гепатоцитах стала ефективною стратегією профілактики та лікування NAFLD.
Cistanche Deserticola - це дорогоцінна китайська трав'яна медицина, яка широко застосовується в клінічній практиці в традиційних формулах китайської медицини. У той же час він давно використовується як добавка для здорової їжі. Cistanche Deserticola містить різноманітні біоактивні інгредієнти, найважливішим з яких є глікозиди Cistanche Deserticola. Як повідомлялося, що представники фенілетноїдних глікозидів, ехінакозид (ECH) та вербаскозид (ACT) мають багато важливих біологічних активності, таких як антиоксидант, нейропротектор, імуномодулююча та захист печінки [13]. З точки зору захисту печінки, дослідження виявили, що ECH може захистити печінку за рахунок зменшення медіаторів запалення, пригнічуючи трансформацію фактора росту та зниження рівня експресії генів, пов'язаних з фіброзом печінки. ACT має значний захисний вплив на хімічні та індуковані наркотиками ураження печінки, такі як алкоголь, тетрахлорид вуглецю та ліпополісахарид. Акт зменшує окислювальний стрес, спричинений токсичними хімічними речовинами, видаляє реактивне кисень, накопичений у печінці, зменшує концентрацію малодіалдегіду. У той же час, це значно збільшує активність печінки супероксиду димутази та знижує вміст глутатіону та значно покращує гістопатологічне пошкодження печінки та апоптоз. Однак не існує відповідного звіту про літературу про те, чи фенілетноїдні глікозиди Cistanche Deserticola беруть участь у процесі аутофагії в захисті печінки. Виходячи з цього, у цьому дослідженні було використано звичайні методи клітинної біології та клітинну модель in vitro для попереднього дослідження ефекту, що викликає аутофагі, фенівлетноїдних глікозидів Cistanche Deserticola та досліджувало його можливі фармакологічні функції, спрямовані на те, щоб забезпечити наукову основу для майбутнього розвитку лікарських засобів.

 

1 матеріали та методи

1.1 Матеріали

1.1.1 Суб'єкти досліджень ECH та ACT були використані в якості досліджень.

1.1.2 Materials HepG2 cells were purchased from Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (batch number: B21209) and ACT (batch number: B20715, HPLC purity Greater than or equal to 98%) were purchased from Shanghai Yuanye Biological Company, DMEM high glucose medium (batch number: SH30243.01), phosphate buffer, and Трипсин був придбаний у компанії Hyclone Company, США, сироватки великої рогатої худоби (партія номера: 04-002-1 a) була придбана у BI Company, Ізраїль, пеніцилін/стрептоміцин (партія: SV30010.01) був придбаний у компанії Hyclone, США, MTT (Batch Number: M8180 ( (Номер партії: BC0625) Набір виявлення був придбаний у компанії Solebao, Пекін, Китай, нафта червоний O (Номер лота: O 0625-100 G), диметилсульфоксид (номер лота: BCBZ1685) був придбаний у Sigma-Aldrich, США; Інгібітор аутофагії-лізисоми Bafilomycin A1 (BAFA1, номер лота: TLRL-BAF1) був придбаний у Invitrogen, США; Рапаміцин активатора автофагії (номер лота: S17098) був придбаний у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Китай; Мікротубуль-асоційований білок 1 Світловий ланцюг 3 (LC3, номер лота: L7543, види: кролик, коефіцієнт розведення: 1: 1 000) та -актин (число лота: ZRB1312, Види: Кролик, коефіцієнт розведення: 1: 5 000) Антитії були придбані від Sigma-Aldrich, США; Вторинне антитіло з міткою хрону (номер лота: 4010-05, види: козячий анти-кролячий коефіцієнт розведення: 1: 1 000) був придбаний у південної біотехнології, США, американська компанія Alexa Fluored: 546, відзначення (1 тис. Компанія Sigma-Aldrich, США та Bodipy 493/501 (номер лота: D3922) був придбаний у Invitrogen Company, США.

