Роль ниркового андрогенного рецептора в статевих відмінностях у метаболізмі аміаку

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Осінь Н. Харріс та ін

Анотація

Існують статеві відмінності в метаболізмі та структурі аміаку в нирках, багато з яких опосередкованітестостерон. Метою даного дослідження було визначення ролі ниркової експресіїтестостеронуканонічний рецептор, андрогенний рецептор (AR), у цих статевих диморфізмах. Ми вивчали мишей знирка-специфічна делеція AR [KS-AR-нокаут (KO)], створена за допомогою методів Cre/loxP; контрольні миші були Cre-негативними однопомітними (дикий тип). У мишей-самців, але не у самок, KS-AR-KO збільшив виділення аміаку, що усунуло статеві відмінності. Хоча структурний розмір нирки зазвичай відповідає екскреції аміаку, KS-AR-KO зменшивсяниркарозмір, об’ємна щільність кортикального проксимального канальця та висота клітин кортикального проксимального канальця у чоловіків — ні те, ні інше не змінювалося у самок, а об’ємна щільність збірної протоки не змінювалася в обох статей. Аналіз ключового білка, який бере участь у роботі з аміаком, показав у мишей-самців, що KS-AR-KO підвищує експресію як фосфоенолпіруваткарбоксикінази (PEPCK), так і Na þ -K þ -2Cl котранспортера (NKCC2) і знижує Na þ/H þ обмін. ізоформи 3 (NHE3) та експресії електрогенного Na þ -бікарбонатного котранспортера 1 (NBCe1)-A. У самок мишей KS-AR-KO не змінив ці параметри. Ці ефекти мали місце, навіть якщо KS-AR-KO не змінював плазмутестостерон, споживання їжі або Na þ, K þ або HCO3 в сироватці крові значною мірою в обох статей. На закінчення, AR-залежні сигнальні шляхи у чоловіків, але не у жінок,ниркирегулюють експресію PEPCK і NKCC2 і призводять до статевих відмінностей у виведенні аміаку. Протилежний вплив на NHE3 і NBCe1-Вираз, ймовірно, обмежує величину змін виведення аміаку. Оскільки AR відсутній у товстій висхідній кінцівці, вплив KS-AR-KO на експресію NKCC2 є непрямим. Нарешті, AR є посередником більшогониркарозмір і щільність проксимального канальця у самців порівняно з самками мишей.

НОВЕ ТА ВАРТЕ УВАГИСтатевий диморфізм у метаболізмі аміаку включає сигнальні шляхи, залежні від андрогенного рецептора (AR), у чоловіків, але не у жінок,ниркиякі призводять до зміненої експресії котранспортера проксимального канальця (PT), фосфоенолпіруваткарбоксикінази та товстої висхідної кінцівки Na þ -K þ -2Cl. Адаптивні реакції в Na þ/H þ обміннику 3 та електрогенному Na þ -бікарбонатному котранспортері 1-Експресія обмежує величину впливу на виведення аміаку. Нарешті, більший розмір нирки та об’ємна щільність PT у самців мишей є результатом передачі сигналів андрогенів PT через AR.

ключові слова: кислотно-основний; аміак; андрогенний рецептор; статеві відмінності;тестостерон

cistanche підвищує тестостерон

ВСТУП

The presence of sex differences in many aspects of mammalian biology has been well established with sexual dimorphisms in structure and/or function have been identified in nearly every organ, including the kidney (1–3). Sex affects many aspects of kidney function and disease. Sex differences in blood pressure are widely recognized and thought to be related to sex-specific variations in nitric oxide, the renin-angiotensin-aldosterone system, and inflammation (4, 5). There are also differences in the expression of many renal epithelial cells Naþ transporters (6, 7). Understanding these differences can identify new disease mechanisms and/or new and improved therapeutic opportunities. The kidney regulates acid-base homeostasis, which is critical for normal health (8, 9). Renal ammonia Fn1 1 metabolism has a major role in acid-base homeostasis; ammonia excretion is the predominant component of basal net acid excretion, and changes in ammonia metabolism account for >80 відсотків відповіді на екзогенні подразники (10–16). Порушення регуляції кислотно-лужного гомеостазу безпосередньо впливає практично на кожну основну систему органів, прискорює прогресування хронічної хвороби нирок і корелює з підвищенням смертності (17–19).

