Аскорбінова кислота регулює імунітет, захист від окислення та апоптоз вушок Haliotis Discus Hannai Ino Частина 2

3.5. Експресія імунозалежних генів і білків у травній залозі та зябрах морського вушка

Глікозид цистанхи може також підвищувати активність СОД у тканинах серця та печінки та значно знижувати вміст ліпофусцину та МДА в кожній тканині, ефективно поглинаючи різні реактивні кисневі радикали (OH-, H₂O₂ тощо) та захищаючи від пошкодження ДНК, спричиненого ОН-радикалами. Фенілетаноїдні глікозиди Cistanche мають сильну здатність поглинати вільні радикали, вищу відновну здатність, ніж вітамін С, покращують активність СОД у суспензії сперми, знижують вміст МДА та мають певний захисний ефект на функцію мембрани сперми. Полісахариди цистанхе можуть підвищувати активність SOD і GSH-Px в еритроцитах і легеневих тканинах експериментально старіючих мишей, викликаних D-галактозою, а також знижувати вміст MDA і колагену в легенях і плазмі і підвищувати вміст еластину, мають хороша очищувальна дія на DPPH, подовжує час гіпоксії у старіючих мишей, покращує активність СОД у сироватці та затримує фізіологічну дегенерацію легенів у експериментально старіючих мишей. Експерименти показали, що цистанша має хорошу антиоксидантну здатність до клітинної морфологічної дегенерації. і має потенціал бути лікарським засобом для запобігання та лікування хвороб старіння шкіри. У той же час ехінакозид у Cistanche має значну здатність поглинати вільні радикали DPPH і має здатність поглинати активні форми кисню та запобігати індукованій вільними радикалами деградації колагену, а також має хороший ефект відновлення при пошкодженні аніонів вільних радикалів тиміну.

Натисніть Cistanche Reddit для боротьби зі старінням

【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Рівні мРНК ключових генів у сигнальному шляху toll-подібного рецептора (TLR) у травній залозі морського вушка показано в таблицях 6 і 7. Рівні експресії tlr2 і tlr4 у травній залозі були значно знижені (p < { {5}}.05) і мали найнижчі рівні в AA1000 і AA500{{43 }} груп відповідно (табл. 6). Рівень мРНК а-а значно підвищувався (p < 0.05), а на-b не впливали градуйовані рівні дієтичного AA (p > 0).05 ). Експресія myd88, молекули-адаптора, пов’язаної з трипом (tram), кінази 4, пов’язаної з рецептором інтерлейкіну 1 (irak4), і фактора, пов’язаного з рецептором фактора некрозу пухлини 6 (traf6), була значно знижена після харчових добавок AA (p <0,05). На traf4 не впливав рівень добавок AA (p> 0,05). Рівні мРНК iκb кінази (ikk) та інгібітору nf-κb (iκb) у травній залозі морського вушка не зазнали впливу дієтичного АА (p > 0,05) (Таблиця 7). Проте, експресія р38 мітоген-активованої протеїнкінази (мітка р38) і сміття значно знижувалася зі збільшенням дієтичного АА (р <0,05). Дієтичний AA міг значно знизити рівні експресії nf-κb, білка-активатора 1 (ap-1) і фактора некрозу пухлини (tnf-) (p <0,05), а рівень інтерлейкіну 16 (il 16) не був за умови дієтичного АА (p > 0,05). Експресія білка MyD88, JNK, зрілого IL-1 і ядерного NF-κB p65 показана на малюнку 2. Рівні білка MyD88, зрілого IL-1 і ядерного NF-κB p65 у травному тракті залози морського вушка були значно знижені дією AA (p <0,05). Навпаки, на рівень білка JNK не впливав AA (p > 0,05).

Рівні мРНК tlr2, tlr4 і the-b в зябрах морського вушка істотно не відрізнялися (p > 0.05), а рівень tar-a був значно знижений після градуйованих рівнів дієтичного АА (p < 0.05) (табл. 8). Крім того, рівень експресії myd88, irak4 і traf6 у зябрах морського вушка значно знижувався зі збільшенням рівня дієтичного AA (p < 0.{{20}}5). Натомість суттєвих відмінностей у виразах tram і traf4 не спостерігалося (p > {{30}}.05). Дієтичний АА значно знижував рівень мРНК ikk (p < 0,05), а експресія iκb, р38 мітки та сміття в зябрах не зазнавала впливу АА (p > 0,05) (Таблиця 9). Односторонній дисперсійний аналіз виявив, що рівні експресії nf-κb, ap-1 і tnf- були значно знижені під дією дієтичного AA (p < 0,05), і не спостерігалося істотної різниці в рівнях il 16 (p > 0,05). Рівні білка MyD88 і ядерного NF-κB p65 були значно знижені градуйованими рівнями харчової AA (p <0,05) (Рис. 3). Проте на експресію білка JNK і зрілого IL-1 у зябрах морського вушка не вплинула харчова AA (p > 0,05).

