Селективна цитотоксичність рослинної речовини актеозиду проти пухлинних клітин та її механізм
Mar 14, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Крістіна Хеймоніді та ін
АНОТАЦІЯ
Натуральні продукти характеризуються надзвичайною структурною різноманітністю, тому вони є унікальним джерелом для ідентифікації нових протипухлинних засобів. Тут ми повідомляємо, що рослинна речовинаактеозидвиділення передовими фітохімічними методами з листя Lippia citriodora показало підвищену цитотоксичність проти метастатичних пухлинних клітин; діяв у синергії з різними цитотоксичними агентами та сенсибілізував хіміорезистентні ракові клітини.Актеозидне був токсичним у фізіологічних клітинних контекстах, у той час як він збільшував окисне навантаження, впливав на активність протеостатичних модулів і пригнічував матриксні металопротеїнази в клітинних лініях пухлин. Внутрішньоочеревинне або пероральне (через питну воду) введення актеозиду на мишачій моделі меланоми посилювало регуляцію антиоксидантних реакцій у пухлинах; однак лише внутрішньоочеревинна доставка пригнічувала ріст пухлини та індукувала протипухлинну реакцію імунної відповіді. Мас-спектрометричний ідентифікаційний/кількісний аналіз показав, що внутрішньоочеревинна доставкаактеозидпризвело до значно вищої, ніж при пероральному введенні, концентрації сполуки в плазмі та пухлинах оброблених мишей, що свідчить про те, що її протипухлинна дія in vivo залежить від шляху введення та досягнутої концентрації в пухлині. Нарешті, це показали дослідження молекулярного моделювання та аналізи ферментативної активностіактеозидінгібує протеїнкіназу С. Зрештою, актеозид є перспективним хімічним каркасом для розробки нових протипухлинних засобів.
Ключові слова:Актеозид, Рак, Природна сполука, Окислювальний стрес, Протеостаз, Імуномодуляція
1. Введення
Канцерогенез характеризується дерегуляцією кількох клітинних сигнальних шляхів і пов’язаний із посиленням клітинного окисного, реплікативного, метаболічного, генотоксичного та протеотоксичного стресу [1]. Для адаптації та подолання цих стресових фенотипів злоякісні клітини посилюють регуляцію (крім онкогенів) кількох неонкогенних шляхів, спрямованих на придушення або (принаймні) полегшення поточного стресу. Серед різноманітних неонкогенних шляхів, які часто посилюються під час пухлиногенезу, є модулі мережі протеостазу (PN) разом із клітинними антиоксидантними відповідями [2,3].
Ключовими компонентами PN є два основні механізми деградації, а саме шлях аутофагія-лізосома (ALP) і шлях убіквітин-протеасома (UPP), а також мережа клітинних молекулярних шаперонів. ALP головним чином бере участь у деградації білкових агрегатів і пошкоджених органел [4], тоді як UPP руйнує нормальні короткоживучі білки та невідновлювані неправильно згорнуті або розгорнуті білки [5–8]. 26 сеукаріотична протеасома складається з 19S регуляторних частинок (RP) і 20 Score частинок (CP); останнє складається з чотирьох складених гептамерних кілець (два -типу оточують два -типу), які утворюють бочкоподібну структуру. Хімотрипсиноподібна (CT-L), трипсиноподібна (TL) та каспазоподібна (CL) протеасомна пептидазна активність розташована на 5, 2 та 1 субодиницях протеасоми відповідно [6]. Продемонстрована клінічна ефективність інгібіторів протеасоми Бортезоміб (Velcade®; також називається PS-341) і Карфіфілзоміб проти різних гематологічних злоякісних новоутворень [9] забезпечила «підтвердження концепції» націлювання на UPP як багатообіцяючу стратегію для лікування раку. Складна мережа шляхів клітинного антиоксидантного захисту, яка часто посилюється під час канцерогенезу [3,10], включає антиоксидантні ферменти, а також кілька факторів транскрипції, які мобілізують цитопротекторні геномні реакції; вони включають вилкоподібну коробку O (Foxo) і еритроїдний фактор 2-пов’язаний з ядерним фактором (Nrf-2). Nrf-2 відіграє центральну роль у захисті клітин від окислювального та/або ксенобіотичного пошкодження, оскільки він стимулює експресію генів антиоксидантів і фази II [11-13].
Ми та інші нещодавно припустили, що націлювання на ці пухлинні залежності (тобто на протеостатичні модулі та/або шляхи антиоксидантної відповіді) або підвищення клітинних рівнів АФК у контексті трансформованого генотипу пропонує потенційне терапевтичне вікно для селективного знищення пухлинних клітин [3]. ,14]; на підтримку, повідомлялося про селективне знищення ракових клітин маленькою молекулою, яка посилювала клітинні рівні ROS [2]. Очікується, що комбінаторні підходи, включаючи також активацію протипухлинної реактивної імунної відповіді [15], ймовірно, максимізують терапевтичне вікно, запропоноване інгібуванням PN та антиоксидантних відповідей та/або підвищенням клітинних рівнів ROS.
Натуральні продукти (екстракти або чисті сполуки) (НП) з різних джерел (рослини, морські організми, мікроорганізми тощо) перевіряються на їх здатність діяти як протипухлинні агенти через їх надзвичайну структурну різноманітність і хімічну складність, а також через те, що вони діють плейотропно, модулюючи кілька клітинних сигнальних шляхів [16]. За повідомленнями, НЧ активують протизапальні, протипухлинні та/або антиметастатичні реакції [16,17], а також уникають резистентності до множинних лікарських засобів [18,19]. Серед них фенольні сполуки (включаючи фенілетаноїдні глікозиди) викликають значний інтерес через їх роль у профілактиці та/або лікуванні різних захворювань людини.
