Структурний і функціональний аналіз поліморфізму -синуклеїнових фібрил. Частина 3

4.3. Штами Syn у зразках синуклеїнопатії людини

Структурні та функціональні відмінності, що спостерігаються в рекомбінантних штамах, можна перевірити шляхом ідентифікації та характеристики фібрил безпосередньо у зразках пацієнтів із синуклеїнопатією.

Рекомбінантні штами відносяться до мікробних видів, які були рекомбіновані на генетичному рівні. У цій сфері було досягнуто величезного прогресу, що надає нам багато можливостей. Водночас вчені постійно вивчають вплив рекомбінантних штамів на людину та навколишнє середовище. Результати досліджень останніх років показали, що рекомбінантні штами позитивно впливають на пам'ять людини.

Дослідження виявили, що рекомбінантні штами можуть впливати на когнітивні здібності та пам’ять людини, покращуючи метаболічну активність мікроорганізмів у кишечнику та збільшуючи корисну флору в кишечнику. Цей механізм зв’язку кишково-мозкової осі називається «кишково-мозкова взаємодія».

Зокрема, рекомбінантний штам може сприяти відновленню гематоенцефалічного бар’єру шляхом збільшення корисної флори в кишечнику, тим самим сприяючи нормальному функціонуванню мозку. Крім того, рекомбінантний штам зміг збільшити вивільнення дофаміну та нейропептидів, які є критичними для довготривалої пам’яті та навчання.

Тому вчені пропонують людям їсти більше продуктів, багатих пробіотиками та пребіотиками, таких як йогурт, кава та цільнозернові продукти. Крім того, люди також можуть доповнювати пробіотики в кишечнику, споживаючи деякі специфічні рекомбінантні штами, тим самим ще більше сприяючи ефекту взаємодії кишечника та мозку.

Підсумовуючи, існує позитивний зв’язок між рекомбінантними штамами та пам’яттю. Люди повинні вжити ефективних заходів для сприяння зв'язку між кишечником і мозком, тим самим покращуючи свою пам'ять і когнітивні здібності. Видно, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, Cistanche deserticola також може покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.

Клацніть знати добавки для покращення пам'яті

Перші докази штаму, отриманого з мозку, надійшли в результаті фундаментального дослідження, проведеного Prusineret al. [270], який продемонстрував, що мозкові екстракти з MSA передаються трансгенним мишам і клітинам, що призводить до великої кількості патології -Syn [270]. На відміну від цього, це не спостерігалося при використанні екстрактів мозку з PD, що свідчить про те, що штам, отриманий від PD, може відрізнятися від MSA [270].

Потім постає питання, що може змусити -Syn прийняти іншу конформацію в MSA або PD? In vitro різні умови розчину (наприклад, присутність або відсутність солі) призводять до появи фібрил з різними структурними та функціональними властивостями [29]. Подібним чином, -Syn також піддається впливу кількох мікрооточень in vivo, що впливає на його агрегацію [271].

Дофамінергічні нейрони при БП і олігодендроцити, уражені MSA, належать до різних ліній клітин і мають відмінне клітинне оточення. Лі та його співробітники продемонстрували, що різні внутрішньоклітинні середовища двох клітинних ліній сприяють утворенню штамів у MSA та PD [34]. -Syn-фібрили, отримані з GCI в олігодендроцитах (GCI- -Syn) і LB в нейронах (LB- -Syn) хворого мозку, суттєво відрізняються та виявляють чітку здатність до посіву [34].

Штам GCI- -Syn є високоефективним у посівній синагрегації порівняно з LB- -Syn, тим самим сприяючи агресивності MSA [34]. Агрегати -Syn також були виявлені в біологічних рідинах, таких як цереброспінальна рідина (СМР) і плазма пацієнтів з ХП [272,273]. - Агрегація Syn починається за роки до появи справжніх симптомів захворювання, і, таким чином, виявлення цих агрегатів на ранніх стадіях може дозволити ідентифікувати та охарактеризувати конкретний штам у цих рідинах.

У цьому контексті нещодавно було розроблено ампліфікацію агрегатів -Syn з екстрактів мозку пацієнтів із PD та MSA за допомогою методу циклічної ампліфікації неправильного згортання білка (PMCA). Ця методика передбачає ампліфікацію неправильно згорнутих білків in vitro, як ампліфікація ДНК методом ПЛР [274]. Він складається з чергування циклів інкубації та обробки ультразвуком, що призводить до реплікації амілоїду.

