Структурна характеристика полісахариду Cistanche Deserticola та його захисного впливу на високу глюкозу, спричинену HK -2 травма клітини

1.2.5.8 Виявлення потенціалу мітохондріальної мембрани

HK -2 клітини були прищеплені в 6- свердловинних табличках і культивовані. Після відповідної стимуляції до групи було додано культуральне середовище у свердловині таблички 6-, а до групи під "1.2.5.6" було додано сильну позитивну контрольну групу (POS). Промийте один раз PBS, додайте 1 мл середовища клітинної культури та 1 мл JC -1 РОБОТИ РОБОТИ РОБОТУ РОБОТИ РЕГУЛЬНО Змішували і поміщали в інкубатор клітинної культури в темряві протягом 20 хв. Клітини двічі промивали за допомогою фарбування JC -1 буфером (1 ×), а зображення збирали за допомогою флуоресцентного мікроскопа.

 

 

 

 

Cistanche вигоди

 

1.2.5.9 HOECHST33258 Метод виявлення клітинного апоптозу

Слайди комірки були розміщені в 6- свердловинних табличках, а HK -2 клітини у фазі логарифмічного росту висівали в 6- свердловинних пластинках при щільності клітин 1 × 105 клітин/колодязь. Після відповідного втручання наркотиків для фарбування використовувався комплект фарбування HOECHST33258. Клітинний апоптоз був виявлений та збирали зображення за допомогою флуоресцентного мікроскопа.

 

1.2.5.10 Вестерн -блоттінг для виявлення

Експресію білків, пов'язаних із сигнальним шляхом TLR4/NF-κB, аналізували шляхом групування та лікування клітин відповідно до методу під "1.2.5.6". Після цього загальний білок у клітинах екстрагували відповідно до інструкцій набору для вилучення білка. Кількісне визначення білка проводили за допомогою методу кількісного визначення білка біцинхонінової кислоти (BCA), а білок денатурали та зберігали в холодильнику -20.
10% передача мембрани поліакриламідного гель-додецилсульфату (SDS-PAGE), полівініліден-фтор (PVDF), покладіть мембрану в буфер, що містить трис, tween -20
Клітини інкубували в сольовому розчині Tris за допомогою Tween -20 (TBST) камерою і блокували при кімнатній температурі. Первинні антитіла до TLR4, NF-κB P65, P-NF-κB P65 та -actin використовувалисьВиявити ниркову тканину(Антитіла розводили до розчину TBST при коефіцієнті об'єму 1: 2000) при 4 градусах протягом ночі. TBST
Мембрану розбавляли вторинним антитілом (антитіло та розчин TBST розбавляли при співвідношенні об'єму 1: 2000) і інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після промивання мембрани 3 рази за допомогою TBST додавали люмінесцентний реагент ECL, а експресію білка виявляли за допомогою гелевої візуалізації. Програмне забезпечення Image J використовувалося для аналізу значення протеїнового сірого масштабу, з -актином як внутрішнім посиланням.

1.3 Обробка даних

Для аналізу даних було використано SPSS 23. 0 та GraphPad Prism 6.01. Тест Shapiro-Wilk був використаний для перевірки нормальності зразкових даних, а тест Брауна або Бартлетт був використаний для перевірки однорідності дисперсії зразкових даних. Дані вимірювання з нормальним розподілом та однорідністю дисперсії були виражені як середнє ± стандартне відхилення. (x ± S) вказує на опис, односторонній ANOVA був використаний для тестування, а метод Даннета використовувався для парного порівняння, якщо статистично значущим.
Для Post Hoc парних порівнянь неоднакових відхилень використовували метод T3 Dunnett, з p <0. 0 5, що вказує на статистично значущу різницю, і p <0,01, що вказує на значну різницю між двома групами.

2 результати та аналіз

2.1 Визначення загального вмісту цукру, уронової кислоти та білка при CDP

Рівняння лінійної регресії вмісту полісахариду було: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Експеримент показав, що між 7 і 70 мкг/мл, між стандартною концентрацією глюкози (x) та значенням поглинання (y) існував хороша лінійна залежність. Обчислений відсоток вмісту полісахариду у вибірці становить: 81,02%.
Рівняння лінійної регресії стандартної уронової кислоти становить: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Експеримент показав, що між 20 і 100 мкг/мл спостерігався хороша лінійна залежність між стандартною концентрацією уронової кислоти (X) та значенням поглинання (Y). Вміст уронової кислоти у зразку становить: 4,43%.
Стандартне рівняння білкової лінійної регресії: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Експеримент показав, що між 20 і 1 00 мкг/мл, між стандартною концентрацією білка (x) та значенням поглинання (y) спостерігалася хороша лінійна залежність. Вміст білка в зразку становить: 4,00%.