Експресії -дефензину, міфотворення 6 та аргінази-I в травній залозі та зябрах морського вушка наведено в таблиці 10. Рівні -дефензину та аргінази-I в травній залозі були значно підвищені після дієтичного АА (p < 0.05), тоді як експресія міфотворчості 6 не зазнавала впливу дієтичного АА (p > 0,05). Навпаки, рівні мРНК -дефензину та аргінази-I в зябрах істотно не відрізнялися, а експресія міфотворчості 6 значно посилювалася дією AA (p <0,05).

3.6. Експресія імунозалежних генів у травній залозі у відповідь на Vibrio Parahaemolyticus

Рівні експресії кількох критичних генів у сигнальному шляху TLR, що містить tlr4, myd88, tram, nf-κb, ap-1 і tnf- у травній залозі морського вушка після інфікування V. parahaemolyticus, представлені на рисунку 4. Експресії мРНК tlr4, myd88, tram, nf-κb, ap-1 і tnf- були значно підвищені після введення V. parahaemolyticus (p < 0.05). Кратність зміни tlr4 була найвищою в групі AA0 (10.24-раз) через 24 години після інфікування, а згодом найвищий рівень знизився до 3.{{ 20}}складка в групі AA5000 о 6 год. Рівень мРНК myd88 значно підвищувався через 12–72 години в групі AA0 (у 6.86-разів) і через 6–12 годин у групі AA5000 (у 3.88-рази) після V. парагемолітична інфекція. Експресія tram у травній залозі морського вушка після інфікування V. parahaemolyticus значно зросла від 12 до 72 годин у групі AA0 та від 12 до 24 годин у групі AA5000. Кратність зміни nf-κb досягла найвищого рівня через 48 годин у групі AA0 (10.55-разів), після чого відбулося зниження найвищого рівня через 12 годин у групі AA5000 (3.{{48). }}згорнути зміну). Рівень експресії ap-1 значно підвищувався від 6 годин до 72 годин у групах AA0 і AA50, перш ніж відновитися до нормального рівня через 72 години після безперервного прийому добавок AA. Кратність зміни TNF- досягла свого піку через 24 години після інфекції V parahaemolyticus у групах AA0, AA50, AA100, AA200 і AA500 і мала найвищий рівень через 12 годин у групах AA1000 і AA5000.

Результати рівнів -дефензину та міфотворчості 6 у травній залозі після інфікування V. parahaemolyticus показані на рисунку 5. Рівні експресії -дефензину та міфотворення 6 у травній залозі морського вушка були значно підвищені після інфікування V. parahaemolyticus ( p < 0.05). Рівень мРНК -дефензину значно підвищувався в групах AA0, AA50, AA100 і AA200 через 12 годин і 24 години, і досяг свого піку через 12 годин у групах AA200, AA500, AA1000 і AA5000 з 4 .51-складка, 4.74-складка, 5.20-складка та 5.47-складка відповідно. Зміна кратності міфотворчості 6 у травній залозі морського вушка була значно підвищена з 12 годин до 24 годин у групах AA0, AA50, AA100, AA200 і AA500, і від 6 годин до 72 годин у групах AA1000 і AA5000. Найвищий рівень експресії міфотворення 6 спостерігався через 12 годин у групі AA5000 у 5.82-раз.

3.7. Експресія генів і білків, пов'язаних з антиокисленням і апоптозом, у травних залозах і зябрах

Рівні мРНК фактора, пов’язаного з nf-e2--2 (nrf2), gpx, cat і cuznsod у травній залозі морського вушка були значно підвищені з градуйованими рівнями дієтичного AA (p < {{4 }}.05) (Таблиця 11). Навпаки, рівні мРНК і білка Keap1 були значно знижені після дієтичного АА (p < 0.05), а глутатіон-s-трансфераза (GST) не зазнавала впливу АА (рис. 6, табл. 11) (p > 0.05). У зябрах рівні мРНК nrf2 і gpx були значно збільшені за допомогою дієтичного AA (p <0,05) (Таблиця 11). Проте експресія keap1, cat, GST і cuznsod у зябрах не підлягала градуйованим рівням харчової AA (p> 0,05). Не спостерігалося значного впливу дієтичного АА на експресію білка Keap1 у зябрах морського вушка (p > 0,05) (Рис. 6).