Спочатку слідову кількість амілоїду інкубують із надлишком нативного білка, щоб індукувати ріст полімеру. Потім зразок суміші піддається ультразвуковій обробці, яка руйнує фібрили, у результаті чого утворюється кілька ядер.

Кожне новоутворене ядро ​​тоді діятиме як зародок у наступному циклі та далі стимулюватиме ріст фібрил. Таким чином, після кожного циклу кількість насінин зростатиме експоненціально, що дозволить виявити найменшу кількість неправильно згорнутих агрегатів, присутніх на початку [274]. Сото та його співробітники використовували PMCA для ампліфікації агрегатів -Syn із спинномозкової рідини пацієнтів з діагнозом PD та MSA [52].

Вони виявили, що фібрили, отримані з PD та MSA, демонструють різні біофізичні та біохімічні властивості та відповідають різним конформаційним штамам -Syn [52]. Було показано, що навіть агрегати -Syn, ампліфіковані з гомогенатів головного мозку PD і MSA, проявляють різну токсичність і нейродегенерацію в дофамінергічних нейронах людини, що відображає різну тяжкість захворювання, що спостерігається у пацієнтів з PD і MSA через різні штами -Syn [275].

Ці результати переконливо свідчать про те, що синуклеїнопатії можна розрізнити на основі типу штаму -Syn, присутнього в мозку. Однак складність у виявленні агрегатів виникає, коли в одному захворюванні спостерігається гетерогенність від пацієнта до пацієнта. Ця гетерогенність в агрегатах -Syn, ампліфікованих з екстрактів мозку пацієнтів із ХП, більша, ніж у екстрактах мозку MSA [276].

Строхакер та ін. повідомили, що фібрили, отримані з PD і MSA, не виявляють помітно відмінних структурних властивостей [276], на відміну від результатів, про які повідомили Soto та його співробітники [52].

Можливою причиною протилежних спостережень можуть бути відмінності в протоколах PMCA, які використовуються двома групами [277]. Крім того, Strohaker et al. використовували набагато менший обсяг вибірки, ніж група Сото [52,276]. Інші фактори, такі як генетичне походження пацієнтів, вік відібраних пацієнтів, навантаження агрегатів -Syn у різних пацієнтів, присутність інших компонентів в екстрактах і область мозку, звідки проводилася екстракція, також можуть бути відповідальність за ці відмінності [276].

Подібні протиріччя існують і в області патології БА. Нещодавно отримані дані про зразки тау-тау, отримані з мозку, свідчать про те, що гетерогенність конформацій тау-фібрил від пацієнта до пацієнта існує в межах однієї хвороби, AD [278]. Однак Goedert та його колеги спостерігали однаковий тип конформації oftau у всіх проаналізованих на даний момент випадках AD, припускаючи, що фібрили тау від одного захворювання (наприклад, AD або хвороби Піка) приймають загальну структурну складку [218,219].

Хоча причини та фактори, які обумовлюють цю структурну специфічність при тауопатіях, неясні, це може бути пов’язано з кількома ізоформами тау, PTM, взаємодією з іншими білковими молекулами, кофакторами тощо.

Нещодавно Шерес і Годерт представили ієрархічну класифікацію тауфібрил з різних тауопатій на основі складок їхніх ниток [279]. Чи існує подібна класифікація для фібрил -Syn, виділених із зразків синуклеїнопатії, ще належить визначити. Нещодавно були докладені великі зусилля для визначення структури -Synder, отриманого з людського мозку Schweighauser та ін., використовуючи Cryo-EM [280].

Група виявила, що філаменти -Syn з мозку пацієнтів з DLB не скручуються та є тоншими, ніж ті, що походять з мозку пацієнтів із MSA [280], що узгоджується з попередніми висновками [3]. Відсутність скручувань у фібрилах, отриманих від DLB, перешкоджає визначенню 3D-структури за допомогою кріо-ЕМ, і відмінності у фібрилах -Syn, отриманих у пацієнтів з MSA та DLB, були виведені на основі двовимірного усереднення класу [280].

Хоча нам потрібно більше структур високої роздільної здатності, отриманих від пацієнтів із синуклеїнопатією, щоб дійти певного висновку, ці звіти, безумовно, підкріплюють твердження щодо існування різних типів фібрил -Syn.

Крім того, структури філаментів -Syn у випадках БП поки що недоступні, але їх розв’язання в майбутньому може значно допомогти зрозуміти механізм захворювання та створити терапевтичні підходи проти синуклеїнопатій.