 

2,2 Молекулярна вага Розподіл CDPS

Молекулярну масу CDP визначали за допомогою високоефективного виявлення колони з хроматографією гель -проникнення. З RT AS (X) та LGMP AS (Y) рівняння кривої калібрувальної кривої LGMP-RT було обчислено як: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0. 9956; Rt IS (x), lgmw IS (y), рівняння кривої калібрування LGMW-RT IS: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; Rt є (x), lgmn є (y), крива калібрування Lgmn-rt рівняння: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Виходячи з стандартної кривої, формула розрахунку отримується для обчислення молекулярної маси кожного зразка. Молекулярний масовий спектр зразка такий, а результати розрахунку показані в таблиці 2. Результати показали, що CDP мали кілька піків елюції, а молекулярна маса полісахаридів в основному розподілялася між 3 і 8 кДа, що було гетерогенним гетерополісацидом гетерогенної молекулярної маси. Як показано на малюнку 1.

 

 

2,3 Моносахаридна композиція CDPS

CDP аналізували за допомогою іонної хроматографії, а хроматограма показана на малюнку 2. Результати показали, що порівняно з часом утримання 16 моносахаридних стандартів, 5 моносахаридів було виявлено у CDPS. Порівнюючи спектри з стандартами моносахаридів, CDP в основному складалися з глюкози, галактози, рамнози, маннози та сахарози. , арабіноза. Молярне співвідношення 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0,0255: 0,0178. З молярного співвідношення видно, що CDP в основному складаються з глюкози, галактози та рамнози. Серед них глюкоза становить 73,405%, галактоза становить 5,381%, а Rhamnose становить 5,02%.

 

Примітка: Man.Mannose, Glc N.Glucosamine Hidrochloride, Rha.rhamnose, Glc-ua.glucuronic кислота, gal-ua.galacturonic кислота, гал-галактозамін гідрохлорид, glc.glucose, gal.galactose, xyl.xylose, ara. Арабіноза, фук.

2,4 інфрачервоний аналіз CDPS Фур'є

Пік поблизу 3246 см -1 викликається вібрацією гідроксильної групи ОН, піком поглинання поблизу 2900 см -1 -піком вібраційного вібрації, а піком поглинання при 1594 см -1 -c =}}} reaing vibration, що має вібрацію CDPS наявність уронової кислоти, 1374.31 см -1: цей пік поглинання може бути пов'язаний з вібрацією деформації СН, особливо в групах полісахаридів метилу (-Ch3) або метилену (-h 2-). Пік поглинання при 1018.38 см -1 може бути пов'язаний з розтягуванням вібрації зв'язку CO, яка зазвичай зустрічається в ефірних зв’язках або ефірних зв’язках полісахаридів. Три слабкі піки поглинання в діапазоні 1200-1000 см -1 вказують на наявність піранози в CDP. Піки поглинання при 870 та 930 см -1 вказують на те, що глікозидні зв’язки -типу можуть існувати в CDP. Див. Малюнок 3.

 

2.5 Токсичні ефекти CDP на нормальні клітини HK -2

У порівнянні з CON, через 24 години після введення, життєздатність клітин почала значно знижуватися після того, як концентрація CDPS досягла 1000 мкг/мл (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Обговорення та висновок

Полісахаридиє високомолекулярними полімерами, що складаються з понад 10 моносахаридів. Повідомлялося, що полісахариди маютьімуномодулюючі, антиоксидантні, протизапальні та гіпоглікемічні ефекти[15]. Як одна з головних фармакологічно активних речовин у Cistanche Deserticola, CDP мають значну лікарську цінність. Це дослідження попередньо охарактеризувало структуру CDP і виявило, що вони можуть покращити пошкодження клітин HK -2, індуковані високим цукровим середовищем.

 

Складна структура полісахаридів тісно пов'язана з їх біологічною активністю, серед яких тип та частка моносахаридів, відносна молекулярна маса полісахаридів та тип глікозидних зв’язків є ключовими факторами, що впливають на [16]. Помірна відносна молекулярна маса надає полісахаридам більш активні ділянки і може проявляти більш сильну біологічну активність.
Однак велика молекулярна маса підвищить трансмембранну резистентність, перешкоджає поглинанню полісахариду та вплине на активність. І навпаки, полісахариди мала молекулярна маса, можливо, не зможуть утворювати ефективні активні структури, що призводить до зниження активності [17]. Досліджуючи біологічну активність полісахаридів, необхідно всебічно розглянути моносахаридний склад, відносну молекулярну масу та тип глікозидної зв'язку [18]. У цьому дослідженні іонна хроматографія визначила, що CDP в основному складаються з глюкози, галактози та рамнози, що відповідає звіту Xu et al. [19]. Середні молекулярні ваги CDP, виміряні високопродуктивною рідкою гелевою хроматографією, становили відповідно 3444, 4198 та 8031 ​​кДа. Молекулярні ваги трьох полісахаридів Cistanche з чотирьох лікарських матеріалів типу цистанча, виміряних Yang et al. [20] були подібними. CDP можуть містити тип -глікозидні зв’язки, і можуть містити -глюкоза або -манноза. Полісахариди, що складаються з -глюкози або -манноза, легше розпізнаються за допомогою рецептора 4 (TLR4) або TLR2 [21].
DN - одне з найбільш серйозних мікросудинних ускладнень діабету, і його патогенез тісно пов'язаний з окислювальним стресом, мітохондріальною дисфункцією та апоптозом клітин [22]. У цьому дослідженні було досліджено захисний ефект CDP на високі клітини HK -2, регулюючи сигнальний шлях TLR4/NF-κB та його молекулярний механізм.