Наші дослідження показали, що існує важливий статевий вплив як на метаболізм аміаку, так і на структуру нирок. Чоловіча нирка виділяє менше аміаку, ніж жіноча нирка, незважаючи на те, що чоловіча нирка більша та має більший кортикальний об’єм, ніж жіноча нирка (20). Ця різниця у виведенні аміаку корелює з варіаціями в багатьох ниркових аспектах, включаючи декілька ферментів, залучених до утворення та рециркуляції аміаку, у розмірі проксимального канальця, у товстій висхідній кінцівці петлі Генле (TAL) Naþ -Kþ ​​- 2Cl - експресія котранспортера (NKCC2), а також розмір інтеркальованих клітин збиральної протоки та експресія глікопротеїну резус (Rh) (20). Нарешті, існують статеві відмінності у реакції на кислотне навантаження (21). Багато з цих статевих відмінностей усуваються орхіектомією за допомогою механізму, скасованого фізіологічнимитестостеронзаміни, припускаючи, що вони беруть участьтестостерон-залежні сигнальні шляхи (22).

Канонічний шлях, через якийтестостеронопосередковує біологічні ефекти, включає зв’язування з рецептором андрогену (AR) (23, 24). Експресію білка AR та мРНК протягом десятиліть спостерігали як у нирках чоловіків, так і жінок (25–28). Нещодавно ми показали, що білок AR експресується саме в проксимальному канальці, і що експресію не можна виявити ні в TAL, ні в збірній протоці (22), де є відомі статеві відмінності в білках, залучених до обробки аміаку. Наші дослідження також показали, що експресія AR проксимальних канальців була присутня як у чоловічих, так і в жіночих нирках, при цьому експресія була приблизно вдвічі більшою в нирках чоловіків, ніж у нирках жінок (22). Ці спостереження свідчать про те, що АР може опосередковувати деякі, але не всі, ефекти статі на структуру нирок і на утворення та транспортування аміаку. Вони також піднімають питання про роль АР у жіночих нирках.

Таким чином, метою цього дослідження було визначити роль ниркового АР у опосередкуванні цих ідентифікованих статевих диморфізмів у нирковому метаболізмі аміаку та структурі нирок. Оскільки активація AR має численні біологічні ефекти, які можуть опосередковано змінювати кислотно-лужний гомеостаз і, отже, обробку аміаку, інтерпретація досліджень із застосуванням фармакологічного інгібування AR та/або глобальної делеції AR є складною. Таким чином, у цьому дослідженні використовувалися миші з нирковою специфічною делецією AR [KS-AR-нокаут (KO)], створеної за допомогою методів Cre-loxP. Ми порівнювали Cre-позитивних мишей з їхніми Cre-негативними однопометниками, щоб визначити ефект KS-AR-KO. Як самців, так і самок мишей оцінювали, щоб зрозуміти роль АР в обох статей.

коріння цистанки трубчастої

МЕТОДИ

Тварини

Ми використовували мишей із сайтами loxP, фланкуючими екзон 2 гена AR (ARflfl/flfl), які були описані раніше (29–31). Ми індукували делецію AR цілої нирки шляхом розведення мишей, що експресують Cre-рекомбіназу під контролем промотора Pax-8 (Pax8Cre; 32). Миші KS-AR-KO були ARflfl/flfl, Pax8-Cre þ; контрольними мишами були ARflfl/flfl, Pax8-Cre. Усі миші отримували фоновий штам C57/Bl6. Ми генотипували всіх мишей, використовуючи ДНК, витягнуту зі зразків затискачів хвоста. Миші, використані в цих експериментах, були дорослими самцями та самками віком -4 міс. Мишей утримували на стандартній дієті для гризунів (18 відсотків білка, Harlan Teklad, Madison, WI) із вільним доступом до води. Університет Флориди та Комітети системи охорони здоров’я ветеранів Північної Флориди/Південної Джорджії з догляду та використання тварин схвалили всі протоколи щодо тварин. Розведення тварин проводилося в Центрі лікування трансгенних тварин Медичного коледжу Університету Флориди навченим персоналом.