5. Структурні моделі високої роздільної здатності існуючих штамів -Syn фібрил

Досі використовувалися різні біофізичні методи, такі як ssNMR, мікроелектронна дифракція, EPR, круговий дихроїзм (CD), воднево-дейтерієвий обмінний ЯМР (HDXNMR) і кріо-ЕМ, щоб визначити структуру -Syn фібрил з різною роздільною здатністю.

Ці методи заклали основу поліморфізму фібрил на молекулярному рівні. Листова структура серцевини фібрили за допомогою ssNMR виявила дві фібрили, форму A та форму B, шляхом послідовного віднесення 48 залишків серцевини [56].

Дослідження виявило наявність двох поліморфів фібрил, які могли утворитися внаслідок різних механізмів фібриляції [56]. Подібним чином, дві контрастні фібрильні структури, «стрічки» та «фібрили», створені in vitro, показали відмінності в довжині, розподілі та кількості елементів -листів у їхній фібрильній структурі, проаналізованій ssNMR [29].

Однак, незважаючи на кілька спроб, як поліморфи фібрил -Syn відрізняються за атомною структурою, залишається в основному невідомим. Революція в структурному поліморфізмі відбулася після того, як структуру фібрили -Syn було розкрито за допомогою кріо-ЕМ на атомарному рівні. Штальберг і група виявили, що фібрили -Syn (залишки 1–121) складаються з двох ідентичних протофіламентів [61].

Листи з кожного протофіламента взаємодіють і стабілізують структуру через гідрофобну геометрію блискавки [61]. Примітно, що залишки 50–57, розташовані на межі протофіламентів, також є місцем сімейних мутантів PD (A53T/V/E), H50Q і G51D [61]. У зв'язку з цим було передбачено, що ці мутації можуть змінити фібрилярну структуру, що призведе до різних типів фібрил.

Подальші кріо-ЕМ дослідження структури повнорозмірного -Syn показали різницю в хіральності та спіральному скручуванні [281] порівняно з C-кінцевою усіченою фібрильною структурою -Syn (залишки 1–121) [61]. Вважалося, що ці відмінності в структурах повнорозмірних (1–140) і усічених на С-кінці фібрил можуть бути наслідком поліморфізму фібрил.

Прямий доказ цих теорій було отримано в результаті нещодавніх плідних досліджень, які використовували кріо-ЕМ для окреслення моделей поліморфів фібрил -Syn. Лі та ін. ідентифікували два поліморфи фібрил, «стрижень» і «твістер», зі спільною структурою ядра протофіламенту, але різними інтерфейсами між протофіламентами [57]. Поліморфи Twister демонструють упорядкований зігнутий- -архмотив, тоді як стрижневі поліморфи рекрутують деякі додаткові залишки для формування мотиву «грецького ключа», як повідомляють також інші групи [55,61,281].

Існування поліморфів у стрижневих і твістерних форм свідчить про те, що відмінності в упаковці однієї і тієї ж структури ядра можуть призвести до поліморфізму. Подібні спостереження також були зроблені для інших амілоїдних білків, таких як -амілоїд і тау, де протофіламенти з однаковою структурою ядра, але різною схемою упаковки призводять до поліморфних структур [40,282].

Крім того, дві нові поліморфні форми -Syn фібрил, створені in vitro, названі поліморфами 2a та 2b, відповідно, відрізняються від раніше зареєстрованих поліморфів 1a та 1b [57,61,281]. У поліморфі 1a [61] взаємодії між залишками на Інтерфейс протофіламентів опосередковується утворенням гідрофобної стерично-блискавкової геометрії, тоді як у поліморфах 2a і 2b вони опосередковуються сольовими містками [41,61].

Більш детальний аналіз структурних відмінностей між поліморфами 1a/1b і новими поліморфами 2a/2b виявив подальші відмінності в розташуванні мотивів арки, які змінюють поверхню протофіламентів між поліморфами 1 і 2 [41].

Ці дослідження підкріплюють гіпотезу про те, що той самий білок-попередник -Syn може збиратися в кілька поліморфів фібрил in vitro, які радикально відрізняються один від одного з точки зору атомної роздільності. Годерт і його колеги нещодавно досліджували кріо-ЕМ структури тау-фібрил, отриманих від хвороб Альцгеймера та Піка мозок пацієнтів [40,218,219].

Вони виявили чіткі складки ниток тау при обох захворюваннях, що вказує на існування різних конформерів тау при різних тауопатіях. Та ж група повідомила про два типи філаментів -Syn, типу I та типу II, з мозку людей, які страждають на MSA [280]. Вони виявили, що кожна нитка складається з двох неідентичних протофіламентів.

