Модулююча дія ROS поліфенолів брусниці (Vaccinium Vitis-idaea L.) на гіпертрофію адипоцитів із ожирінням та дисфункцію ендотелію судин, частина 1

Будь ласка, натиснітьoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація:Окислювальний стрес і нерегульована секреція адипоцитокінів, що супроводжує гіпертрофовану жирову тканину, викликають хронічне запалення, що призводить до дисфункції ендотелію судин. У цьому дослідженні досліджували здатність фракцій антоціанів (ACN) і неантоціанових поліфенолів (PP) із плодів брусниці пом’якшувати гіпертрофію жирової тканини та ендотеліальну дисфункцію з використанням адипоцитів 3T3-L1 і ендотеліальних клітин пупкової вени людини (HUVEC). Це дослідження показало, що фракція РР знижує внутрішньоклітинну генерацію АФК у гіпертрофованих адипоцитах шляхом посилення експресії антиоксидантного ферменту (SOD2) та інгібування експресії окисного ферменту (NOX4, iNOS). Крім того, фракції PP і ACN знижували вміст тригліцеридів в адипоцитах, що супроводжувалося зниженням експресії ліпогенних генів, таких як aP2, FAS і DAGT1. Обробка обома фракціями модулювала експресію мРНК і секрецію білка ключових адипокінів у гіпертрофованих адипоцитах. Експресія та секреція лептину та адипонектину були відповідно зниженими та активними. Крім того, фракції PP і ACN пом’якшували запальну відповідь у HUVEC, індукованих TNF- -, шляхом пригнічення експресії прозапальних генів (IL-6, IL-1) і молекул адгезії (VCAM{{ 14}}, ICAM-1, SELE). Отримані результати свідчать про те, що вживання багатих на поліфеноли плодів брусниці може допомогти запобігти та лікувати ожиріння та ендотеліальну дисфункцію завдяки їхній антиоксидантній та протизапальній дії.

Ключові слова:поліфеноли; антоціани;брусниця; антиоксидантний потенціал; проти ожиріння; протизапальні ліки;екстракт цистанки трубчастої;3T3-Ll адипоцити; гіпертрофія;адипокіни; ендотеліальна дисфункція

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

1. Введення

Ожиріння є незалежним фактором ризику серцево-судинних захворювань і однією з основних причин підвищення ризику розвитку дисліпідемії, інсулінорезистентності, гіпертонії та атеросклерозу як у дорослих, так і у дітей [1]. При ожирінні біла жирова тканина (WAT) через надмірне накопичення жиру в гіпертрофованих адипоцитах стає дисфункціональною, що призводить до хронічного запалення, окислювального стресу та порушення регуляції секреції адипокінів, що сприяє розвитку цукрового діабету 2 типу, а також незалежно пов’язане з коронарною ендотеліальною дисфункцією [2]. ,3]. Гіпертрофічні адипоцити є суттєвим фактором, що пов’язує позитивний енергетичний баланс, цукровий діабет і кардіометаболічні захворювання [2]. WAT діє як ендокринний орган і через секретовані адипокіни та цитокіни опосередковує перехресні переговори між вісцеральним або підшкірним WAT і серцево-судинними тканинами.Cistanche tubulosa redditАдипокіни, такі як лептин, адипонектин і резистин, цитокіни, TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 і MCP-1, а також активні форми кисню та азоту ( ROS та RNS) впливають на розвиток ендотеліальної дисфункції через прямі та непрямі механізми [4]. Крім того, периваскулярна жирова тканина (PVAT), головним чином у людей з ожирінням, сприяє локальному запаленню та порушенню функції ендотелію.

PVAT сприяє судинному гомеостазу, виробляючи вазоактивні сполуки, такі як адипокіни, ROS та оксид азоту (NO). Секретуючи широкий спектр біологічно активних молекул, PVAT впливає на скорочення, проліферацію та міграцію гладком’язових клітин судин [4].

