Дослідження нейроендокринної імунної функції Cistanche Deserticola та її продуктів для приготування рисового вина на моделі щурів, індукованих глюкокортикоїдами-Ⅱ

3.2.4. Імуногістохімія

Апоптоз нейронів контролюється багатьма апоптотичними та антиапоптозними генами, головним чином геном Bax, що сприяє апоптозу, та антиапоптозними генами сімейства генів Bcl-2. Bcl-2 локалізується в реактивних органелах, що виробляють кисень, таких як мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум і ядерні мембрани. Bcl-2 мало впливає на вільні радикали кисню, але можезапобігає окислювальному пошкодженню клітин. Bax транспортується з цитоплазми до мітохондріальної мембрани, змінює структуру мітохондріальної мембрани та сприяє вивільненню цитохрому с та індукції апоптозу.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Спостерігалася експресія в цитоплазмі надниркових залоз білка Bax і Bcl-2. Фарбування показало всі жовті частинки. Порівняно з групою BC середня оптична щільність білка Bax у групі MC значно зросла (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

На малюнку 5(b) показано, що порівняно з групою BC середня оптична щільність білка Bcl-2 у групі MC значно зменшилася (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Білок каспаза-3 локалізований переважно в цитоплазмі в своїй початковій формі в нормальних тканинах і має низьку експресію. Позитивні сигнали блідо-жовті або коричнево-жовті. Порівняно з такою в групі BC, експресія каспази-3 в групі MC значно зросла (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

У нормальних тканинах експресія гена Fas була знижена, а позитивний сигнал для гібридизації in situ був коричнево-жовтим. Як показано на малюнку 5(d), порівняно з групою BC середня оптична щільність білка Fas у групі MC збільшилася (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Білок FasL розташований в основному в клітинній мембрані або цитоплазмі, і його позитивні сигнали мають коричневий колір. Порівняно з групою BC, середня оптична щільність гена FasL у групі MC значно зросла (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Результати показали, що CD і WCD можутьіндукують апоптоз у запальних клітинахі зменшити пошкодження надниркових залоз шляхом сприяння експресії білка FasL і зв’язування з білком Fas, активації білка каспази-3 і запуску каспазного каскаду. Ефект від групи WCD-HD був найкращим.

3.3. Визначення імунної функції

3.3.1. Індекс імунних органів

Порівняно з групою BC коефіцієнт тимуса та індекс селезінки групи MC значно знизилися (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Виявлення субгруп Т-лімфоцитів у периферичній крові

Відсоток клітин CD4+ у верхньому лівому квадранті та клітин CD8+ у правому нижньому квадранті в BC та кожній групі препарату був вищим, ніж у групі MC. Порівняно з групою BC, співвідношення CD4+ThCD8+ значно знизилося в групі MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Визначення рівня IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α та IFN-C у сироватці крові

На малюнку 8 показано, що порівняно з групою BC рівень IL-6, TNF- та IFN-c значно підвищився (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Результати експерименту зі спостереження за тканиною Lymus під мікроскопом

На рисунку 9 видно, що в групі РМЗ була присутня велика кількість лімфоцитів. Лімфоцити та ретикулоцити розташовувалися в центрі нещільно з розсіяними круглими або овальними тимоцитами. Не було некрозу, запальної клітинної інфільтрації та аномальних змін.

У групі МЦ виявлена ​​велика кількість тканини лімфоїдного некрозу з невпорядкованим розташуванням лімфоцитів і ретикулоцитів у центрі. Зникли круглі або овальні тимоцити, виявилася масивна клітинна дегенерація або некроз, запальна клітинна інфільтрація з аномальними патологічними змінами.

У групах CD морфологічні характеристики лімфоцитів нормалізувалися, а розташування центральних лімфоцитів і ретикулоцитів було майже нормальним. Круглі або овальні тимоцити відновилися, але залишилася невелика кількість дегенеративних або некротичних лімфоцитів та інфільтрованих запальних клітин.