Порожнина, утворена щільною упаковкою протофіламентів, містить додаткові молекули, які ще належить визначити [280]. Усереднення класу 2D також виявило різні фібрили у пацієнтів з MSA та DLB, що свідчить про існування різних конформерів, пов’язаних із синуклеїнопатією.

Крім того, було б цікаво запитати, чи фібрили, отримані пацієнтом, демонструють будь-який рівень схожості з фібрилами, створеними in vitro. Характеристика на молекулярному рівні та порівняння зразків фібрил, отриманих із мозку, з фібрилами, створеними in vitro, виявили, що ці дві структурно відрізняються [276,280]. Основна відмінність між філаментами, отриманими з MSA, і синтетичними, полягає в розмірі та упаковці протофіламентів у фібрилах MSA [280].

Крім того, дослідники використовують суворі умови для генерування та ізоляції синтетичних волокон, такі як перемішування, концентрація солі тощо, які впливають на упаковку та розміщення листів ниток [10,283–285]. Як наслідок, стає важко співвіднести результати in vitro зі сценаріями in vivo.

З іншого боку, можна лише отримати попередньо сформовані фібрили зі зразків, екстрагованих хворобою, але можна не зрозуміти, як вони виникли та які фактори керували формуванням різних фібрил у різних зразках мозку. Важко виділити тимчасові токсичні види або проміжні продукти із зразків мозку, щоб зрозуміти патогенез захворювання.

Отже, нам потрібно покладатися на зразки in vitro, щоб окреслити механізми формування фібрилів, шляхи та аналіз кінетики. Подібним чином ми повинні перевірити те саме, використовуючи фібрили, отримані з мозку, щоб розробити більш широку базу знань. Загалом, структури високої роздільної здатності поліморфів -Syn можуть допомогти дослідникам у пошуках потенційних терапевтичних цілей.

Однак потрібне ретельне дослідження, щоб зрозуміти вплив клітинних умов, мутацій, PTM, наявності кофакторів тощо на структуру фібрил -Syn і зв’язок різних поліморфів фібрил із клінічною варіабельністю, що спостерігається при хворобі хвороби.

6. Сімейні мутації -Syn утворюють різні конформації фібрил

- Синолігомеризація та агрегація пов'язані з патогенезом БП. На сьогоднішній день у гені SNCA виявлено сім сімейних місенс-мутацій, пов’язаних із раннім і пізнім початком хвороби БП [83–90].

Серед цих пов’язаних з PD мутацій E46K, H50Q, A53T і нещодавно виявлені мутанти A53V прискорюють швидкість агрегації -Syn, тоді як мутації A30P, G51D і A53E сповільнюють кінетику агрегації in vitro [91,93,96]. зв'язок між швидкістю агрегації (in vitro) і віком початку захворювання (in vivo) не є прямим [103].

Хоча олігомери, утворені на ранніх стадіях кінетики агрегації, є потенційно токсичними [286], лише A30P демонструє швидшу олігомеризацію та сповільнене перетворення олігомерів у фібрили [102]. G51D, з іншого боку, демонструє повільну олігомеризацію та повільне утворення фібрил [287, 288], але це пов’язано з раннім початком захворювання.

Через таку складність у поведінці сімейних мутантів важко встановити об’єднуючий механізм, за допомогою якого вони викликають хворобу. У попередніх звітах було припущено, що -Syn приймає спіральну структуру після зв’язування з мембранами in vivo [289,290].

Будь-яка зміна однієї амінокислоти в N-кінцевому домені -Syn може змінити здатність зв'язувати мембрану та збільшити цитозольну концентрацію білка шляхом сприяння швидшій агрегації [291, 292]. Дані щодо зв’язування з мембраною сімейних мутантів -Syn з нашої лабораторії [92] та інших [110,288,292,293] показали, що мутанти H50Q, A53T і E46K демонструють підвищене зв’язування з мембраною, тоді як мутанти A53E, G51D і A30P демонструють знижене зв’язування з мембраною.

Це свідчить про те, що, подібно до агрегації, здатність до зв'язування мембрани не корелює з підвищеною схильністю до захворювань через сімейні мутації -Syn. Таким чином, існує відсутність кореляції між агрегацією та здатністю зв’язувати мембрану з фактичним патогенезом захворювання, викликаного сімейними мутантами -Syn.