Цистанхе може підвищити імунітет

Ендотеліальні клітини, які вистилають внутрішню стінку судинної системи, регулюють гомеостатичні функції, і їх дисфункція є раннім предиктором атеросклерозу та серцево-судинних захворювань [5]. Окислювальний стрес сприяє активації ендотеліальних клітин, готуючи їх до адгезії, інфільтрації та активації імунних клітин, що призводить до слабкого фенотипу запалення в судинній системі [5,6]. АФК можуть змінювати залежну від ендотелію релаксацію судин шляхом посилення деградації NO [6]. Ендотеліальну дисфункцію можна повернути назад, що може затримати або навіть запобігти прогресуванню атеросклерозу та покращити артеріальну функцію та зменшити частоту серцево-судинних подій I5]. Недавні клінічні дослідження продемонстрували, що нефармакологічні та фармакологічні методи лікування ожиріння та інсулінорезистентності покращують функцію ендотелію та зменшують запалення низького ступеня [7]. Ці результати показали зв'язок між ожирінням, інсулінорезистентністю та ендотеліальною дисфункцією; тому зниження патологічної функції адипоцитів при ожирінні повинно бути метою профілактики серцево-судинних захворювань. Терапевтичні та харчові стратегії, які зменшують окислювальний стрес і запалення в гіпертрофованій жировій тканині, можуть стати ключовою мішенню для запобігання серцево-судинним захворюванням [7].

Ягоди є багатим джерелом поліфенолів, таких як флавоноли, фенольні кислоти та антоціани, і епідеміологічні дослідження повідомили про зв’язок між збільшенням споживання ягід і зниженням ожиріння та серцево-судинних захворювань [8]. Ягоди відомі як природні антиоксиданти, а завдяки високому антиоксидантному потенціалу їх все частіше відносять до природних функціональних продуктів [9]. Брусницю класифікують як «суперфрукти», оскільки вони особливо багаті на антиоксиданти, такі як вітаміни С, А та Е (токоферол) і поліфеноли [10]. Дослідження in vitro та in vivo показали різні корисні для здоров’я ефекти брусниці, такі як протизапальна [11], антиоксидантна [11] та антипроліферативна дія [8,9]. Крім того, було показано, що брусниця запобігає ожирінню, спричиненому дієтою, і невеликому запаленню у тварин з діабетом [12]. Наше попереднє дослідження показало протизапальний потенціал водного екстракту ліофілізованих плодів брусниці [11]. Екстракт регулював експресію прозапальних (IL-6, MCP-1 та IL-1) і протизапальних (IL-10) генів у запаленому TNF{{20} }індукував адипоцити 3T3-L1 і пригнічував запальну відповідь в активованих макрофагах RAW 264.7 шляхом зниження експресії прозапальних медіаторів (TNF-, IL-1, IL-6, MCP{{30) }}, iNOS, COX-2). Крім того, значні антиоксидантні ефекти спостерігалися в запалених адипоцитах, оброблених екстрактом плодів брусниці. Внутрішньоклітинне накопичення АФК зменшилося в результаті посиленої експресії ферментів антиоксидантного захисту (SOD, каталази, GPx) і пригніченого прооксидантного ферменту (NADPH оксидази 4) [11].

У цьому дослідженні досліджували здатність фракції антоціану (ACN) плодів брусниці та фракції неантоціанового поліфенолу (PP) запобігати та лікувати гіпертрофічне ожиріння та ендотеліальну дисфункцію, імітовану в моделях in vitro. Вплив фракцій ACN і PP на молекулярні шляхи окислювального стресу, запалення та нерегульованої секреції адипокінів аналізували в гіпертрофованих 3T3-L1 адипоцитах із ожирінням. Захисний потенціал проти ендотеліальної дисфункції оцінювали за допомогою TNF-x-індукованих ендотеліальних клітин пупкової вени людини (HUVEC).