Експерименти з метаболічними клітками

Мишей поміщали в метаболічні клітки на 3 дні і годували порошкоподібною нормальною дієтою (18 відсотків білка, Harlan Teklad), змішаною 1:1 з водою. Вимірювали щоденне споживання їжі та збирали щоденні 24--годинні зразки сечі. Зразки сечі збирали в пробірки, що містили мінеральне масло, збалансоване водою, щоб запобігти випаровуванню та втраті молекул газу. Записували добовий об’єм сечі та рН. Зразки сечі зберігалися при - 20 градусах до подальшого аналізу.

Аналіз крові

Кров отримували шляхом канюляції черевної аорти у мишей, яких анестезували ізофлураном, набирали в гепаринізований шприц і негайно аналізували на концентрації Naþ, K þ і бікарбонату за допомогою аналізатора газів крові Siemens Microanalytic (RAPIDLab 348 Analyzer, Siemens, Мюнхен, Німеччина). ). Рівень тестостерону в сироватці вимірювали в дослідницькому центрі медичної школи Університету Вірджинії для аналізу та аналізу лігандів репродукції (IBL America мишачий тестостерон ELISA, Міннеаполіс, Міннесота)

Аналіз сечі

Аміак у сечі вимірювали за допомогою модифікації комерційно доступного набору (A7553, Pointe Scientific, Canton, MI), як описано раніше (20, 33). РН сечі вимірювали за допомогою мікро-рН-електрода (ROSS semi-micro pH, Orion 8103BN, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Титруючу екскрецію кислоти визначали за допомогою раніше описаних стандартних методів (20, 33).

Антитіла

У таблиці 1 наведено антитіла, використані в цьому дослідженні, їх постачальників та їхні каталожні/ідентифікаційні номери.

Екстракт цистанки тубулозної підвищує тестостерон і підвищує сексуальну здатність

Приготування білка

Тварин анестезували інгаляційним ізофлураном, а нирки промивали серцевою перфузією in vivo PBS (pH 7,4), що містив 6 000 ОД/л Na-гепарину та 120 мг/л лідокаїну. Праву нирку швидко видалили, а кору, зовнішню та внутрішню мозкову речовину виділили на холодному столику під розсіковим мікроскопом. Зразки швидко заморожували в рідкому азоті та зберігали в замороженому стані при - 80 градусів до використання. Тканини гомогенізували в реагенті для екстракції тканинного білка T-PER (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Іллінойс) за допомогою товкачиків для мікропробірок (USA Scientific, Окала, Флорида), і білок екстрагували відповідно до рекомендацій виробника. Аліквоту використовували для кількісного визначення загального білка за допомогою аналізу біцинхонінової кислоти (BCA), а залишок зберігали в замороженому стані при 80 градусах до використання.

Процедури імуноблоту. Десять мікрограмів ниркового білка піддавали електрофорезу на 10% PAGE ReadyGel (Bio-Rad, Hercules, CA). Гелі переносили електрофоретично на нітроцелюлозні мембрани, блокували 5 г/дл знежиреного сухого молока, розведеного в буфері Blotto (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ Na2EDTA і 0,05% Tween 20, рН 7,6), і інкубували при 4°C протягом ночі. з первинним антитілом у знежиреному сухому молоці. Еквівалентність навантаження та перенесення оцінювали за допомогою фарбування Ponceau S та шляхом оцінки експресії білка домашнього господарства b-актину. Після промивання мембрани піддавали впливу вторинного антитіла (козячий антикролячий IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), кон’югованого з пероксидазою хрону в розведенні 1:5, 000. Місця реакції антитіло-антиген візуалізували за допомогою посиленої хемілюмінесценції (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) і цифрової системи візуалізації Kodak Image Station 440CF. У вибраних експериментах блоти видаляли. Щільність смуги була нормалізована таким чином, щоб середня щільність у ділянці (кора або зовнішній мозковий шар) у чоловічій тканині дикого типу (WT) становила 100. Обидві статі (чоловіча та жіноча) та обидва генотипи (WT та KO) були завантажені на той самий гель для цих експериментів. Відсутність насичення було підтверджено шляхом дослідження розподілу інтенсивності пікселів у всіх імуноблотах.