Що виділяється в таблиці 12, так це те, що рівні експресії Bax і caspase3 у травній залозі морського вушка були значно знижені після градуйованих рівнів дієтичного AA (p < 0.05). Водночас рівень мРНК bcl-2 значно підвищився (p < 0.05). Проте на експресію каспази7 не впливала дієтична АА (p > 0.{{20}}5). Розщеплений білок caspase3 у травній залозі був значно знижений після додавання AA (p <0,05) (Рис. 6). У зябрах рівні мРНК каспази7 та bcl-2 були значно знижені та збільшені, відповідно, після дієтичного AA (p <0,05) (таблиця 12). Тим не менш, експресії Bax і caspase3 істотно не відрізнялися серед усіх методів лікування (p> 0,05). Крім того, на експресію білка розщепленої каспази3 в зябрах морського вушка не вплинули градуовані рівні дієтичного AA (p> 0,05) (Рис. 6).

4. Обговорення

4.1. Вміст аскорбінової кислоти в різних тканинах

У цьому дослідженні вміст АК у м’язах, зябрах і травних залозах збільшувався зі збільшенням рівня АК в їжі. Подібний результат також був знайдений у Вунду (Heterobranchus logfiles), японського вугра та горбаля Чу (колір Nibea) [27,56,57]. Вміст АК був найвищим у зябрах, а потім у травних залозах морського вушка. Однак вміст АК у зябрах, травній залозі та м’язах морського вушка не досяг свого насичення після 4821,17 мг/кг харчової АК. У китайського сосальщика (Myxocyprinus asiaticus) вміст АК у печінці значно збільшувався під дією АК [58]. Підвищення вмісту АК у печінці китайського сосальщика після дієтичного АК корелювало зі здоров’ям печінки. У білого амура вміст АК у головній нирці, селезінці та шкірі значно підвищувався зі збільшенням харчових добавок АК [35]. Головна нирка, селезінка та шкіра є важливими імунними органами водних тварин [59–61]. Ці результати демонструють, що підвищений вміст АК у травній залозі та зябрах морського вушка було тісно пов’язане зі здоров’ям морського вушка після дієтичного АК і що накопичення АК відображає рівні впливу АК з їжею.

4.2. Роль аскорбінової кислоти в регуляції імунітету вушка

Гемоцити, як різноманітні клітинні компоненти гемолімфи в молюсків, відповідають за багато аспектів життя молюсків, таких як імунна відповідь, біомінералізація, міжклітинна комунікація та регенерація [62,63]. Тому ТГК, РБ і ПА гемолімфи можуть безпосередньо відображати імунітет організму. АА була тісно пов’язана з THC, RB і PA гемоцитів, що призводило до активації адаптивної імунної системи [64,65].

У цьому дослідженні вміст ТГК, RB і PA в гемолімфі морського вушка було значно збільшено під дією AA. Вказано, що градуйовані рівні дієтичного АА досягли успіху в посиленні імунної функції морського вушка. Подібні результати спостерігалися у нільської тілапії та трав’яної креветки (Penaeus monodon) [64,66]. RB у сироватці червоного болотного рака (Procambarus clarkii) та PA у сироватці гібридного сорубімного сома (Pseudoplatystoma reticulatum × P. corpuscles) були значно знижені після високого рівня харчових добавок АА (321,38 мг/кг та 850 мг/кг). кг відповідно) [67,68]. Однак не спостерігалося істотного зниження вмісту ТГК, РБ і ФА в гемолімфі морського вушка під час лікування високими рівнями дієтичних добавок АА (4821,17 мг/кг).

Лізоцим, С3 та С4 відіграють ключову роль у вродженому імунітеті та захищають тварин від патологічної інфекції [69–71]. У цьому дослідженні LZM у CFH морського вушка значно збільшився після градуйованих рівнів дієтичного AA. Це було подібно до результатів попередніх досліджень кобії (Rachycentron canadum), корейського морського окуня (Sebastes schlegelii) і морського окуня (Epinephelus malabaricus) [29,72,73]. Дефіцит АК знижує вміст С3 і С4 у білого амура, а дієтична АА може значно підвищити імунні параметри, такі як С3 і С4 у великоротого окуня [35,74]. Однак у цьому дослідженні вміст С4 у CFH морського вушка не зазнав впливу харчових рівнів АА. Спостерігалася тенденція до збільшення вмісту C3 у CFH вушок, хоча вміст C3 не був суттєво покращений дієтичним AA. Ці результати показали, що харчові добавки AA можуть посилити здатність усувати інфекцію патогенів LZM і C3, а не C4, щоб покращити імунні бар’єри морського вушка.

