Спайк і Nsp6 є ключовими детермінантами ослаблення SARS-CoV-2 Omicron BA.1

Варіант SARS-CoV-2 Omicron є більш несприйнятливим до імунітету та менш вірулентним, ніж інші основні варіанти вірусу, які наразі визнані1–12. Головним рушієм цих фенотипів вважається білок Omicron spike (S), який має надзвичайно велику кількість мутацій. Тут ми створили химерний рекомбінантний SARS-CoV-2, що кодує S-ген Omicron (рядок BA.1) в основі предкового ізоляту SARS-CoV-2, і порівняли цей вірус із природним циркулюючим Omicron варіант. Вірус, що містить Omicron S, надійно уникнув гуморального імунітету, індукованого вакциною, головним чином через мутації в мотиві зв’язування рецепторів; однак, на відміну від природного Omicron, він ефективно реплікується в клітинних лініях і первинно-подібних дистальних клітинах легень. Подібним чином у мишей K18-hACE2, хоча вірусоносій Omicron S викликав менш серйозні захворювання, ніж предковий вірус, його вірулентність не була послаблена до рівня Omicron. Подальше дослідження показало, що мутації неструктурного білка 6 (nsp6) на додаток до білка S було достатньо для повторення ослабленого фенотипу Omicron. Це вказує на те, що, незважаючи на те, що втеча вакцини «Омікрон» зумовлена ​​мутаціями в S, патогенність «Омікрону» визначається мутаціями як у білку S, так і поза ним.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Станом на грудень 2022 року послідовні хвилі пандемії COVID-19 були спричинені п’ятьма основними варіантами SARS-CoV-2, відомими як варіанти, що викликають занепокоєння (VOC): Альфа (B.1.1.7) , Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2 і лінії AY) і Omicron (лінії BA)13. Омікрон — нещодавно визнаний ЛОС, який вперше був задокументований у Південній Африці, Ботсвані та мандрівником із Південної Африки в Гонконгу в листопаді 2021 року (ідентифікатор GISAID: EPI_ISL_7605742)14, 15. Він швидко поширився по всьому світу, витіснивши раніше домінуючий варіант Дельта за кілька тижнів і припадаючи на більшість нових інфекцій SARS-CoV-2 до січня 2022 року (посилання 16–18). На даний момент ідентифіковано принаймні п’ять ліній Omicron: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4 і BA.5. BA.1 (далі – Омікрон) демонструє чудову втечу від гуморального імунітету, спричиненого інфекцією та вакциною3,19. Крім того, він є менш вірулентним, ніж інші леткі органічні сполуки у людей та моделі інфекції in vivo4,5,7,11,12,20. Омікрон відрізняється від прототипу ізоляту SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 59 амінокислотами; 37 із цих змін стосуються білка S, що підвищує ймовірність того, що S лежить в основі патогенної та антигенної поведінки Omicron.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

S-мутації впливають на реплікацію Omicron у культурі клітин

Білок Omicron S містить 30 амінокислотні заміни, 6 делецій і одну вставку з 3 амінокислот завдовжки порівняно з Wuhan-Hu-1 (розширені дані, рис. 1). Двадцять п’ять із цих змін є унікальними для Omicron порівняно з іншими леткими органічними сполуками, хоча деякі з них були зареєстровані у стічних водах і незначних варіантах SARS-CoV-221,22. Щоб перевірити роль білка S у фенотипі Omicron, ми створили химерний рекомбінантний вірус, що містить ген S Omicron (USA-lh01/2021) та всі інші гени предків SARS-CoV-2 (GISAID EPI{ {16}}ISL_2732373)23 (розширені дані, рис. 2а). Цей химерний вірус, названий Omi-S, був створений за допомогою модифікованої форми циркулярної полімеразної реакції подовження (CPER)24 (Розширені дані, рис. 2b), яка давала висококонцентровані запаси вірусу, що містили 0,5 × 106 –5 × 106 бляшкоутворюючих одиниць (PFU) на мл, з трансфікованих клітин протягом двох днів після трансфекції (Розширені дані, рис. 2c,d), уникаючи необхідності подальшої ампліфікації вірусу.

Рис. 1|Вплив S на кінетику росту in vitro Omicron. Схема вірусів. S, шип; N, нуклеокапсид. b–e, клітини ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (b,d) і клітини Vero E6 (c,e) були інфіковані при MOI 0.01, і відсоток N-позитивних клітин (n=6 реплікатів) (b,c) і вивільнення інфекційних частинок (n=3 реплікатів) (d,e) визначали за допомогою проточної цитометрії та аналізу бляшок, відповідно. f, клітини ACE2/TMPRSS2/Caco-2 були інфіковані сумішшю вірусів у співвідношенні 1:1, щоб отримати кінцевий MOI 0.005 для кожного вірусу . Клітини фіксували в зазначений час і піддавали проточній цитометрії. Ліворуч, характерна точкова діаграма; праворуч, відсоток неінфікованих, Omi-S/mCherry-інфікованих, Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG)-інфікованих і подвійно інфікованих клітин. Для компенсації використовували поодинокі інфіковані клітини. Смуги похибок, середнє ± стандартне відхилення (n {{20}} повторень). g, Розміри бляшок. Зліва, типові зображення бляшок на клітинах ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Справа, діаметр бляшок зображено як середнє значення ± sd для 20 бляшок на вірус. h, епітеліальні клітини iAT2 людини були інфіковані при MOI 2,5 протягом 48 годин або 96 годин. Апікальну сторону клітин промивали 1× забуференим фосфатом фізіологічним розчином (PBS) і вимірювали рівні інфекційних вірусних частинок за допомогою аналізу бляшок. Смуги похибок, середнє ± sd (n=4 повторів). Експерименти повторювали двічі, причому кожне експериментальне повторення містило 3 (b–g) або 4 (h) повтори. Значення P обчислювали за допомогою двостороннього непарного t-критерію з поправкою Велча. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 і ****P <0,0001; NS, не істотно. Стратегія стробування для проточної цитометрії показана на Додатковому рисунку 1.