2. Матеріали та методи

2.1. Приготування антоціанових і неантоціанових поліфенольних фракцій

Заморожені плоди брусниці (Vaccinium Vitis-idea L.), отримані від компанії DANEX (PHU "DANEX", Wielen, Польща), гомогенізували до фруктової м’якоті, яку згодом заморожували при -80 ступені та піддавали сублімаційному сушенню. відповідно до процедури, описаної раніше [11]. Фруктовий порошок суспендували у водному розчині 0.75% (об./об.) оцтової кислоти. Співвідношення твердих речовин (г) і екстрагенту (мл) становило 1:10. Після перемішування у вихровому змішувачі протягом 30 с суспензію поміщали в звукову ванну (5 хв, 20 градусів). Знову екстракційну суміш перемішували у вихровому змішувачі протягом 30 с і залишали стояти при 20 градусах.

Через 10 хвилин зразок центрифугували при 3600×g (10 хвилин, 20 градусів), і отриманий супернатант збирали. Свіжий екстрагент виливали в залишки твердих речовин, щоб розпочати другу стадію екстракції. Процедура другого етапу була такою ж, як і першого. Екстракти обох стадій об’єднували та центрифугували при 12,000×g для видалення крихітних залишків фруктів.

На наступному етапі приготування фракції проводили видалення з екстракту цукрів та органічних кислот. Розділення проводили за допомогою хроматографічної системи AKTA Explorer 100 Air (GE Healthcare, Чикаго, Іллінойс, США), оснащеної скляною колонкою XK 26/20 (GE Healthcare, Чикаго, Іллінойс, США). ). Колонку заповнювали 40 мл макропористої адсорбуючої смоли Amberlite XAD-7 HP (DuPont, Wilmington, DE, USA). Перед занесенням у колонку розчин (50 мл екстракту, отриманого на стадії екстракції) фільтрували за допомогою мембрани шприцевого фільтра з розміром пор 0.45-um (Millex-HV Durapore PVDF) із скловолокнистим попереднім фільтром (Merck). Мілліпор, Берлінгтон, Массачусетс, США). Було застосовано три елюенти: А—5% (об.)мурашиної кислоти, В—метанол і С—0,1% (об.) мурашиної кислоти. Розчини мурашиної кислоти готували змішуванням відповідної кількості мурашиної кислоти з деіонізованою водою. Швидкість потоку елюенту регулювали на 5 мл/хв. Під час розділення застосовувалася наступна хроматографічна програма: врівноваження колонки: 95 відсотків А, 5 відсотків В, 3 CV (об’єм колонки); введення зразка-50 мл екстракту; промивання незв’язаних речовин-1: 100 відсотків C, 6 CV; промивання незв’язаних речовин-2: 100 відсотків A, 1 CV; елюювання: 20 відсотків A, 80 відсотків B, 5 CV; промивка колонки: 100 відсотків B, 2,5 CV.

Весь витік зі стадії елюювання, який показав абсорбцію (контрольовано при λ{{0}}, 320 і 520 нм）, випарювали досуха при 30 градусах за допомогою роторного випарника (контроль Laborota 4003 HB, Heidolph, Німеччина). Тверді речовини розчиняли у водному розчині 0,75% (о/о) оцтової кислоти. Розчин переносили в скляні флакони та заморожували при -85°, а потім поміщали в сублімаційну сушарку Beta {{8 }}(Мартін Кріст, Німеччина). Ліофілізаційне сушіння проводилося протягом 48 год. Фактичне сушіння відбувалося під тиском 10 Па протягом 40 год (20 год при температурі -15 градусів) і 20 год при Остаточне сушіння проводили при температурі 22° протягом 8 год без контролю тиску. Тверді препарати зберігали в герметично закупорених флаконах в атмосфері азоту при -85 С.

