SLC37A2, споріднена з фосфором молекула збільшує кількість клітин гладкої мускулатури в кальцифікованій аормі

Кальцифікація судинє основним джереломсерцево-судинне захворюванняу пацієнтів з хронічною хворобою нирок.Гіперфосфатеміяпризводить до збільшення внутрішньоклітинного надходження фосфору, що призводить до збільшення остеобластоподібних клітин у клітинах гладкої мускулатури судин. PiT-1 транспортує фосфат у гладком’язові клітини судин. Однак механізм кальцифікації судин до кінця не вивчений. У цьому дослідженні досліджувалися потенційні молекули, пов’язані з фосфором, крім PiT-1. Ми припустили, що споріднені з фосфором молекули належать дорозчинена речовина-носій(SLC) суперсімейство буде залучено до кальцифікації судин. У результаті аналізу мікрочіпів ДНК ми зосередилися на SLC37A2 і показали, що експресія мРНК цих клітин посилюється на кальцифікованих гладком’язових клітинах аорти (AoSMC). Повідомлялося, що SLC37A2 транспортує як глюкозо-6-фосфат/фосфат, так і обмін фосфат/фосфат. Аналіз in vitro показав, що на експресію SLC37A2 не впливає запалення на AoSMC. Експресія мРНК SLC37A2 і білка зросла в кальцинованих AoSMC. In vivo аналіз показав, що експресія мРНК SLC37A2 в аортіхронічні захворювання нирокщурів корелювали з генами остеогенних маркерів. Крім того, SLC37A2 експресувався в області кальцифікації судин ухронічна хвороба нирок щурів. У результаті ми показали, що SLC37A2 є однією з молекул, які збільшуються зкальцифікація судинin vitro та in vivo.

Ключові слова: SLC37A2,кальцифікація судин, клітини гладких м'язів аорти,хронічні захворювання нирок, гіперфосфатемія

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНШИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ДЛЯ ФУНКЦІЇ НИРОК

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

У міру збільшення кількості хворих схронічні захворювання нирок(ХНЗ) зростає кількість хворихщо потребують діалізутакож збільшиться. Більшість смертей у пацієнтів, які проходятьдіалізобумовленісерцево-судинні захворюванняяк отсерцева недостатність, порушення мозкового кровообігу, або інфаркт міокарда. (,2) Головне джерелосерцево-судинне захворюванняце позаматкова кальцифікація() аномалія, викликана утворенням і відкладенням кристалів фосфату кальцію в м’яких тканинах. (4 6) Різні фактори, наприклад запалення. окислювальний стрес і підвищення рівня кальцію (Ca) і фосфору (P) у плазмі беруть участь у прогресуванні кальцифікації судин. Серед цих факторів гіперфосфатемія найбільш сильно пов’язана з кальцифікацією судин. (7.8) Гіперфосфатемія спричинена надлишковим надходженням Р за наявності зниженої функції нирок. Таким чином, пацієнтам, які перебувають на діалізі, необхідно обмежити споживання П. (79-12). Однак повідомлялося, щокальцифікація судинвже прогресує, коли розпочато діаліз; це також спостерігалося у пацієнтів із ранньою стадією ХХН, коли гіперфосфатемія не виявляється. (3) Отже, для покращення прогнозу життя важливо запобігати кальцифікації судин у пацієнтів із ХХН на ранній стадії.

що призводить до посиленого припливу фосфору в гладком’язові клітини судин (VSMC). Приплив P здійснюється через PiT-1, транспортер на поверхні клітинної мембрани VSMC. PiT- є членом надродини переносників розчиненої речовини (SLC), яка включає транспортер фосфату натрію, кодований SLC20A1.04 PiT- транспортує фосфат через Na-залежні клітинні мембрани та згодом мінералізацію матриці через підвищені рівні p.s) Як внутрішньоклітинний Підвищуються рівні P, VSMC починає експресувати остеогенні фактори транскрипції, такі як транскрипційний фактор 2 (Runx2) (16), пов’язаний з рантом. Цей ефект супроводжується посиленням експресії генів, специфічних для остеобластів, таких як остеопонтин і остеокальцин. Крім того, знижується експресія гладком'язових специфічних білків. наприклад білок гладкої мускулатури 22-0 (SM22-0). В результаті VSMC трансформується в остеобластоподібні клітини. (1718) Недавні клінічні дослідження показали, що рівень кальцію в крові. білкових частинок (CPP), які представляють собою колоїдні частинки фосфату кальцію, збільшується зі зниженням функції нирок. (19-21)Крім того, повідомлялося про кореляцію з рівнями CPP і P у крові.2o2i) Можливо, CpP може спровокувати прогресування кальцифікації судин.22-24)