У групах WCD та групі PC морфологічні характеристики лімфоцитів були краще відновлені. Лімфоцити і ретикулоцити в центрі були добре вирівняні, круглі або овальні тимоцити були майже нормальними, але залишилася невелика кількість інфільтрованих і дегенеративних лімфоцитів.

3.4. Експресія гена білка CaM

Значення RQ (мРНК CaM - мРНК актину) розглядалося для вивчення експресії мРНК CaM. RQ групи BC становив 1. Експресія мРНК CaM в гіпоталамусі в групі MC значно зросла (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Обговорення

Китайська фармакопея [2] зазначає, що CD і WCD можуть використовуватися в клініці як основні види відварів. Після приготування на пару з рисовим виномантивіковий і тонізуючий ефект нирок-янбули посилені. За допомогою UPLC-QqQ-MS ми виявили кількісні зміни в хімічній матеріальній базі під час процесу випарювання рисового вина. Іридоїдні глікозиди були нестабільними, і вміст цих глікозидів зменшувався, навіть ставши невизначеним. Змінювався також вміст фенілетанолглікозидів, що могло спричиняти зміни фармакодинаміки та клінічного ефекту.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Класичну модель дефіциту нирок-ян було відтворено шляхом підшкірної ін’єкції кортикостерону [19]. Передозування кортикостерону може пригнічувати секрецію CRH в гіпоталамусі. Тим часом секрет АКТГ також був пригнічений. Знижувався рівень гормону кори надниркових залоз, а отже, знижувалася функція ГПА-вісі. Гіпофункція осі HPA є загальною характеристикою дефіциту нирок-ян [20]. Потім у щурів спостерігаються явища «виснаження», і симптоми збігаються з клінічними симптомами дефіциту нирок-ян.

У групі MC рівень CRH, ACTH, T та CORT у сироватці крові щурів значно знизився (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Модулювання частки членів сімейства Bcl-2 є одним із основних механізмів, за допомогою якого FasThFasL опосередковує шлях рецептора смерті, а сімейство Bcl-2 регулює мітохондріальний шлях [21]. Інгібуючий апоптоз фактор Bcl-2 і фактори, що індукують апоптоз, такі як Bax, належать до родини Bcl-2 [22]. Клітинний апоптоз можна визначити відносним співвідношенням факторів, що інгібують апоптоз, і факторів, що індукують апоптоз [23]. Мітохондрії виконують функцію центральних контрольно-пропускних пунктів для багатьох форм апоптозу [24]. Це дослідження показало, що CD-MD і WCDs можуть вивести експресію Bax і збільшити Bcl-2 допокращує дефіцит нирок-ян. Fas є основним рецептором смерті, який індукує апоптоз шляхом зв’язування з лігандом Fas (FasL) [25]. Експресія Fas і FasL у групі MC зросла, тоді як ця експресія значно зросла в групі WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Дефіцит імунної функції є одним із важливих проявів недостатності нирок-ян [28]. У цьому дослідженні ми виявили, що індекс селезінки та тимуса групи WCD-MD значно відновився (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

Вісь HPA є найважливішою регуляторною системою, оскільки вона регулює секрецію глюкокортикоїдів та ендокринну систему для підтримки секреторної функції кори надниркових залоз [32]. Надмірна експресія CaM мРНК у тканині гіпоталамуса була пов’язана з дефіцитом ниркового ян. CD і WCD можуть блокувати кальцієві канали, пригнічувати експресію мРНК CaM у гіпоталамусі та зменшувати приплив кальцію, таким чином знижуючи активність комплексу Ca2+·CaM.

Формування дефіциту нирок-ян є хронічним процесом розвитку захворювання. Нирка більше не є суто анатомічною концепцією, а є загальним терміном для нейроендокринної системи імунітету та сечостатевої системи. Нейроендокринно-імунна (NEI) мережа є важливою інтегрованою регуляторною системою [33]. CD і WCD можуть регулювати функцію осі HPAT і покращувати відновлення дефіциту нирок-ян. Цей результат забезпечує експериментальну основу для клінічної профілактики та лікування дефіциту нирок-ян.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%