В умовах високих глюкози клітини HK -2 виявляють значний окислювальний стрес [23]. Дослідження виявили, що високий рівень цукру значно збільшує вироблення внутрішньоклітинної ROS. Ця надмірна кількість ROS може безпосередньо пошкодити клітинні мембранні ліпіди, що призводить до збільшення вмісту продукту перекисного окислення ліпідів MDA [24]. У той же час, активність SOD та GSH-PX, важливих антиоксидантних систем захисту, була значно знижена, що свідчить про те, що антиоксидантна здатність клітин сильно пошкоджена [25]. Цей дисбаланс у системі окислення-антиоксидування додатково сприяє експресії та активації TLR4 [26]. Попередні дослідження показали, що надмірний ROS може бути розпізнаний TLR4 як молекулярні моделі, пов'язані з небезпекою (DAMP), утворюючи позитивний цикл зворотного зв’язку [27]. У цьому дослідженні попередня обробка CDP значно знизила рівень ROS, підвищення активності SOD та GSH-PX та зниження вмісту MDA. Цей всебічний антиоксидантний ефект говорить про те, що CDP можуть регулювати окислювальні реакції на стрес через кілька цілей.
У сигнальному шляху TLR4/NF-κB активований TLR4 сприяє активації комплексу IKK шляхом набору білків адаптерів нижче за течією, що, в свою чергу, призводить до фосфорилювання та деградації IκB [28]. У цьому дослідженні спостерігається, що висока глюкоза значно підвищила рівень фосфорилювання IκB, що призводить до транслокації NF-κB p65 від цитоплазми до ядра. Дослідження показали, що ядерна транслокація p65 не тільки посилює окислювальний стрес, але й впливає на функцію мітохондрій [29].
Він спостерігався шляхом фарбування JC -1, що висока обробка глюкози спричинила значне зниження потенціалу мітохондріальної мембрани, показуючи перехід від червоної флуоресценції до зеленої флуоресценції, що свідчить про те, що градієнт протона між внутрішніми та зовнішніми мембранами мітохондрій був порушений. Мітохондріальна дисфункція ще більше посилює виробництво ROS, утворюючи порочний цикл [30]. Попередня обробка CDP може підтримувати стабільність потенціалу мітохондріальної мембрани, і цей захисний ефект може бути досягнутий шляхом інгібування експресії TLR4 та активації NF-κB.
Мітохондріальна дисфункція та стійкий окислювальний стрес в кінцевому рахунку призводять до апоптозу клітин [31]. Фарбування HOECHST виявило, що ядра клітин у групі лікування глюкози показали очевидні типові апоптотичні морфологічні зміни, такі як конденсація, конденсація та фрагментація [32]. Ці зміни тісно пов'язані з мітохондріальним опосередкованим внутрішнім шляхом апоптозу: втрата потенціалу мітохондріальної мембрани призводить до вивільнення цитохрому С, активації каскаду каспази та в кінцевому рахунку клітинного апоптозу [33]. Ядерна морфологія клітин у групі попередньої обробки CDPS в основному була нормальною, а фарбування було рівномірним, що дозволяє припустити, що CDP запобігали клітинному апоптозу, підтримуючи функцію мітохондрій та інгібуючи окислювальний стрес.
Підсумовуючи це, це дослідження систематично виявлено окислювальні показники стресу (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), мітохондріальна функція (jc -1) та клітинний апоптоз (Hoechst), поєднаний з TLR4/NF-κB-сигналізацією Ключові молекули, які висвітлюють механізм дії CDPS: CDP
По -перше, покращуючи антиоксидантну здатність клітин, знижуючи рівень ROS та зменшуючи активацію TLR4; По-друге, пригнічуючи експресію TLR4 та фосфорилювання IκB, блокуючи ядерну транслокацію NF-κB; Нарешті, шляхом поліпшення функції мітохондрій, інгібуючи клітинний апоптоз. Смерть, таким чином, відіграючи захисну роль проти ДН. Цей багатоцільовий синергетичний ефект змушує CDP показати хороші перспективи застосування в лікуванні ДН. У наступних дослідженнях структура полісахариду буде додатково визначатися рентгенівською дифракцією, ядерною магнітною резонансною спектроскопією та спектрометрією газової хроматографії. Крім того, середні результати молекулярної ваги показують, що CDP є неоднорідними полісахаридами. Далі ми відокремлюємо та очистимо однорідні полісахариди, виявляємо полісахаридну структуру та біологічну активність та уточнюємо взаємозв'язок структури-активності.