Проте кальцифікація судин спостерігалася у пацієнтів із ХХН на ранній стадії з нормальним рівнем P у плазмі. (13) Крім того, мРНК PiT-1 експресується повсюдно в усіх тканинах. Таким чином, інша молекула може діяти переважно в області кальцифікації судин. Є повідомлення, щозапаленнясприяє кальцифікації судин. Запальні фактори, такі як інтерлейкін (IL)-1B, IL-6 і фактор некрозу пухлини-альфа (TNF-a), індукують диференціацію VSMC в клітини, подібні до остеобластів (2s26). TNF-a індукує кальцифікацію судин через шлях цАМФ, який відіграє роль у диференціації остеобластів.2728) IL-6 регулює різні шляхи, що призводять до кальцифікації судин VSMC2-31) Крім того. IIIB, IL-6 і TNF-a також є факторами, пов’язаними з посиленням кальцифікації судин, викликаної високими рівнями p.3233). Сучасні дані не повністю пояснюють механізм розвитку судин

кальцифікація, викликана цими факторами. Ми припустили, що можуть існувати інші молекули, пов’язані з P, такі як молекули суперродини SLC, які беруть участь у кальцифікації судин. Ми зосередилися на мембранних білках у суперсімействі SLC і досліджували потенційні кандидати на P-пов’язані молекули, крім PiT-1, для участі в кальцифікації судин. Крім того, ми досліджували зв'язок між молекулами-кандидатами та кальцифікацією судин у відео та in vivo.

Матеріали та методи

Культура клітин. Нормальні клітини гладких м’язів аорти людини (AoSMC) були отримані від Lonza (Базель, Швейцарія). AoSMC культивували відповідно до інструкцій виробника. AoSMC підтримували в середовищі росту (базальне середовище гладком’язових клітин, доповнене 5% фетальної бичачої сироватки (FBS), епідермальним фактором росту, інсуліном, фактором росту фібробластів-B і гентаміцином/амфотерицином-B). Носії змінювали через день. AoSMC вирощували у зволоженому інкубаторі з 5% CO при 37 градусах і підтримували до досягнення злиття, а потім використовували в експериментах.

Кальцифікований AoSMC. Кальцифікацію AoSMC індукували, як описано раніше.435) AOSMC культивували в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко, доповненому 15% FBS і пеніциліном-стрептоміцином, і культивували з 2,6 мМ P протягом 3, 6, 9, 12 і 14 днів. Концентрацію P регулювали за допомогою буфера P NaH, PO/Na та HPO. pH 7,2). Інші AoSMC не культивували з 2,6 мМ P.

ДНК мікрочіп. Використовували загальну РНК зразків AoSMC, культивованих і не культивованих з 2,6 мМ P. Загальну РНК 5.0 ug аналізували за допомогою ДНК-мікроматриці (Agilent Technologies, Токіо, Японія). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k вер. 2 Microarray використовувався для дослідження приблизно 26 000 генів. Співвідношення розраховували шляхом ділення рівня експресії AoSMC, культивованого з 2,6 мМ протягом 12 днів, на рівень експресії AoSMC, не культивованого з 2,6 мМ P

ДНК мікрочіп

Використовували загальну РНК зразків AoSMC, культивованих і не культивованих з 2,6 мМ P. Загальну РНК 5.0 ug аналізували за допомогою ДНК-мікроматриці (Agilent Technologies, Токіо, Японія). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k вер. 2 Microarray використовувався для дослідження приблизно 26 000 генів. Співвідношення розраховували шляхом ділення рівня експресії на AoSMC, культивованих з 2,6 мМ протягом 12 днів, на рівень експресії на AoSMC, не культивованих з 2,6 мМ P. Експресія SLC37A2 при запаленні судин. Для індукції запальної відповіді в AoSMC клітини культивували з ростовим середовищем до досягнення злиття, а потім обробляли 1 мкг мл ліпополісахаридів (ЛПС) (ЛПС з Escherichia coli O111:B4; Sigma, Сент-Луїс, Миссурі) протягом 24 і 72 без 2,6 мМ P. Інші AoSMC не культивували за допомогою аналізу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у реальному часі. Загальну РНК екстрагували з AoSMC, оброблених LPS протягом 24 і 72 годин, і клітин, не оброблених LPS. Кількісну ПЛР у реальному часі на основі SYBR green проводили з використанням синтезованої кДНК і відповідного набору праймерів для кожного цільового гена за допомогою системи ПЛР у реальному часі aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Послідовності праймерів були такими: людський IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' і 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; людини SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' і 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- і 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 та рівні експресії мРНК SLC37A2 були розраховані після нормалізації за допомогою GAPDH. Експресія SLC37A2 у кальцифікованих AoSMC. Усього екстрагували з AoSMC, не культивованих з 2,6 мМ Р, і клітин AoSMC, культивованих з 2,6 мМ Р протягом 3, 6, 9, 12 і 14 днів. ПЛР у реальному часі проводили з використанням синтезованої кДНК. Послідовності праймерів були як наступні: людський Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' і 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Рівні експресії мРНК Runx2 і SLC37A2 були розраховані після нормалізації за допомогою APPH.

Вестерн-блоттинг.