Актеозид, також званий усаз або вербаскозид [20], є фенілетаноїдним глікозидом, виділеним з багатьох дводольних. Повідомляється, що актеозид має деякі цікаві біологічні властивості, включаючи антиоксидантні, протизапальні та регулюючі апоптоз клітин властивості [21,22]. Тим не менш, його потенційна протипухлинна активність не була розглянута. Ми повідомляємо тут, що актеозид продемонстрував підвищену цитотоксичність проти ракових клітин ссавців без видимих токсичних ефектів у фізіологічних клітинних контекстах. Крім того, актеозид пригнічував ріст пухлини меланоми на мишачій моделі Vivo шляхом (серед іншого) активації протипухлинної імунної відповіді.
2. Матеріали та методи
2.1. Рослинна сировина та екстракція
сушене листя Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 кг) було придбано на місцевому ринку в Афінах, Греція. Листя подрібнювали та екстрагували механічним перемішуванням протягом 12 годин метанолом (2 × 20 л). Метанольний екстракт випарювали насухо і промивали сумішшю CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 л). Нерозчинний залишок відокремлювали та сушили, отримуючи зелено-жовтий порошок (450 г).
2.2. Очищення актеозиду та аналіз UPLC-HRMS
Частину (10 г) вищезазначеного залишку піддавали протитоковій хроматографії з використанням апарату швидкої відцентрової розподільчої хроматографії (FCPC) (Kromaton, Франція); суміш EtOAc/EtOH/H2O у співвідношенні 5/0,5/4,5 використовували як двофазну систему розчинників. Зібрані фракції піддавали тонкошарової хроматографії; потім хроматограми спостерігали в УФ-лампі (254 і 365 нм) і візуалізували розпиленням метанолу ванілінсульфату з наступним нагріванням протягом двох хвилин. Всього 2,1 г актеозиду (чистота більше або дорівнює 90 відсоткам) було виділено за допомогою вищезгаданого процесу. Ідентифікацію актеозиду проводили за допомогою спектрів ядерного магнітного резонансу (ЯМР) та мас-спектрометрії (МС), а його чистоту встановлювали за допомогою UPLC-MS та ЯМР-аналізу; для детальної інформації див. Матеріали та методи.
2.3. Клітинні лінії
Ембріональні фібробласти легень людини (клітини IMR90) разом із клітинними лініями мишей B16.F1, B16.F10, YAC-1 і WEHI-164 були отримані з Американської колекції культур тканин (ATCC). Клітинні лінії людської остеосаркоми U2 OS і Sa OS були люб’язно надані професором В. Горгоулісом (Школа медицини, Національний і Каподистрійський університет Афін, Греція), тоді як клітини остеосаркоми KH OS і клітинні лінії хіміорезистентної остеосаркоми [23] були надані в дар пожертвування доктора Е. Гоноса (Національний грецький дослідницький фонд, Греція). Лінії ракових клітин мишей C5N і A5 належать до багатоступінчастої моделі канцерогенезу шкіри мишей [24,25] і були надані професором А. Бальменом (Комплексний онкологічний центр Каліфорнійського університету, США). Умови культивування використаних клітинних ліній описані в Додатку. Матеріали та методи.
користь відцистанхе актеозид
2.4. Мишача модель меланоми самець
Мишей C57BL/6 (25–30 г ваги, віком 6–8 тижнів) було отримано з Грецького Інституту Пастера та утримували при контрольованій температурі (22 градуси) та світловому періоді (12 годин світла:12 годин темряви). ) з вільним доступом до води та їжі. Мишам підшкірно вводили 105 клітин меланоми B16.F1 (у 100 мкл PBS) і випадковим чином розподіляли на 3 групи (n=5/групу). Коли пухлини стали відчутними (день 11), миші отримували актеозид двома шляхами; або внутрішньоочеревинно (IP) (1 мг/миша, розведений у 200 мкл PBS; загалом 6 доз через день) або перорально, запиваючи водою (OR) (2,5 мг/миша; загалом 13 доз протягом 13 днів поспіль). Контрольним мишам вводили PBS. Ріст пухлини реєстрували кожні 2 дні шляхом вимірювання цифровим штангенциркулем великої та малої осей утворених пухлин. Вимірювання трансформували в об’єм пухлини за формулою: об’єм пухлини (см3)=велика вісь × мала вісь2 × 0,5. На 28 день тварин евтаназували шляхом вивиху шийки матки, а селезінки асептично видаляли. Експеримент повторювався тричі з однаковими результатами.
Спленоцити були виділені з індивідуально гомогенізованих селезінок і негайно перевірені на їх цитотоксичність порівняно з клітинами-мішенями B16.F1, YAC-1 і WEHI-164. Цитотоксичність оцінювали на основі виявлення експозиції CD107 на поверхні клітини в результаті дегрануляції ефекторних клітин. Спленоцити (105 клітин/лунку) культивували спільно з мішенями в 96-лункових U-планшетах з U-донним мікропланшетом у співвідношенні ефектор-мішень (E:T) 100:1, при 37 градусах у 5-відсотковому CO2. Кон’юговані з FITC моноклональні антитіла до CD107a та CD107b (25 мкл/мл) і монензин (6 мкл/мл; усі від BD Biosciences) додавали в кожну лунку. Клітини збирали через 6 годин і аналізували за допомогою проточного цитометра FACSCanto II. Паралельно пухлини вирізали та обробляли для наступних аналізів, як описано в Додатку. Матеріали та методи.
цистанхе актеозид