Спочатку ми порівняли ефективність інфікування Omi-S із предковим вірусом, що містить D614G (GISAID EPI_ISL_2732373; створений CPER; надалі – дикий тип (WT)) та ізолятом Omicron (США-lh01/2021) у культурі клітин (рис. 1а). Для цього ми інфікували клітини ACE2- і TMPRSS2-, що експресують Caco-2 (далі ACE2/TMPRSS2/Caco-2) і Vero E6, Omi-S, WT і Омікрон із множинністю інфікування (MOI) 0,01, а також моніторинг поширення вірусу за допомогою проточної цитометрії та аналізу утворення бляшок. Вірус WT і Omi-S швидко поширювалися в клітинах ACE2/TMPRSS2/Caco-2, утворюючи 89% і 80% інфікованих клітин відповідно через 24 години після зараження (HPI) (рис. 1b). Навпаки, Omicron розмножувався повільніше, що призвело до 48% інфікованих клітин на 24 hpi. Подібна картина спостерігалася в клітинах Vero E6, у яких 60% і 41% клітин були позитивними для WT і Omi-S, відповідно, при 48 hpi, на відміну від 10% для Omicron (рис. 1c). Аналіз нальоту показав, що хоча і Omi-S, і Omicron виробляють нижчі рівні інфекційних вірусних частинок порівняно з WT, вірусний титр Omi-S був значно вищим, ніж титр Omicron. У клітинах ACE2/TMPRSS2/Caco-2 Omi-S виробляв 5.1-разів (P=0.0006) і 5.5-разів (P {{49} }.0312) більше інфекційних частинок, ніж Омікрон на 12 hpi і 24 hpi відповідно (рис. 1d). Так само в клітинах Vero E6 титри інфекційного вірусу Omi-S були 17-рази (P=0.0080) і 11-рази (P=0.0078) вищими ніж у Omicron на 24 hpi та 48 hpi відповідно (рис. 1e). Різниця між вірусами стала менш очевидною в більш пізні моменти часу через вищу цитотоксичність, спричинену Omi-S порівняно з Omicron (розширені дані, рис. 3a). Підвищена ефективність реплікації Omi-S порівняно з Omicron була збережена під час тестування з різними MOI (розширені дані, рис. 3b). Крім того, ми підтвердили перевагу Omi-S у придатності перед Omicron методом прямого конкурентного аналізу. Для цього ми спершу створили рекомбінантний Омікрон (мікрон), який у наших аналізах культури клітин імітував кінетику реплікації природного Омікрону (розширені дані, рис. 4). Потім ми створили Omi-S, що містить mCherry, і Omicron, що містить mNeonGreen, і інокулювали клітини ACE2/TMPRSS2/Caco-2 цими вірусами, змішаними у співвідношенні 1:1. Проточний цитометричний аналіз інфікованих клітин у різні періоди інфікування показав, що Omi-S/mCherry явно перевершує Omicron/mNeonGreen з точки зору реплікації (рис. 1f). Нарешті, більш висока інфекційна ефективність Omi-S також відображалася на розмірі бляшки; хоча вірус WT утворював найбільші бляшки (приблизно 4,1 мм), розмір бляшок Omi-S (приблизно 2,2 мм) був у два рази (P <0,0001) більшим, ніж у бляшок Omicron (приблизно 1,1 мм) (рис. 1g). Ці результати вказують на те, що хоча мутації в білку S впливають на ефективність інфікування Omicron, вони не повністю пояснюють фенотип Omicron.

Кілька доказів свідчать про те, що білок S, включений в Omi-S, поводився так само, як і в природному Omicron. Наприклад, як описано раніше20,25, Omicron S погано розщеплюється порівняно з WT S; тоді як 71% S у віріонах WT був у розщепленій формі, лише 45% та 47% було розщеплено в Omi-S та Omicron відповідно (розширені дані, рис. 5a). Такий самий патерн розщеплення S був очевидний в клітинах, інфікованих вірусом (WT, 63% розщеплено; Omi-S, 33% розщеплене; Omicron, 42% розщеплене) (розширені дані, рис. 5b). Ці експерименти також показали, що Omicron S неефективно вбудовувався у вірусні частинки порівняно з WT S (співвідношення S до нуклеокапсиду (N): 3,40 для вірусу WT, 1,91 для Omi-S і 2,04 для Omicron) (розширені дані, рис. 5а). Подібним чином і Omi-S, і Omicron виробляли менший синцитій порівняно з вірусом WT, спостереження, про яке раніше повідомлялося для Omicron20,26 (розширені дані, рис. 5c). Нарешті, згідно з опублікованою літературою25, Omi-S і Omicron показали перевагу проникненню, опосередкованому катепсином, що відображено в їх вищій чутливості до інгібітора катепсину E64d (розширені дані, рис. 6). Потім ми порівняли кінетику реплікації WT, Omi-S і Omicron в епітеліальних клітинах легень, які утворюють основне місце реплікації вірусу у пацієнтів з COVID-19 (посилання 27, 28). Відповідно, ми використовували індуковані людиною плюрипотентні стовбурові (iPS) клітини легеневого альвеолярного епітелію типу 2 (iAT2). Клітини AT2 представляють важливу популяцію клітин дистального відділу легенів і є однією з основних мішеней інфекції SARS-CoV-228,29. Ми інфікували клітини iAT2, вирощені як культура інтерфейсу повітря і рідини (ALI), з MOI 2,5 і спостерігали за секрецією вірусного потомства на апікальній стороні клітин при 48 hpi і 96 hp. У відповідності з результатами, отриманими з клітинних ліній, вірус WT продукував найвищі рівні інфекційних вірусних частинок (рис. 1h). Серед Omi-S і Omicron перший дав приблизно в п’ять разів (P=0.0008) вищий титр інфекційного вірусу при 48 к.с. Вірусні титри для WT і Omi-S знизилися на 96 dpi порівняно з 48 hp через цитопатичний ефект (CPE) інфекції. Однак CPE не було виявлено для Omicron, що призвело до стійкого виробництва інфекційних віріонів. Загалом ці результати підтверджують висновок про те, що мутації в S не повністю пояснюють ослаблену реплікаційну здатність Omicron у культурі клітин.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Мінімальна роль S у патогенності Omicron у мишей