Загальний білок був зібраний із зразків AoSMC, культивованих у тих самих умовах, що використовуються для ПЛР-аналізу в реальному часі. Ці зразки лізували за допомогою трис-буферного фізіологічного розчину (pH 75), доданого 5% NP-40 і 1% суміші інгібіторів протеази. Зразки концентрації білка вимірювали за допомогою набору BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). і концентрацію регулювали вестерн-блоттингом, 10 мкг білка розділяли в 10% поліакриламідному гелі за допомогою електрофорезу в додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі. Мембрану обробляли антитілом SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) або антитілом GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) як первинними антитілами, інкубували з кролячим lgG антитілом, кон’югованим із пероксидазою хрону (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота) як вторинним антитілом. та візуалізовано за допомогою Amersham ECL Select (GE Healthcare. Бакінгемшир, Англія) та люмінесцентного аналізатора зображень (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Токіо, Японія). Смугу кількісно визначали за допомогою lmagel.

Експериментальний

Усі протоколи дослідження були схвалені Комітетом з етики Університету Хіоґо, Школою наук про людину та навколишнє середовище. Дванадцятитижневі самці щурів Sprague-Dawley були придбані в Japan SLC (Shizuoka, Японія). Щурів утримували на 12-світлі, 12-годинному темряві (09:00-21:00) і мали вільний доступ до їжі та надзвичайно чистої води.

Експериментальні дієти включають контрольну P-дієту (1.0% P, 0.6Ca, 20% білка), аденінову дієту (0.75% аденіну , 1.0% P, 0.6% Ca, 2,5% білка), дієта з низьким вмістом P (LP) (0.2% P,0 .6% Ca, 10% білка) і дієта з високим вмістом P (HP) (1,0% P, 0,6% Ca, 10% білка) на основі дієти AIN93-G (східна Дріжджі, Токіо, Японія) з казеїном як джерелом білка.3637) Повідомлялося, що дієта з низьким вмістом білка сприяє кальцифікації судин у щурів із спричиненою аденіном нирковою недостатністю, тому було проведено обмеження білка.3738) Перед групуванням усіх щурів (n=23) отримували стандартну дієту MF (східні дріжджі) протягом тижня для акліматизації. У віці 13 тижнів щури були розділені на 2 групи: контрольну (n=5) і групу з ХХН, викликаною аденіном (n=18). Контрольна група отримувала контрольну дієту P протягом 6 тижнів. . Група пацієнтів із ХХН, спричиненою аденіном, отримувала аденінову дієту протягом приблизно 3 тижнів, а потім була розділена на 2 підгрупи: група ХХН-ЛП (n=8) або група CKDHP (n=10). Щури групи CKD-LP та групи CKD-HP отримували дієту LP та дієту HP протягом 3 тижнів відповідно протягом експериментального періоду споживання їжі реєструвалося щодня. Під час аденінової дієти зразки крові відбирали з хвостової вени між 10:00 ранку та 11:00 ранку один раз на тиждень до другого тижня, а потім кожні 2 дні для моніторингу рівня в плазмі. Під час дієти LP або дієти HP зразки крові збирали раз на тиждень. Зразки сечі збирали та об’єм сечі реєстрували один раз на тиждень. Щурів умертвляли за допомогою анестетика з використанням ізофлурану (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Японія) і лапаротомії. Для аналізу були відібрані зразки крові з нижньої порожнистої вени та торакоабдомінальної аорти.

Експресія SLC37A2 на аорті.

Приблизно одну третину зібраної торакоабдомінальної аорти використовували для візуалізації кальцифікації та проведення імунного фарбування. Аорту залили в парафін і вирізали 4-зрізи. Зрізи фарбували за допомогою набору Von Kossa Method for Calcium Kit (Polysciences. Warrington, PA) відповідно до інструкцій виробника. Аналіз імунного фарбування проводили з серійними зрізами. Зрізи інкубували з антитілом SLC37A2 протягом ночі при 4 градусах, а потім обробляли Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Токіо, Японія) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після цього зрізи обробляли набором DABsubstrate (Nichirei).

Загальну РНК екстрагували з решти замороженої торакоабдомінальної аорти. ПЛР у реальному часі проводили з використанням синтезованої кДНК. Послідовності праймерів були такими: остео-понтин щурів, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' і 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' і; щур SLC37A2, 5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' і 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Рівні експресії мРНК остеопонтину та мРНК SLC37A2 були розраховані після нормалізації за допомогою GAPDH

Статистичний аналіз.

Дані представлені як середнє + SE. Відмінності між групами аналізували за допомогою t-тесту. В експериментах з кальцинованим AoSMC, індукованим фосфатом, відмінності аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим використанням методу Даннета. В експериментах на моделі CKD відмінності аналізували за допомогою тесту Раскела-Уолліса з подальшим використанням методу Стіла-Двасса. Коефіцієнти кореляції (rs) визначали за допомогою рангового тесту коефіцієнта кореляції Спірмена. Для всіх тестів. двобічні значення p<0.05 were considered statistically significant.