Твердий вміст флакона розчиняли у водному розчині 5% (о/о) мурашиної кислоти та фільтрували за допомогою фільтра з розміром пор 0.45- мкм （Merck Millipore）. Відокремлення антоціанів від інших поліфенольних сполук у зразках проводили за допомогою хроматографа AKTA Explorer 100 Air, оснащеного UV/VIS детектором і колонкою Agilent Zorbax SB C18 (250 × 21,2 мм). Розділення проводили при 20 градусах. Швидкість потоку рідкої фази становила 21 мл/хв. Застосовували два елюенти: A-5% (об’єм/об’єм) мурашиної кислоти у воді та B-метанол. Після врівноваження колонки (95 відсотків A, 5 відсотків B, 3 CV) і введення зразка об’ємом 2 мл проводили поділ у комплексному градієнті. Програма градієнта була такою: 5 відсотків B-0.5 CV;20 відсотків B-2 CV;20 відсотків B-1.2 CV;30 відсотків B-3. 5 CV;30 відсотків B-1.2CV;45 відсотків B-3.5 CV;45 відсотків B-1.2CV;100 відсотків B-2.5 CV;100 відсоток B-2.5 CV. Еффлюент з поглинанням при λ=520 нм був зібраний і позначений як фракція антоціану （ACN）. Потік, що показує поглинання при 入=320 нм, також був зібраний і позначений як неантоціанова поліфенольна фракція (PP). Обидві фракції випарювали, розчиняли у водному розчині оцтової кислоти, ліофілізували та зберігали, як описано вище. Усі хімічні речовини, використані для приготування фракцій ACN та PP, були придбані у Sigma-Aldrich (Merck Group, Познань, Польща).

2.2. Ідентифікація та кількісне визначення поліфенолів у фракціях ACN та PP

Поліфенольний склад фракцій ACN і PP аналізували за допомогою методу HPLC-DAD-ESI-MS на системі HPLC серії Agilent 1200 (Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Каліфорнія, США), оснащеній фотодіодним детектором G1315D і підключеним онлайн з системою Agilent 6224 time-of-flight MS. Хроматографічне розділення проводили на колонці 150×2,1 мм, 3-мкм C18 (Advanced Chromatography Technologies, Абердин, Шотландія). Раніше опубліковане дослідження детально описує умови розділення (рухома фаза, програма градієнтного елюювання, швидкість потоку, об’єм введення зразка)[11].

Хроматограми ВЕРХ записували при 280, 325, 355 і 520 нм, рекомендованих для виявлення флаван-3-олів, похідних гідроксикоричної кислоти, флавонолів і антоціанів відповідно.

Поліфенольні сполуки у фракціях ACN та PP кількісно визначені як еквіваленти ціанідин-3-O-глюкозиду (антоціанів), катехіну ((епі)катехіну та проціанідинів), 4-гідроксибензойної кислоти (похідні гідроксибензойної кислоти), ферулової кислоти (похідне ферулової кислоти), хлорогенова кислота (3-O-кофеоілхінова кислота), р-кумарова кислота (похідне кумарової кислоти), тригідроксибензойна кислота-галлова кислота (похідні бензойної кислоти та арбутину) і кверцетин (глікозиди кверцетину) . Усі проби вводили по три рази з незалежно приготовлених розчинів фракцій ACN та PP.

Після проходження через детектор DAD елюат колонки направляли в систему MS, оснащену джерелом електророзпилювальної іонізації (ESI), що працює в режимі позитивних іонів і негативних іонів. Раніше опублікована стаття представляє параметри ESI-MS, що використовуються для ідентифікації фенольних сполук у фракціях ACN та PP [11]. Контроль приладів, збір даних і аналіз здійснювалися за допомогою програмного забезпечення MassHunter B.04.00 (Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Каліфорнія, США). Sigma-Aldrich постачала фенольні стандарти та інші реагенти для ВЕРХ/DAD/MS аналізу.