Щоб перевірити, чи Omi-S демонструє вищу пристосованість in vivo порівняно з Omicron, ми дослідили результати інфікування Omi-S відносно WT SARS-CoV-2 і Omicron у мишей K18-hACE2. Згідно з опублікованою літературою4,5, інтраназальна інокуляція мишам (віком 12–20 тижнів) Омікроном (104 БІЙ на мишу) не спричинила значної втрати ваги, тоді як інокуляція вірусом WT викликала швидке зниження маси тіла у всіх мишей. втрачаючи понад 20% своєї початкової маси тіла до 8 днів після інфікування (dpi) (рис. 2а). Примітно, що 80% мишей, інфікованих Omi-S, також втратили понад 20% маси тіла на 9 dpi (рис. 2а та розширені дані, рис. 7а). Оцінка клінічних балів (сукупна міра втрати ваги, аномального дихання, ненормального вигляду, зниженої чутливості та зміненої поведінки) також виявила подібну картину; у той час як миші, інфіковані Омікроном, демонстрували невеликі ознаки клінічних захворювань або взагалі їх не мали, стан здоров’я інфікованих WT та Omi-S швидко погіршувався, а вірус WT викликав більш важке захворювання (P=0.0102) (рис. 2b і розширені дані рис. 7b). Оскільки SARS-CoV-2 викликає смертельну інфекцію у мишей K18-hACE24, ми порівняли виживаність мишей після вірусної інфекції. Відповідно до результатів втрати маси тіла та клінічної оцінки, WT і Omi-S призвели до смертності 100% (6/6) і 80% (8/10), відповідно. Навпаки, усі миші, заражені Omicron, вижили (рис. 2c). Ці висновки, які узгоджуються з нещодавньою публікацією30, вказують на те, що білок S не є виключним фактором, що визначає патогенність Omicron у мишей K18-hACE2.

Далі ми порівняли розповсюдження Omi-S з Omicron і WT SARS-CoV-2 у легенях і носових раковинах мишей K18-hACE2. Мишам (віком 12–20 тижнів) інтраназально вводили 104 PFU (сім мишей на вірус), а титри вірусу в легенях мишей вимірювали при 2 і 4 dpi. Згідно з даними in vitro, титр інфекційного вірусу в легенях WT-інфікованих мишей був вищим, ніж у мишей, інфікованих двома іншими вірусами (рис. 2d). Примітно, однак, миші, інфіковані Omi-S, виробляли 30-рази (P=0.0286) більше інфекційних вірусних частинок порівняно з мишами, інфікованими Omicron, при 2 dpi. Титр знизився на 4 dpi для WT- і Omi-S-інфікованих мишей, але продемонстрував тенденцію до зростання для Omicron-інфікованих мишей, що вказує на можливість легкої, але стійкої інфекції Omicron у K18-hACE2 мишей. Усі три варіанти, вилучені з легенів мишей, зберігали такий же фенотип розміру бляшки, як і вихідний інокулят, що вказує на те, що реплікація у мишей не мала помітного впливу на генотипи цих вірусів (дані не показані).

Щоб оцінити патогенність вірусу в легенях і носових раковинах мишей K18-hACE2, ми провели гістопатологічний аналіз цих тканин із роздільною здатністю 2 dpi. Як повідомлялося раніше4, 31, велика майже дифузна імунореактивність білка SARS-CoV-2 N була виявлена ​​в легеневих альвеолах мишей, інфікованих вірусом WT (рис. 2e). Навпаки, інфекція Omi-S і Omicron викликала локалізовані вогнища альвеолярного фарбування з меншою кількістю вогнищ для Omicron порівняно з Omi-S. Найбільш виражений фенотип спостерігався в бронхіолярному епітелії, в якому Omi-S спричиняв виражену регулярну циркулюючу інфекцію, при цьому близько 10–15% бронхіол були позитивними на вірусний N-білок при 2 dpi, тоді як лише 3–5% бронхіол були N -позитивний на Omicron (рис. 2f). Вірус WT інфікував близько 1% бронхіол і в усіх випадках включав лише одну ізольовану епітеліальну клітину на бронхіолу. Крім того, бронхіолярна інфекція була пов’язана з епітеліальним некрозом у Omi-S-інфікованих мишей, як визначено за допомогою серійного аналізу зрізів гематоксиліну та еозину (H&E), тоді як у мишей, інфікованих Omicron або WT, не спостерігалося гістологічних ознак пошкодження дихальних шляхів (розширені дані). рис. 8а, б). Носові раковини мишей, інокульованих вірусами WT і Omi-S, містили велику кількість SARS-CoV-2-позитивних клітин, які були пов’язані з явними цитопатичними ефектами, тоді як Omicron продукував рідкісні спорадичні позитивні клітини без явних ознак епітеліальних травми (Розширені дані, рис. 8c). Загалом ці результати свідчать про те, що реплікація Omicron у дихальних шляхах мишей значно послаблена порівняно з Omi-S, що підтверджує наш висновок, що мутації в S лише частково відповідають за ослаблену патогенність Omicron.

