Анотація
Довідкова інформація ГПН є поширеним наслідком інфекції SARS-CoV-2 і сприяє тяжкості та смертності від COVID-19. Тут ми перевірили гіпотезу про те, щозміни нирокіндукований ГПН, пов’язаним з COVID-19, можна було виявити в клітинах, зібраних із сечі. Методи Ми виконали секвенування одноклітинної РНК (scRNAseq) на клітинах, виділених із сечі восьми госпіталізованих пацієнтів із COVID-19 з (n55) або без ГПН (n53), а також чотирьох пацієнтів з ГПН, відмінним від COVID-19. (n54) для оцінки відмінностей у клітинному складі та експресії генів під час ГПН. Результати. Аналіз 30 076 клітин виявив різноманітність типів клітин, більшість з яких булинирка, уротеліальні та імунні клітини. Аналіз канальцевих клітин пацієнтів з ГПН показав збагачення транскриптів, пов’язаних із шляхами, пов’язаними з ушкодженнями, порівняно з тими, хто не мав ГПН. Серед відновлених типів клітин експресія ACE2 і TMPRSS2 була найвищою в уротеліальних клітинах. Зокрема, в одного пацієнта ми виявили РНК вірусу SARS-CoV-2 в уротеліальних клітинах. Ці самі клітини були збагачені транскриптами, пов’язаними з противірусними та протизапальними шляхами. Висновки Ми успішно провели scRNAseq на осаді сечі госпіталізованих пацієнтів із COVID-19, щоб неінвазивно вивчити клітинні зміни, пов’язані з ГПН, і створили набір даних, який включає як ушкоджені, так і неушкоджені клітини нирок. Крім того, ми надаємо попередні докази прямого зараження клітин сечового міхура SARS-CoV-2. Сечовий осад містить велику кількість інформації та є корисним ресурсом для вивчення патофізіології та клітинних змін, які відбуваються вхвороби нирок.
ОРГАНІЧНІ ЗДОРОВІ ПРОДУКТИ ДЛЯ ЗДОРОВ'Я НИРОК
вступ
Інфекція коронавірусу 2 важкого гострого респіраторного синдрому (SARS-CoV-2) викликає патологію в багатьох системах, включаючи нирки, а ГПН пов’язана зі значною захворюваністю та смертністю від коронавірусної хвороби 2019 (COVID-19) (1 –5). Кілька досліджень продемонстрували високі показники ГПН серед госпіталізованих пацієнтів із COVID-19 (6), причому деякі повідомляють про розвиток ГПН у 50% інфікованих осіб (7–9). Первинний рецептор SARS-CoV-2 ACE2 експресується на епітеліальних клітинах по всій сечовивідній системі, включаючи клітини проксимальних канальців і уротеліальні клітини (10–13), хоча незрозуміло, чи ГПН у пацієнтів із COVID-19 виникає внаслідок прямої вірусної інфекції проксимальних канальців або є результатом системної відповіді на SARS-CoV-2 (14–22). Подібним чином неясно, чи може SARS-CoV-2 викликати вірусний цистит через пряме зараження уротеліальних клітин, хоча така можливість була запропонована (23–26). Незважаючи на високу поширеність ГПН, пов’язаного з COVID-19, основні клітинні зміни, які відбуваються під час ГПН, залишаються недостатньо вивченими.
ГПН, пов’язаний з COVID-19, залишається в основному недостатньо вивченим, оскільки доступ до ниркової тканини потребує біопсії або посмертного аналізу (27). Недавні дослідження виявили в сечі різноманітні клітини нирок, сечового міхура та імунних клітин (28–30). Таким чином, сеча може дати цінну інформацію про неінвазивне дослідження змін нирок під час ГПН, пов’язаного з COVID-19. Тут ми виконали секвенування одноклітинної РНК (RNA-Seq), щоб охарактеризувати різноманітність клітин у сечі госпіталізованих пацієнтів із COVID-19 із ГПН та без нього. Ми перевірили гіпотезу про те, що зміни в нирках при ГПН, пов’язаному з COVID-19, можна виявити в клітинах, зібраних із сечі. Ми також зібрали зразки від пацієнтів без COVID-19 і з ГПН (ГПН без COVID-19). Ми знайшли кілька популяцій запальних імунних клітин і диференціально активованих шляхів при ГПН, асоційованому з COVID-19, а також попередні доказидля прямого зараження уротеліальних клітин SARS-CoV-2.