Це піднімає питання про те, як точкова мутація в нативно неструктурованому білку демонструє різкі відмінності у виникненні та прогресуванні захворювання. Ми вважаємо можливим, що різні мутанти -Syn продукують різні типи та кількості олігомерів, а також можуть однозначно змінювати здатність до засівання білка дикого типу [103].

Ось чому мутанти впливають не лише на загальну швидкість агрегації білка, але й на мікроскопічні етапи утворення амілоїду, тобто на ініціацію та ампліфікацію -Syn через вторинний процес нуклеації [294]. Цікаво, що Lazaro et al. виявили, що, незважаючи на однакову схильність до олігомеризації в культивованих клітинах, A30P, E46K, H50Q, G51D і A53T виявляють відмінну здатність до утворення включень [295]. A30P продемонстрував знижену схильність до утворення включень у клітинах, тоді як мутанти E46K і G51D показали протилежний ефект [295].

Знову ж таки, утворення включень у клітинах [295] не корелювало зі схильністю до агрегації мутантів in vitro [12,91–93,102]. Таким чином, вирішення цих питань про те, як дикий тип -Syn та його мутанти сприяють ранньому та пізньому виникненню БП, стає важливим для розуміння диференціального патогенезу синуклеїнопатій.

Утворення фібрил дуже чутливе до змін у локальному та/або глобальному мікрооточенні білка. Це свідчить про те, що зміна однієї амінокислоти може призвести до поліморфізму через різну конформаційну динаміку, специфічну для сайтів, як показано для дикого типу та фібрил E46K, A30P та A53T [296]. У цьому контексті Ноулз і його колеги нещодавно вивчали систематичне порівняння -Syn і його асоційованих із захворюванням мутантів за допомогою біофізичних методів [297]. Мутанти PD генерують поліморфи фібрил із відмінною морфологією та вторинними структурами порівняно з білком дикого типу [297].

Дійсно, кілька звітів незалежно підтвердили, що різні мутанти -Syn утворюють фібрили з характерною морфологією, виявленою за допомогою досліджень трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) і атомно-силової мікроскопії (АСМ), унікальних рентгенівських дифракційних картин (XRD) і відмінностей в елементах вторинної структури (рис. 4A, B).

Крім того, поверхня двох протофіламентів у структурі фібрили -Syn утворена залишками 50–57, які також містять три сімейні мутації [61]. Це свідчить про те, що навіть одноточкова мутація може змінити динаміку та упаковку протофіламентів.

Уважніше дослідження фібрил, утворених мутантами за допомогою кріо-ЕМ [298–300], виявило пластичність таких фібрил з точки зору скручувань, кількості взаємодіючих протофіламентів, розташування упаковок, елементів вторинної структури та четвертинної форми тощо (рис. 4C, D). Боєр і його група вивчали мутанти H50Q і знайшли вузькі (1c) і широкі фібрили (1d) з одним або двома протофіламентами відповідно [300].

Незважаючи на спільну структуру збереженого ядра, про яку повідомлялося раніше для -Syn дикого типу, мутантні фібрили демонструють нове розташування протофіламентів і мережі водневих зв'язків [300]. Крім того, A53 знаходиться в центрі межі взаємодіючих протофіламентів у -Syn дикого типу [61], а також є гарячою точкою для багатьох точкових мутацій [16,89,90].

Дослідження Cryo-EM з N-кінцевим ацетильованим мутантом A53T не виявили змін у складці -Syn дикого типу [299]. Однак мутація порушує взаємодію залишків і змінює орієнтацію інтерфейсу протофіламента, що призводить до іншої тип фібрил [299]. Це також може бути у випадку двох інших мутацій A53, тобто A53E та A53V, але цю можливість ще належить відкрити.

Кріо-ЕМ моделювання фібрил, утворених мутацією E46K, також підтвердило переважаючу гіпотезу. Він виявив утворення поліморфів фібрил із чітким упакуванням протофіламентів та інтерфейсами порівняно з -Syn дикого типу [298, 301]. Крім того, він утворив більш стабільний і патогенний варіант -Syn дикого типу [298]. Загалом, ці дослідження свідчать про те, що упаковка протофіламентів і межа розділу є критичними у визначенні структури фібрил.

Кожна сімейна мутація може вести себе як штам -Syn, унікальним чином змінюючи структуру та динаміку результуючих фібрил. Ці відмінності в структурі фібрил можуть призводити до різних клінічних і патологічних результатів, тим самим сприяючи гетерогенності захворювання при синуклеїнопатіях.

For more information:1950477648nn@gmail.com