Мутації в S і nsp6 визначають ослаблення Omicron

Окрім S-протеїну, Омікрон має амінокислотні зміни в неструктурних білках 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, оболонкі (E), мембрані (M) і N-білках порівняно з вірусом WT (Розширені дані, рис. 9а). Щоб ідентифікувати неспайкові білки, які беруть участь у аттенуації Omicron, ми створили велику панель флуоресцентно мічених химерних вірусів, кожен з яких містить Omicron S у поєднанні з одним неспайковим білком Omicron, а решта білків походить від вірусу WT (розширені дані). рис. 9b). Коли ми поєднали Omicron S з Omicron nsp6 (Omi-S/nsp6), ми спостерігали сильне зниження реплікації вірусу, при цьому кінетика інфекції імітувала кінетику Omicron у культурі клітин (рис. 3a–d); для інших химерних вірусів такого зниження не спостерігалося. Низька ефективність реплікації Omi-S/nsp6 була також підтверджена нашим висновком, що як Omi-S/nsp6, так і Omicron знадобилося майже п’ять-шість днів для відновлення за допомогою CPER, тоді як усі інші варіанти були відновлені за два дні (дані не показані). Нарешті, як і Omicron, Omi-S/nsp6 явно випередив Omi-S у аналізі прямої конкуренції (рис. 3e).

Рис. 2|Роль S у патогенності Omicron. a–c, самцям і самкам мишей K18-hACE2 (віком 12–20 тижнів) інтраназально інокулював 1 × 104 PFU WT (n=6 миші), вірус Omi-S (n=10 мишей) або Omicron (n {{1{{40}}}} мишей). У цьому експерименті використовували два незалежно згенерованих запаси вірусів. Масу тіла (a), клінічну оцінку (b) і виживаність (c) контролювали щодня протягом 14 днів. Мишей, які втратили 20% від початкової маси тіла, піддавали евтаназії. Мишам d,e, K18-hACE2 інтраназально вводили 1 × 104 PFU WT (n=14 мишей), Omi-S (n=14 мишей) та Omicron (n {{ 20}} мишей). Зразки легенів інфікованих мишей збирали з 2 або 4 dpi для визначення титру вірусу (n=4 мишей) (d) або для імуногістохімічного (IHC) виявлення білка N (n=3 мишей) (e). На е представлено репрезентативні зображення IHC, що показують SARS-CoV-2 N (коричневий колір) в альвеолах (стрілки) і бронхіолах (наконечники стрілок) у легенях мишей з роздільною здатністю 2 dpi. Масштабні шкали, 100 мкм. f, Відсоток N-позитивних бронхіол у легенях інфікованих мишей (n=3 мишей) при 2 dpi. Кожна крапка позначає заражену мишу. Статистичну значущість визначали за допомогою двостороннього непарного t-критерію з поправкою Велча (a, b, d, f) і логарифмічного рангового тесту (Mantel-Cox) (c). *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 і ****P <0,0001; NS, не істотно.

У легенях мишей K18-hACE2, тоді як Omi-S спричиняв широку бронхіолярну інфекцію та пошкодження, як Omicron, так і Omi-S/nsp6 показали зниження інфекції без жодних ознак пошкодження епітелію (рис. 3f). Згідно з цими висновками, легені мишей, інфікованих Omi-S/nsp6-, виробляли вірусні титри, еквівалентні тим, що спостерігалися для rOmicron та ізоляту Omicron (рис. 3g). Нарешті, 71% мишей, інфікованих Omi-S/nsp6, вижили (рис. 3h) - на відміну від рівня виживання лише 20%, який спостерігався у мишей, інфікованих Omi-S (рис. 2c). Загалом ці результати вказують на те, що мутацій у S і nsp6 достатньо для визначення ослабленої вірулентності Omicron. Ці спостереження підтверджують і додатково розширюють висновки попереднього дослідження, яке показує, що мутації в області 5′-UTR–nsp12, в якій знаходиться nsp6, сприяють ослабленню Omicron у мишей K18-hACE230.

Рис. 3|Мутації в S і nsp6 зумовлюють патогенність Omicron.a–d, Кінетика реплікації зазначених репортерних вірусів mNeonGreen у клітинах ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (MOI=0.01) визначається потоком цитометрія (n=3 реплікатів) (a,c) та аналіз бляшок (n=3 реплікатів) (b,d). Досліди повторювали двічі. e, клітини ACE2/TMPRSS2/Caco-2 інфікували вірусними сумішами у співвідношенні 1:1, щоб отримати кінцевий MOI 0.005 для кожного вірусу . Клітини фіксували в зазначений час і аналізували за допомогою проточної цитометрії. Показано відсоток неінфікованих, одинично інфікованих та двічі інфікованих клітин. Для компенсації використовували поодинокі інфіковані клітини. Окремі точки даних наносяться на графік разом із середнім значенням ± sd (n=3 повторень). Експеримент повторювали двічі. Мишам f–h, K18-hACE2 інтраназально вводили 1 × 104 PFU вірусів. Зразки легенів інфікованих мишей збирали з роздільною здатністю 2 dpi для виявлення за допомогою IHC білка N (миші n=3) (f) або для визначення титрів вірусу (миші n=4) (g). На f показані типові зображення фарбування H&E N-позитивних бронхіол на вставках. Некроз бронхіолярного епітелію вказано стрілками. Жодних ознак некрозу в бронхіолах мишей, інфікованих Omicron або Omi-S/nsp6, не виявлено. Масштабна шкала, 100 мкм. На правому графіку f показано відсоток N-позитивних бронхіол у легенях інфікованих мишей. Кожна крапка позначає заражену мишу. h, Виживаність інфікованих мишей контролювали щодня протягом 14 днів. Мишей, які втратили 20% від початкової маси тіла, піддавали евтаназії. Статистичну значущість визначали за допомогою двостороннього непарного t-критерію з поправкою Велча (a–g) і логарифмічного рангового тесту (Mantel-Cox) (h). *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 і ****P <0,0001; NS, не істотно.