 

1.2 Методи

1.2.1 Клітинна культура

Клітини HEPG2 культивували в модифікованому орелі Dulbecco Eagle High Glucose, що містить 10% фетальної сироватки великої рогатої худоби, 100 О/мл пеніциліну та 100 мкг стрептоміцину в 37 градусів, 5% інкубатора вуглекислого газу. Коли впадіння клітин досягло 85%, було проведено субкультуру, покриття, втручання та інші операції.

 

1.2.2 Виявлення імуноблоттінгу білка

1.2.2.1 Активне та ECH лікування

LC 3- ⅱ Рівень експресії білка в клітинах HEPG2 BAFA1, як інгібітор протонного насоса, може викликати LC 3- ⅱ білок для агрегування у великих кількостях у клітинах, тим самим посилюючи здатність індукції аутофагії. Тому комбіноване використання BAFA1 може використовуватися як система моніторингу аутофагії для оцінки здатності індукції аутофагії. Клітини HEPG2 у фазі логарифмічного росту переносили в 3,5 см клітинних страв для культури клітин для культури протягом ночі. 100 мкмоль/л ACT, ECH та BAFA1 використовували для втручання протягом 12 год. Клітини промивали попередньо охолодженим фосфатним буферним розчином (PBS) і негайно лізирували в буфері лізису білка RIPA протягом 10 хв. Супернатант центрифугували і загальну концентрацію білка визначали за допомогою набору для концентрації білка біцинхонінової кислоти. Після кількісної оцінки з буфером додецилсульфату натрію зразок нагрівали при 95 градусах протягом 10 хв для денатури білка. Потім 30 мкл зразка взяли за допомогою мікропіпети та електрофорсували на поліакриламідному гелі.
Після електрофорезу білок переносили з гелю в нітроцелюлозну мембрану, блокували 1 0% молоком протягом ночі, інкубованому специфічним первинним антитілом при кімнатній температурі протягом 1 години, промивали фосфатним буфером, що містить 0,5% тритону, і інкубували з конкретним вторинним антитілом при кімнатній температурі для 1 год. Метод ECL був використаний для розробки кольорів. Вони були встановлені як порожня контрольна група, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 Group та ACT+BAFA1 Group.

 

1.2.2.2 Різні концентрації ACT втручали рівень експресії LC 3- ⅱ білка в клітинах HEPG2

Клітини логарифмічної фази росту HEPG2 переносили в 3,5 см клітинних страв для культури клітин для культури протягом ночі, а 25, 50 та 100 мкмоль/л у поєднанні з BAFA1 використовувались для втручання протягом 12 год, а рівень експресії білка 3- ⅱ ⅱ виявлений білковим імуноблоттінгом. Контрольна група (CON Group, Blank Control), група голодування (група STA, клітини Hepg2 лікування голодування), 25, 50 та 100 мкмоль/л ACT Group та BAFA1 у поєднанні з групою 25, 50 та 100 мкмоль/л ACT.

1.2.3 Метод MTT для виявлення швидкості виживання клітин HepG2, оброблених різними концентраціями ACT протягом 24 та 48 год
Клітини HEPG2 у фазі логарифмічного росту були прищеплені в пластині свердловини {1}} з помірною щільністю щеплення та культивованою в інкубаторі протягом 12 год. 2 0, 40, 60, 80 та 100 мкмоль/л ACT протягом 24 та 48 год. 0,5 мг/мл MTT розчину додавали в темне середовище та інкубували в інкубаторі. Через 4 год до кожної лунки додавали супернатант, додавали 100 мкл диметилсульфоксиду, а клітини струшували в постійному температурному шейкері при 37 градусах протягом 10 хв. Значення оптичної щільності (OD) на довжині хвилі 490 нм було виявлено за допомогою маркера ферменту, і швидкість виживання клітин була обчислена.