2.3. Культура та лікування адипоцитів 3T3-L1

Клітини мишачих преадипоцитів 3T3-L1 були отримані з Американської колекції типових культур (ATCC, CL-173). Клітини культивували при 37 градусах під 5-відсотковим CO, атмосфері в середовищі Дульбекко, модифікованому орлиному середовищі (DMEM) (Sigma-Aldrich, Познань, Польща) з 10 відсотками (о/о) фетальної бичачої сироватки (FBS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific Polska, Варшава, Польща) додаток. Преадипоцити 3T3-L1 піддавали процесу диференціювання за протоколом, описаним раніше [11]. Преадипоцити висівали з щільністю 2,5×104клітин/см² у 12-лункові планшети та культивували до досягнення злиття. Потім їх протягом 2 днів стимулювали сумішшю для диференціювання, яка містила 0,25 мкМ дексаметазону (Sigma-Aldrich, Познань, Польща), 0,5 мМ 3-ізобутил-1-метилксантину (Sigma-Aldrich, Познань, Польща) і 1 мкМ інсуліну (Sigma-Aldrich, Познань, Польща) в DMEM з 10% FBS. Середовище було замінено на DMEM з додаванням 10 відсотків FBS та 1 мкМ інсуліну. Через 2 дні культуральне середовище замінювали на DMEM з додаванням 10 відсотків FBS і оновлювали з 2--денними інтервалами до аналізу на 12-й день.3T3-Адипоцити L1 обробляли протягом 24 годин фракціями ACN і PP при концентрації 5, 10 і 20 мкг/мл.

2.4. Культура та лікування HUVEC

Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (HUVEC) були отримані від ATCC(CRL{{0}}). HUVEC культивували в середовищі F-12K (ATCC), доповненому 10-відсотковим FBS (Gibco), добавкою для росту ендотеліальних клітин із нервової тканини бика (30 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, Познань, Польща) та гепарином ( 100 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, Познань, Польща). HUVEC висівали з щільністю 6×103 клітин/см² на 24-лункові планшети, вкриті розчином колагену хвоста щура (Sigma-Aldrich, Познань, Польща). Потім 24-год культури HUVEC піддавали дії фракцій ACN і PP протягом 3 годин у концентраціях 0,1, 1 і 10 мкг/мл, а потім обробляли TNF- (10 нг/мл) (Sigma-Aldrich, Познань). , Польща) протягом додаткових 3 годин, щоб викликати запалення.

2.5. Аналіз життєздатності клітин

Життєздатність гіпертрофованих адипоцитів 3T3-L1 і HUVEC, індукованих TNF- -, необроблених і оброблених фракціями ACN і PP, аналізували із застосуванням MTT(3-(4,{{7) }}диметилтіазол-2-іл)-25-дифенілтетразолію бромід) аналіз (Sigma-Aldrich, Познань, Польща) за процедурою, описаною раніше [13]. Низькі концентрації фракцій ACN і PP, застосовані для обробки клітин, не вплинули на колір середовища та показники абсорбції в тесті MTT.

2.6. Визначення внутрішньоклітинної продукції АФК

Утворення АФК в адипоцитах 3T3-L1 вимірювали за допомогою аналізу нітросинього тетразолію (NBT) на основі процедури, описаної раніше [14]. Після 90-хвилинної інкубації в 0.2% розчині NBT (Sigma-Aldrich, Познань, Польща) клітини промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином і фіксували метанолом. Після екстракції формазану за допомогою KOH і DMSO оптичну густину вимірювали при 620 нм (Tecan Infinite M200, Tecan Group Ltd., Männedorf, Швейцарія).

2.7. Вимірювання внутрішньоклітинного вмісту ліпідів

Вплив фракцій PP і ACN на вміст ліпідів у гіпертрофованих адипоцитах визначали методом фарбування Oil Red O (Sigma-Aldrich, Познань, Польща), описаним раніше [13], і вимірюванням загального рівня тригліцеридів (TG) за допомогою набору для аналізу адипогенезу ( Sigma-Aldrich, Познань, Польща) відповідно до інструкції виробника. Вміст внутрішньоклітинних ТГ визначали ферментним методом. Колориметричний продукт, що відповідає наявному TG, вимірювали при 570 нм. Концентрацію ТГ розраховували на основі кривої, побудованої для стандарту ТГ.