S-протеїн RBM стимулює втечу вакцини Omicron

Велика кількість літератури надає докази значної втрати Omicron від індукованого вакциною гуморального імунітету14,19. Щоб визначити S-області, пов’язані з фенотипом імунної евакуації Omicron, ми спочатку порівняли in vitro нейтралізуючу активність сироваток вакцинованих осіб проти WT SARS-CoV-2 (USA-WA1/20 20), Omi-S і Omicron. Сироватки, зібрані протягом двох місяців після другої дози мРНК-1273 (мРНК-вакцина Moderna; n=12) або BNT162b2 (мРНК-вакцина Pfizer-BioNTech; n=12) були включені (розширені дані) Таблиця 1). Ми провели багатоцикловий аналіз нейтралізації, використовуючи умови, в яких вірус і нейтралізуючі сироватки були присутні весь час, імітуючи ситуацію у серопозитивної особи. Усі сироватки погано нейтралізували Омікрон із нижчим напівмаксимальним нейтралізуючим розведенням (ND50) в 11.1-разів (діапазон: 4.4-до 81.2-разів; P < 0,0001) для Omicron порівняно з WA1 (рис. 4a,b). Насправді близько 80% зразків не повністю нейтралізували Омікрон при найвищій перевіреній концентрації (Рис. 10 розширених даних). Примітно, що Omi-S продемонстрував ідентичні значення ND50 для Omicron (у 11.5-разів менше, ніж у WA1; P < 0,0001) (рис. 4a,b), що свідчить про те, що білок Omicron S, включений у WT вірус, поводиться так само, як і в Omicron.

Рис. 4|Роль S в імунній резистентності до Omicron. Значення ND50 для WA1, Omi-S та Omicron у сироватках крові осіб, які отримали дві щеплення вакциною Moderna (донори 1–12) або Pfizer (донори 13–24) (додаткову інформацію про сироватки наведено в Розширеному Дані, таблиця 1; окремі криві показані на розширених даних, рис. 10). b, Траєкторії значень ND50 проти WA1, Omi-S та Omicron (дані з a нанесено на графік). Вказано кратну зміну значень ND50 (n=24 зразків сироватки). c–f, Схема химерного (ліворуч; c, d) і мутантного (ліворуч; e, f) вірусів. Нумерація амінокислот для мутантів WA1 у e базується на послідовності WA1 S, тоді як нумерація для мутантів Omicron у f базується на послідовності Omicron S. Було протестовано шість із 24 сироваток (3 від Moderna та 3 від Pfizer). Кожен зразок сироватки позначається крапкою певного кольору. Дані представлені як зміна кратності батьківського вірусу. Статистичну значущість визначали за допомогою двостороннього непарного t-критерію з поправкою Велча. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 і ****P <0,0001; NS, не істотно.

Білок SARS-CoV-2 S містить два домени: домен S1, який взаємодіє з рецептором ACE2, і домен S2, який відповідає за злиття мембран32. У межах домену S1 знаходяться N-кінцевий домен (NTD) і рецептор-зв’язуючий домен (RBD), який містить рецептор-зв’язуючий мотив (RBM), який безпосередньо контактує з рецептором ACE233. NTD Omicron S містить 11 амінокислотних змін, включаючи 6 делецій і одну 3-вставку довжиною амінокислоти, тоді як RBD містить 15 мутацій, 10 з яких зосереджено в RBM (розширений) Дані рис. 1). І NTD, і RBD містять нейтралізуючі епітопи34–37, але RBD є імунодомінантним і є основною мішенню нейтралізуючої активності, яка присутня в імунній сироватці SARS-CoV-237,38. Щоб визначити, чи фенотип резистентності до нейтралізації Omicron викликаний мутаціями в певному домені білка S, ми створили дві групи химерних вірусів. Перша група включала вірус WA1, що несе NTD, RBD або RBM Omicron (рис. 4c), а друга група складалася з вірусу Omi-S, що несе NTD, RBD або RBM WA1 (рис. 4d). Аналіз нейтралізації показав, що мутації в RBM були основною причиною резистентності Omicron до індукованого вакциною гуморального імунітету: заміна RBM WA1 на Omicron зменшила ND50 у 54-разів (P < 0,0001), і, навпаки, заміна RBM Omi-S на WA1 збільшила ND50 у 5.6-разів (P=0.0003) (рис. 4c,d). Той факт, що жоден із вірусів RBM-swap не досяг приблизно 11-разової різниці між WA1 та Omi-S, свідчить про те, що мутації в інших частинах S також сприяють резистентності до вакцини.

Щоб дослідити, чи конкретні мутації в Omicron RBM спричиняють вихід вакцини, ми створили дві додаткові панелі рекомбінантних вірусів, одну з WA1 S, що несе мутації Omicron RBM, окремо або в комбінації (рис. 4e), а іншу — з Omicron S, у якій відсутні ті самі мутації. набір мутацій (рис. 4f). Два мутанти WA1 — мутант 3 (із заміною E484A) і мутант 4 (містить кластер із п’яти замін Q493R, G496S, Q498R, N501Y та Y505H) — продемонстрували помірне, але статистично значуще зниження в 1.4-раз ( P=0.0002) і в 1.8-раз (P=0.0003) у значеннях ND50 відповідно порівняно з WA1 (рис. 4e). Зворотне спостерігалося, коли ці мутації були видалені з Omicron S; мутант Omicron 3 (без заміни E484A) і мутант 4 (без Q493R, G496S, Q498R, N501Y та Y505H) мали 19-кратний (P=0.0082) і 3.{{38 }}кратно (P=0.0025) вищі значення ND50 порівняно з Omicron (рис. 4f). Оскільки жоден із мутантів не зафіксував загальний фенотип Omicron, ми припускаємо, що втеча вакцини є кумулятивним ефектом мутацій, розподілених уздовж довжини білка S. Можливо, що мутації змінюють конформацію Omicron S таким чином, що більшість імунодомінантних нейтралізуючих епітопів порушуються і стають недоступними для нейтралізації.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Обговорення