Вроджений імунітет життєво важливий для вушок через відсутність адаптивного імунітету у безхребетних [43,49]. TLR відіграють життєво важливу роль у вродженій імунній системі проти різних мікробів [75]. PAMP-активовані TLR рекрутують специфічні молекули-адаптори для активації факторів транскрипції, таких як NF-κB і AP-1, які визначають результат вродженої імунної відповіді [76]. Передача сигналів TLR класифікується за двома різними шляхами: залежним від MyD88- і незалежним від MyD88-, які індукують різні цитокіни, такі як TNF- та IL-1 у ссавців та інших водних тварин [77,78]. ]. У MyD88-залежному шляху MyD88 взаємодіє з IRAK4, а потім із TRAF6 [79]. TRAF6 може активувати TGF- -активовану кіназу 1 (TAK1) і TAK1-зв’язувальні білки (TAB) [80]. TAK1 активує комплекс IKK, який може фосфорилювати IκB, який зв’язується з субодиницями NF-κB (що складається з p50 і p65), і фосфорилювати MAPK і JNK, що сприяє транслокації AP-1 в ядро ​​[81]. Руйнування IκB сприяє ядерній транслокації NF-κB [82]. Ядерний NF-κB і AP-1 націлені на транскрипцію цитокінів, таких як TNF- та IL-1, які добре відомі як прозапальні медіатори, що сприяють запаленню [76,77,83] . У MyD88-незалежному шляху необхідний TRAM, який відіграє ключову роль у цьому шляху [84]. Внутрішньоклітинні компоненти, розташовані нижче за сигнальний шлях TLR, зазвичай і висококонсервовані у хребетних і безхребетних [60,85]. Внутрішньопечінкова експресія TLR4 була знижена у мишей, які отримували AA (Mus musculus) [86]. АА виявляв сприятливий гепатопротектор проти конканаваліну A-індукованого імунологічного ураження печінки у мишей шляхом інгібування сигнального шляху NF-κB [87,88]. Таким чином, з цих результатів можна зробити висновок, що AA може впливати на сигнальний шлях TLR. Однак залишається невідомим, як AA регулює сигнальний шлях TLR у водних тварин, особливо в молюсків.

У цьому дослідженні рівні мРНК tlr2 і tlr4 у травній залозі були значно знижені градуйованими рівнями дієтичного AA. Припускають, що сигнальний шлях TLR був запущений АА в травній залозі морського вушка (рис. 7). Терм-a і tlr-b мали більш широкі можливості розпізнавання образів і брали участь в антибактеріальному та противірусному імунітеті морського вушка [89]; однак основний механізм -a/b досі невідомий. Однак на рівень tlr-b не вплинув дієтичний AA, і tlr-a значно підвищувався AA в цьому дослідженні. Потрібні подальші дослідження. Експресія myd88, irak4 і traf6, а також експресія білка MyD88 у травній залозі морського вушка були знижені за допомогою добавок AA, і на рівень traf4 не впливав дієтичний AA. TRAF4 діє як глушник у опосередкованій TLR сигналізації, пригнічуючи TRAF6 [90]. Вказано, що інгібування шляху TLR дієтичним AA не було опосередковано через traf4 у травній залозі морського вушка. Рівень мРНК iκb у травній залозі не зазнав впливу АА. Однак NF-κB може бути переданий до ядра лише після деградації IκB фосфату [91]. Експресія мРНК nf-κb і експресія білка ядерного NF-κB p65 у травній залозі були значно знижені дією AA. Ці результати свідчать про те, що AA може пригнічувати фосфорилювання білка IκB для зменшення ядерного NF-κB. IKK може активувати NF-κB p65 для запуску канонічного шляху NF-κB, а IKK може активувати NF-κB p52 для запуску неканонічного шляху NF-κB [92]. Вказано, що дієтична АА може активувати канонічний шлях NF-κB у травній залозі морського вушка. Крім того, експресія мРНК tram, p38 mark, junk, ap-1 і tnf-, а також рівень білка зрілого IL-1 були значно знижені дієтичним AA. Ці результати свідчать про те, що дієтична АА може пригнічувати сигнальний шлях TLR через Myd88-залежний шлях через NF-κB, p38 mark/ap-1 і JNK/ap-1, і Myd{{ 43}}незалежні шляхи полегшення запалення в травній залозі морського вушка. У зябрах AA також впливав на шлях передачі сигналу TLR (рис. 7). Однак рівні мРНК трамваю, мітки p38 та експресії сміття та білка зрілого IL-1 істотно не відрізнялися. Ці результати вказують на те, що дієтична AA може пригнічувати сигнальний шлях TLR через Myd88-залежний шлях, а не MyD88-незалежний. Інгібований шлях TLR полегшував запалення в зябрах морського вушка через шлях NF-κB і p38 mark/ap-1, а не шлях JNK/ap-1. Дієтичний AA мав сильніший вплив на шлях TLR у травній залозі, ніж у зябрах морського вушка.

【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】