Матеріали та методи
Учасники та змінні Дорослі віком від 18 років проходили обстеження під час госпіталізації або переведення до лікарні Університету Алабами в Бірмінгемі (UAB) у період з березня по травень 2021 року. Випадки ГПН були виявлені за допомогоюЗахворювання нирокПоліпшення загального визначення результатів як підвищення креатиніну сироватки (sCr) .0.3 мг/дл протягом 48 годин або .1,53 вихідного креатиніну. Контролі без змін у креатиніні були обрані на основі відповідності віку та статі, де це було можливо, і оброблені з кожним відповідним зразком AKI. Початкове значення sCr визначали за останнім значенням sCr за 7–365 днів до госпіталізації. Додаткові клінічні дані щодо демографії, історії хвороби, клінічних характеристик і лабораторних показників були отримані з карт пацієнтів за допомогою команди i2b2 Центру клінічних і трансляційних наук UAB. Було включено вісім госпіталізованих пацієнтів із COVID-19, п’ятеро з ГПН і троє без ГПН. Це дослідження та збір зразків були схвалені Інституційною ревізійною радою UAB. Команда UAB Acute Nephrology Consult також зібрала зразки пацієнтів з ГПН, не пов’язаним з COVID-19 (n54), щоб порівняти клітинні зміни з ГПН, пов’язаним з COVID-19. Вони були зібрані згідно з іншим протоколом інституційної комісії з огляду, який дозволяє збирати залишки зразків сечі, тому є анонімним.
Збір та обробка зразків
Всі кроки виконувалися на льоду. Сечу збирали або як зразок сечовипускання, або з сечового катетера. Зразки були негайно передані в лабораторію рівня біобезпеки 21 для обробки. Зразки сечі переносили в конічну пробірку 50- мл і центрифугували при 10003g протягом 10 хвилин при 4°C. Осад клітин промивали охолодженим PBS, фільтрували через фільтр 40- мм і знову центрифугували. Живі клітини очищали за допомогою набору MACS Debris Removal Kit (Miltenyi Biotec), а потім набору EasySep Annexin V Dead Cell Removal Kit (StemCell). Коротко кажучи, клітини ресуспендували в крижаному PBS і змішували з розчином для видалення сміття. На суміш наносили холодний PBS і центрифугували при 3003g протягом 10 хвилин при 4°C. Дві верхні фази відсмоктували, а потім клітини, що залишилися, промивали PBS. Клітини ресуспендували та змішували з сумішшю Dead Cell Removal Cocktail, Biotin Selection Cocktail, а потім RapidSpheres перед розділенням у магніті EasySep. Клітини промивали та ресуспендували в 52 мл PBS (без кальцію або магнію) 10,04% BSA (Fisher Scientific) для обробки scRNAseq
scRNAseq
Очищені клітини переносили в проточну цитометрію UAB і Single Cell Core і негайно обробляли за допомогою набору для секвенування одноклітинної РНК Chromium 39 (103Genomics) за даними виробника's інструкції.Суспензію клітин підраховували в поєднанні з 103 Суміш хромового реагенту завантажується в мікроскопповuidicодноклітинний розподільний пристрій, у якому відбувається лізис і реверстранскрипція відбувається в мікрокраплях. Отримана кДНКбув ампліфіредагували за допомогою ПЛР і згодом обробляли для отримання виходу
бібліотеки секвенування зі штрих-кодом. Секвенування парного кінця проводили на платформі секвенування Illumina NovaSeq6000 або NextSeq500 (Illumina). Зчитування обробленовикористовуючи 103 Програмне забезпечення Genomics Cell Ranger Single-CellПакет версії 6.0 на UAB Cheaha High-PerformanceОбчислювальний кластер. BCLфіфайли були перетворені на FASTQфіза допомогою швидкої функції CellRanger. CellRangerfast використовувався для вирівнювання FASTQфідо спеціального геномущо складається з геному людини hg38 (GRCh38.p13) с
геном SARS-CoV-2 (NC_045512.2), вставлений як екзон (31). Для аналізу були створені таблиця генів, таблиця штрих-кодів і матриці транскрипційної експресіївказані нижче.
Аналіз даних
Аналіз проводився за допомогою пакетів, створених для середовища статистичного аналізу R (версія 4.06). Дані були в основному проаналізовані у версії Seurat 3.2.3 (32,33) і їїасоційовані залежності. Дані від кожного пацієнтабули імпортовані за допомогою Read103 функції, а потім структурперетворили на об’єкт Seurat за допомогою CreateSeuratObject. дляконтроль якості, кількість комірок з унікальними властивостями перевищує 2500або менше 200 і клітини з мітохондріальними пропорціями.15% булифівідфільтровано. Дані були нормалізовані за допомогою журналуНормалізуйте та масштабуйте для підготовки до лінійних розмірівскорочення. Об'єкти окремих пацієнтів були поміченіз унікальним ідентифікатором групифікатіонів, а потім об'єдналися в aодин об’єкт за допомогою функції злиття Seurat. Пацієнт Семpless були інтегровані з функцією RunHarmony за допомогоюпакет Harmony R (34). Аналіз головних компонентбуло виконано, а потім клітини були кластеризовані на основідиференціальна експресія генів, визначена SeuratДля функції FindAllMarkers встановлено роздільну здатність одиниці. Dimenредукцію проводили за допомогою рівномірного різноманіттяапроксимація та проекція. Типи клітин були ідентичніфівидшляхом порівняння диференціально експресованих транскриптів длякожен кластер з відомими транскриптами, пов'язаними з видфіc типи клітин (29,35,36). Для запуску використовувався пакет Escape RАналіз збагачення набору генів (GSEA) (37). WebGestaltRвикористовувався для аналізу генної онтології для ідентифікації шляхіввикористовуючи Біологічний процес і Кіотську енциклопедіюБази даних Genes and Genomes (38).