Це дослідження дає ключову інформацію про вірусні білки, які сприяють патогенності SARS-CoV-2. Ми показуємо, що S, найбільш мутований білок в Omicron, відіграє неповну роль у ослабленні Omicron. У тестах на клітинну інфекцію вірус Omi-S демонструє проміжну ефективність реплікації між предковим вірусом і Omicron. Подібним чином у мишей K18-hACE2 Omi-S контрастує з нефатальним Omicron і призводить до 80% смертності; предковий вірус викликає 100% смертність у цих мишей. Примітно, що коли ми об’єднали S-мутації з мутаціями в nsp6, вірус продемонстрував ослаблений фенотип, багато в чому схожий на фенотип Omicron, що вказує на те, що ці два білки є основними детермінантами патогенності Omicron. Подальші дослідження розшифрують механізм(и), за допомогою якого мутації nsp6 впливають на реплікацію вірусу.

Одним із потенційних обмежень нашого дослідження є використання мишей K18-hACE2 для вивчення патогенезу замість моделей приматів, які мають більше схожості з людьми39. Однак слід зазначити, що миші K18-hACE2 є добре встановленою моделлю для дослідження летального фенотипу SARS-CoV-24,31. Хоча у цих мишей після інфікування SARS-CoV-2 розвивається патологія легенів, смертність була пов’язана з ураженням центральної нервової системи внаслідок нейроінвазії та поширення вірусу31,40. Той факт, що інфікування мишей K18-hACE2 Omi-S, але не Omicron, викликає неврологічні ознаки (наприклад, згорблену поставу та відсутність реакції), свідчить про те, що властивість нейроінвазії зберігається в Omi-S, ймовірно, в результаті його вищої ефективності реплікації, і що детермінанти цієї властивості лежать за межами білка S. Ці висновки узгоджуються з попереднім дослідженням, яке показало, що хом’яки, заражені Omi-S, виділили значно більше вірусу та втратили більше ваги, ніж ті, заражені Omicron, що свідчить про те, що мутації за межами S сприяють ослабленню патогенності Omicron41.

Ми виявили, що, незважаючи на те, що предковий вірус в основному реплікується в легеневих альвеолах і викликає лише рідкісну інфекцію бронхіол у K18-hACE2 мишей, як Omi-S, так і Omicron демонструють підвищену схильність до реплікації в бронхіолярному епітелії, що вказує на те, що S білок відповідає за змінений тропізм. Механізм цього перемикання невідомий, але можливо, що Omicron S ефективніший, ніж WT S, у використанні катепсину B або катепсину L (посилання 25, 42, 43), які утворюють активний шлях проникнення вірусу в бронхіоли та інші дихальні шляхи. клітини41. Навпаки, проникнення SARS-CoV-2 в альвеолярні епітеліальні клітини в основному відбувається через TMPRSS2 (посилання 28, 44), який Омікрон S недостатньо використовує 25, 45, що призводить до поганого зараження цих клітин 4, 5 ,25,43. Ці висновки можуть пояснити ослаблену легеневу патологію, спричинену Омікроном.

Cistanche корисний для зміцнення імунної системи

Omicron nsp6 має два змінених сайти відносно прототипу SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1 ізолят: делеція трьох амінокислот (LSG, позиції 105–107) і заміна I189V (рис. розширених даних). 9). Було описано декілька функцій nsp6 у реплікації коронавірусу; головним серед них є біогенез подвійних мембранних везикул (DMV), які є місцем синтезу вірусної РНК46–50. Попереднє дослідження показало, що DMV SARS-CoV-2 в основному генеруються узгодженою дією трьох вірусних білків: nsp3, nsp4 і nsp6; хоча nsp3 і nsp4 є достатніми для формування DMV, nsp6 з’єднує ці DMV з ендоплазматичним ретикулумом і каналізує важливий зв’язок між цими структурами46. Чи впливає сукупність мутацій в Omicron nsp6 на формування або функції DMV, потребує подальшого дослідження. Nsp6 також активує NLR3-залежне вироблення цитокінів і піроптоз у легенях пацієнтів із COVID-19, що є ключовим фактором вірулентності47. Слід зазначити, що варіант nsp6, пов’язаний із безсимптомною COVID-19, продемонстрував знижену здатність індукувати піроптоз47, що спонукало до припущень, що мутації в Omicron nsp6 також можуть впливати на піроптоз. Для аналізу впливу мутацій Omicron на функції nsp6 будуть потрібні детальні механістичні дослідження.