 

1.2.4 Конструкція in vitro конструкція клітинної моделі NAFLD

Певну вагу пальмітинової кислоти (ПА) зважували і повністю розчиняли в певному об'ємі ізопропанолу для підготовки запасу запасу 100 ммоль/л PA, який потім розділили і зберігали в холодильнику -20 для подальшого використання. Розчин запасу ПА розводили до 100 мкмоль/л за допомогою повного культурального середовища, і додавали 1% альбуміну сироватки без жирної кислоти. Клітини інкубували при 37 градусах протягом 3 годин для підготовки індукційного розчину. Клітини HEPG2 у фазі логарифмічного росту переносили в блюдо з культурою клітин 3,5 см при відповідній щільності для культури протягом ночі, а потім для втручання використовували підготовлене індукційне розчин.

 

1.2.5 Акт втручання NAFLD in vitro клітинна модель виявлення Tg та фарбування нафти червоного кольору O

 

1.2.5.1 ТГ

Клітини HEPG2 у фазі логарифмічного росту були перенесені в блюдо з культури клітин на 3,5 см для культури відповідно до порожньої контрольної групи, модельної групи та групи втручання. Групу моделі індукували індукційним розчином 100 мкмоль/л ПА, а групу втручання ACT індукували індукційним розчином 100 мкмоль/л ПА і одночасно додавали 50 мкмоль/л. Час втручання становив 24 год. Gently remove the old culture medium, slowly wash the cell surface with pre-cooled PBS once, add 100 μL/dish of pre-cooled RIPA lysis solution, fully lyse on ice for 15 min, centrifuge at 4 degree and 12 000 r/min for 10 min, collect the supernatant, take 10 μL for enzymatic detection of TG level, take another 10 μL for protein content detection, detect TG according to the Інструкції з набору TG і, нарешті, виправте рівень TG на мг білка.

1.2.5.2 Масляний червоний O Фарбування

Клітини HEPG2 у фазі логарифмічного росту переносили на блюдо з культурою 3,5 см, покриту стерильним покривом для культури протягом ночі. 100 мкмоль/л ПА індукує клітини з утворенням ліпідних крапель. У той же час до втручання було додано 50 мкмоль/л для втручання.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double distilled water, and sealed, і сфотографувався під мікроскопом.

 

1.2.6 Спостереження імунофлуоресценції аутофагосом та ліпідними крапельками після лікування АКТ

Клітини HEPG2 у фазі логарифмічного росту переносили на блюдо з культурою 3,5 см, покриту стерильним покривом для культури протягом ночі. 1 0 0 мкмоль/л ПА використовували для індукції утворення ліпідних крапель у клітинах. У той же час, ACT був доданий для втручання протягом 24 год. The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed at room temperature for 10 min with 4% formaldehyde, permeabilized at room temperature for 15 min with a permeabilization buffer containing 0.1% saponin, blocked at room temperature for 1 h with goat serum, incubated at room temperature for 1 h with LC3-specific primary antibody, washed 3 times with PBS, and Додано з специфічним вторинним антитілом з міткою флуоресцентами, інкубованим при кімнатній температурі і подалі від світла протягом 1 години. Після інкубації антитіла слайди 3 рази промивали PBS, протиставляючи ліпідні краплі-зонди Bodypy 493/503 при кімнатній температурі протягом 10 хв, промивали PBS і запечатували протисвітлювальним ущільнювальним середовищем, висушеним повітрям у темряві, спостерігали за допомогою лазерного конфокального мікроскопа та записано. Була встановлена ​​порожня контрольна група, група лікування рапаміцину та група втручання ACT.

 

1.3 Статистичний аналіз

SPSS25. 0 Статистичне програмне забезпечення було використано для аналізу даних. Кількісні дані виражали як x ± s. Був використаний односторонній аналіз дисперсії та тесту LSD-T. С<0.05 was considered statistically significant.