2.8. Екстракція РНК та ПЛР-аналіз у реальному часі

Адипоцити 3T3-L1 і HUVEC були оброблені реагентом TRI (Sigma-Aldrich, Познань, Польща) для загальної ізоляції РНК. Синтез першого ланцюга кДНК проводили з 1 мкг загальної РНК за допомогою набору для синтезу кДНК першого ланцюга Transcriptor (Roche Diagnostics, Польща) відповідно до інструкцій виробника. Кількісне визначення експресії генів проводили за допомогою системи ПЛР у реальному часі (SmartCycler DX real-time PCR System Cepheid, Саннівейл, Каліфорнія, США). Суміш для ПЛР у кінцевому об’ємі 25 мкл включала зразок кДНК (1 мкл), специфічний прямий і зворотні праймери (5 мкМ/1 мкл) і SYBR⑧ Select Master Mix (12,5 мкл) (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США). Послідовності праймерів наведено в таблиці S1. Умови циклу ПЛР включали початкову денатурацію при 94 градусах для 10 хвилин, після чого 40 циклів ПЛР: 40 с при 95 ° C, 30 с при 59 ° C і 30 с при 72 ° C. Відносну експресію генів розраховували за допомогою методу 2-△ACT. Рівні транскриптів нормалізували до -актину для адипоцитів 3T3-L1 і GAPDH для HUVEC. Відносну експресію мРНК виражали як кратну зміну порівняно з контрольними (необробленими) клітинами. Усі реакції проводили в трьох повторах.

2.9. Визначення продукції адипокіну

Концентрації лептину та адипонектину вимірювали за допомогою наборів ELISA (Sigma-Aldrich, Познань, Польща), дотримуючись протоколів виробника. Кількісний аналіз проводили за допомогою калібрування стандартів. Кожен стандарт і зразок аналізували в трьох повторах. Коефіцієнти варіабельності між аналізами та між аналізами були розраховані відповідно на рівні 12,5% і 9,3% для лептину та 11,2% і 7,9% для адипонектину.

2.10.Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення STATISTICA версії 13.3 (Stat-soft, Inc., Tulsa, OK, США). Для оцінки відмінностей між середніми значеннями кількох груп застосовували односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) і ретроспективний тест Тьюкі. Тест Левена підтвердив припущення про рівність дисперсій. Статистична значущість була встановлена ​​на стор<>

3. Результати та їх обговорення

3.1. Склад поліфенолів у фракціях ACN і PP брусниці

Дослідження було зосереджено на двох поліфенольних препаратах, виділених із плодів брусниці: антоціанова фракція ACN і неантоціанова фракція PP. Профілі поліфенолів у фракціях ACN і PP, визначені на основі аналізу HPLC-DAD-ESI-MS, представлені в таблиці 1. Фракція ACN складалася з трьох основних антоціанових сполук, що містяться в екстракті плодів брусниці [11], які є похідними на основі ціанідину, включаючи 3-О-галактозид (82,5 відсотка), 3-О-арабінозид (13.0 відсотків) і 3-О-глюкозид (4,5 відсотка) (Таблиця 1A) .

Таблиця 1. Сполуки, ідентифіковані у фракції антоціану (ACN) (A) і фракції неантоціанового поліфенолу (PP) (B), були отримані з плодів брусниці.

The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5 відсотків): проціанідини А- та В-типу, катехін,3-O-кофеоїлхінова кислота, гексозид ферулової кислоти, кверцетин та його похідні (3-O-галактозид,3-O- арабінофуранозид, 3-О-рамнозид). Таблиця 1B показує мас-спектральні дані всіх поліфенольних сполук, попередньо ідентифікованих у фракції РР плодів брусниці.

Цю статтю взято з Nutrients 2021, 13, 885 7