Наразі невідомо, чи діють мутації в S і nsp6 узгоджено одна з одною, щоб стимулювати ослаблення Omicron. З огляду на те, що Омікрон S показав більшу схильність до бронхіол, можливо, що S відповідальний за змінений тропізм вірусу, тоді як неспайкові мутації, включно з nsp6-, є лише адаптацією до зміненого тканинного середовища. Варто зазначити, що хоча nsp6, здається, є основним неспайковим білком, що стоїть за ослабленням Omicron, не можна повністю виключити внесок інших вірусних білків. Експерименти in vitro з вивчення ролі неспайкових мутацій були проведені в клітинах ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Використання інших, більш імунокомпетентних типів клітин може також виявити вплив інших неспайкових мутацій. Крім того, наші химерні віруси містили Omicron S у парі лише з одним неспайковим білком одночасно, що обмежувало епістатичні взаємодії на великі відстані між мутаціями в кількох вірусних білках.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Наше дослідження показує, що мутації в RBM Omicron S є основними детермінантами того, що Omicron позбавляється нейтралізуючих антитіл, хоча мутації в інших регіонах S також роблять свій внесок. У межах RBM ми ідентифікуємо дві гарячі точки мутацій, які дають Omicron S здатність протистояти нейтралізації: одна містить заміну E484A, а інша містить кластер із п’яти замін: Q493R, G496S, Q498R, N501Y та Y505H. Було показано, що заміна E484A не нейтралізується реконвалесцентними сироватками51. Крім того, структурне моделювання припускає, що деякі терапевтичні моноклональні антитіла створюють високостабільні сольові містки із залишком E484, повністю втрачаючи зв’язування, коли цей залишок змінюється на A або після змін Q493K і Y505H52. Подібним чином, картування залишків RBM, які безпосередньо взаємодіють з 49 відомими нейтралізуючими антитілами, виявило N440, G446, S477 і T478 як низькочастотні інтерактори, N501, Y505 і Q498 як середньочастотні інтерактори, а E484 і Q493 як високочастотні інтерактори53 відповідно до результатів нашого аналізу нейтралізації. Примітно, що хоча потенціал зв’язування антитіл Omicron S порушений54, його здатність зв’язувати рецептори залишається незмінною. Насправді Omicron RBD має вищу спорідненість з ACE2 порівняно з Wuhan-Hu-1 і Delta RBD25. Це вказує на те, що мутації в Omicron S розвинулися таким чином, що вони перешкоджають зв’язуванню антитіл, але зберігають залучення рецепторів. Це відкриває можливість націлювання на збережені та структурно обмежені ділянки S, які беруть участь у розпізнаванні ACE2, для розробки вакцин широкого спектру дії для контролю пандемії COVID-19.

посилання

1. Лю Л. та ін. Вражаюче ухилення від антитіл, що проявляється варіантом Omicron SARS-CoV-2. Nature 602, 676–681 (2022).

2. Планас Д. та ін. Значна втеча SARS-CoV-2 Omicron для нейтралізації антитіл. Nature 602, 671–675 (2022).

3. Шмідт Ф. та ін. Плазмова нейтралізація варіанту SARS-CoV-2 Omicron. Н. англ. J. Med. 386, 599–601 (2022).

4. Shuai, H. та ін. Атенуйована реплікація та патогенність SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Nature 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ та ін. Вірус SARS-CoV-2 Omicron викликає ослаблене захворювання у мишей і хом’яків. Nature 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA та ін. Клінічні результати, пов’язані з варіантом SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) та інфекцією підваріантів BA.1/BA.1.1 або BA.2 у Південній Каліфорнії. Нац. Мед. 28, 1933–1943 (2022).

7. Wolter, N. та ін. Рання оцінка клінічної тяжкості варіанту омікрон SARS-CoV-2 у Південній Африці: дослідження зв’язку даних. Lancet 399, 437–446 (2022).

8. Уллоа, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA Оцінки тяжкості варіанту SARS-CoV-2 Omicron в Онтаріо, Канада. J. Am. Мед. доц. 327, 1286–1288 (2022).

9. Уракі Р. та ін. Характеристика ізолятів SARS-CoV-2 Omicron BA.4 і BA.5 у гризунів. Nature 612, 540–545 (2022).

10. Уракі Р. та ін. Характеристика та антивірусна чутливість SARS-CoV-2 Omicron BA.2. Nature 607, 119–127 (2022).

11. Дайер, О. Ковід-19: «Омікрон» викликає більше інфекцій, але менше госпіталізацій, ніж «Дельта», дані Південної Африки. бр. Мед. J. 375, n3104 (2021).

12. Сігал, А. Легше захворювання з Омікроном: це вірус чи попередній імунітет? Нац. Rev. Immunol. 22, 69–71 (2022).

13. ХТО. Відстеження варіантів SARS-CoV-2 https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022).

14. Cele, S. та ін. Omicron значною мірою, але не повністю, уникає нейтралізації Pfizer BNT162b2. Nature 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. та ін. Ймовірна передача варіанту омікрон SARS-CoV-2 у карантинному готелі, Гонконг, Китай, листопад 2021 р. Інфікувати. дис. 28, 460–462 (2022).

16. Юліано А. Д. та ін. Тенденції щодо тяжкості захворювання та використання медичної допомоги протягом періоду раннього варіанту Omicron порівняно з попередніми періодами високої передачі SARS-CoV-2 – Сполучені Штати, грудень 2020 р. – січень 2022 р. Morb. Смертельний. Wkly Rep. 71, 146–152 (2022).

17. CDC. Відстеження даних COVID https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Тейлор, Л. Ковід-19: «Омікрон» щотижня підвищує кількість заражень у всьому світі. бр. Мед. J. 376, o66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. та ін. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 призводить до повсюдної втечі від реакції нейтралізуючих антитіл. Cell 185, 467–484 (2022).

20. Сузукі Р. та ін. Послаблена фузогенність і патогенність варіанту SARS-CoV-2 Omicron. Nature 603, 700–705 (2022).

21. Сміт Д. С. та ін. Відстеження загадкових ліній SARS-CoV-2, виявлених у стічних водах Нью-Йорка. Нац. Комун. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE та ін. Нотатки з місця: ранні докази варіанту SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) у комунальних стічних водах – Сполучені Штати, листопад–грудень 2021 р. Morb. Смертельний. Wkly Rep. 71, 103–105 (2022).

23. Herrmann, A. та ін. Клонування безпасажного геному SARS-CoV-2 і мутагенез за допомогою червоної рекомбінації. Міжн. J. Mol. Sci. 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU. Оптимізований метод на основі реакції подовження кругової полімерази для функціонального аналізу SARS-CoV-2. Препринт на https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. et al. Змінене використання TMPRSS2 SARS-CoV-2 Omicron впливає на тропізм і фузогенність. Nature 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ та ін. SARS-CoV-2 Omicron – це варіант імунної порятунку зі зміненим шляхом проникнення в клітину. Нац. мікробіол. 7, 1161–1179 (2022).

27. Мартінес Р.Б. та ін. Патологія та патогенез SARS-CoV-2, пов’язаного зі смертельною коронавірусною хворобою, США. Emerg. Інфікувати. дис. 26, 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. та ін. Інфекція SARS-CoV-2 альвеолярних клітин 2 типу легенів людини, отриманих із плюрипотентних стовбурових клітин, викликає швидку внутрішню епітеліальну запальну відповідь. Клітинна стовбурова клітина 27, 962–973 (2020).

29. Mulay, A. та ін. SARS-CoV-2 інфекція первинного легеневого епітелію людини для моделювання COVID-19 і відкриття ліків. Cell Rep. 35, 109055 (2021).

30. Лю, С., Селварадж, П., Сангаре, К., Луан, Б. і Ван, Т. Т. Спайк-білок-незалежне ослаблення варіанту SARS-CoV-2 Omicron у лабораторних мишей. Cell Rep. 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. et al. Смертельна нейродисемінація та тропізм SARS-CoV-2 у мишей K18-hACE2 лише частково залежать від експресії hACE2. Віруси 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. & Liu, SW. Структурні та функціональні властивості спайкового білка SARS CoV-2: потенційна розробка антивірусного препарату для COVID-19 . Акта Фармакол. гріх. 41, 1141–1149 (2020).

33. Lan, J. та ін. Структура спайкового домену зв’язування рецептора SARS-CoV-2, зв’язаного з рецептором ACE2. Nature 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. та ін. Нейтралізуюче антитіло людини зв’язується з N-кінцевим доменом спайкового білка SARS-CoV-2. Наука 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN та ін. Поширене, захисне та конвергентне розпізнавання IgG спайкових епітопів SARS-CoV-2 не RBD. Наука 372, 1108–1112 (2021).

36. Премкумар Л. та ін. Рецепторний зв’язувальний домен білка вірусного шипа є імунодомінантною та високоспецифічною мішенню антитіл у пацієнтів із SARS-CoV-2. Sci. Immunol. 5, eabc8413 (2020).

37. Ju, B. та ін. Людські нейтралізуючі антитіла, викликані інфекцією SARS-CoV-2. Nature 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. та ін. Картування нейтралізуючих та імунодомінантних сайтів на спайковому рецептор-зв’язуючому домені SARS-CoV-2 за допомогою структурно керованої серології високої роздільної здатності. Cell 183, 1024–1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Моделі нелюдських приматів для дослідження SARS-CoV-2: розглянемо альтернативи макакам. Lab Anim. 50, 113–114 (2021).

40. Кумарі П. та ін. Нейроінвазія та енцефаліт після інтраназальної інокуляції SARS CoV-2 мишам K18-hACE2. Віруси 13, 132 (2021).

41. Peacock, TP та ін. Змінений шлях проникнення та антигенна відстань варіанту SARS-CoV-2 Omicron відображаються на окремих доменах спайкового білка. Препринт на https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Падманабхан, П. і Діксіт, Н. М. Моделювання того, як змінене використання шляхів проникнення в клітини варіантом SARS-CoV-2 Omicron може вплинути на ефективність і синергію інгібіторів TMPRSS2 та катепсину B/L. Препринт на https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY та ін. Реплікація варіанту SARS-CoV-2 Omicron у бронхах і легенях людини ex vivo. Nature 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. et al. Оцінка проникнення SARS-CoV-2, запалення та нових терапевтичних засобів у клітинах легеневої тканини людини. PLoS Pathog. 18, e1010171 (2022).

45. Чжао Х. та ін. Варіант SARS-CoV-2 Omicron показує менш ефективну активність реплікації та злиття порівняно з варіантом Delta в клітинах, що експресуються TMPRSS2-. Emerg. Інфікують мікроби. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. та ін. Роль NSP6 у біогенезі реплікаційної органели SARS-CoV-2. Nature 606, 761–768 (2022).

47. Sun, X. та ін. SARS-CoV-2 неструктурний білок 6 викликає NLRP3-залежний піроптоз, націлюючись на ATP6AP1. Клітинна смерть диф. 29, 1240–1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T. Коронавірус NSP6 обмежує розширення аутофагосом. Автофагія 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. et al. Еволюційний аналіз SARS-CoV-2: як мутація неструктурного білка 6 (NSP6) може вплинути на вірусну аутофагію. Ж. Інфікувати. 81, e24–e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC Реплікація РНК вірусу мишачого гепатиту відбувається у подвійних мембранних везикулах. J. Virol 76, 3697–3708 (2002).

51. Лю, З. та ін. Виявлення спайкових мутацій SARS-CoV-2, які послаблюють нейтралізацію моноклональних і сироваткових антитіл. Cell Host Microbe 29, 477–488 (2021).

52. Шах, М. і Ву, Г. Г. Омікрон: сильно мутований варіант SARS-CoV-2 демонструє сильніший зв’язок з ACE2 і значною мірою уникає схвалених терапевтичних антитіл проти COVID-19. Фронт. Immunol. 12, 830527 (2021).

53. Ye, G., Liu, B. & Li, F. Кріо-ЕМ структура ектодомену спайкового білка SARS-CoV-2. Нац. Комун. 13, 1214 (2022).

54. Carreno, JM та ін. Активність реконвалесцентної та вакцинної сироватки проти SARS-CoV-2 Omicron. Nature 602, 682–688 (2022).