Процедури імуноблоту

Десять мікрограмів ниркового білка піддавали електрофорезу на 10% PAGE ReadyGel (BioRad, Hercules, CA). Гелі переносили електрофоретично на нітроцелюлозні мембрани, блокували 5 г/дл знежиреного сухого молока, розведеного в буфері Blotto (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМ Na2EDTA та 0,05% Tween 20, pH 7,6), та інкубували при 4°C.C протягом ночі з первинним антитілом у знежиреному сухому молоці. Еквівалентність навантаження та перенесення оцінювали за допомогою фарбування Ponceau S та шляхом оцінки експресії білка домашнього господарства b-актину. Після промивання мембрани піддавали дії вторинного антитіла (козячий антикролячий IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), кон’югованого з пероксидазою хрону в розведенні 1:5, 000. Місця реакції антитіло-антиген візуалізували за допомогою посиленої хемілюмінесценції (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) і цифрової системи візуалізації Kodak Image Station 440CF. У вибраних експериментах блоти видаляли. Щільність смуги була нормалізована таким чином, щоб середня щільність у ділянці (кора або зовнішній мозковий шар) у чоловічій тканині дикого типу (WT) становила 100. Обидві статі (чоловіча та жіноча) та обидва генотипи (WT та KO) були завантажені на той самий гель для цих експериментів. Відсутність насичення було підтверджено шляхом дослідження розподілу інтенсивності пікселів у всіх імуноблотах.

Підготовка тканин до імуногістохімії

Мишей анестезували інгаляційним ізофлураном. Нирки були збережені за допомогою серцевої перфузії in vivo PBS (pH 7,4), що містив 6,000 ОД/л Na-гепарину та 120 мг/л лідокаїну з подальшим періодат-лізин-2% параформальдегіду, розрізають поперечно на кілька скибочок товщиною від 2- до 3- мм, а потім занурюють на 24–30 годин при 4 градусах у той самий фіксатор. Зразки нирок від кожної тварини занурювали в поліефірний віск, виготовлений з дистеарату поліетиленгліколю 400 (Polysciences, Warrington, PA) з 10 відсотками 1-гексадеканолу, а зрізи товщиною 2- мм вирізали та монтували на покриті желатином слайди.

cistanche tubulosa користь: підвищення сексуальної здатності

Імуногістохімія

Імунолокалізацію для глікопротеїну сімейства B Rh (Rhbg), глікопротеїну C сімейства Rh (Rhcg), ізоформи обміну Naþ /Hþ 3 (NHE3), глутамінсинтетази (GS), NKCC2 і AR було здійснено за допомогою описаних раніше процедур імунопероксидази (20, 22, 34–37). Коротко, зрізи депарафінізували в етанолі, повторно гідратували, нагрівали в Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) до 88°C протягом 30 хвилин, а потім до 96 градусів протягом 30 хвилин, охолоджували протягом 30 хвилин і промивали PBS. Активність ендогенної пероксидази блокували шляхом інкубації зрізів у 3% H2O2 у дистильованій воді протягом 45 хв. Зрізи блокували протягом 15 хвилин безсироватковим білковим блоком (Dako Cytomation), а потім інкубували протягом ночі при 4°C з первинним антитілом. Зрізи промивали в PBS, інкубували протягом 30 хвилин із пов’язаним полімером, кон’югованим з пероксидазою кінським анти-кролячим IgG (ImmPRESS, Vector Laboratories, Burlingame, CA), знову промивали PBS, а потім піддавали дії діамінобензидину протягом 5 хвилин. Зрізи промивали дистильованою водою, зневоднювали ксилолом, монтували та спостерігали за допомогою світлової мікроскопії. Порівняння маркування проводили між секціями одного імуногістохімічного експерименту. Зрізи досліджували на мікроскопі Zeiss Axio Imager A2, оснащеному оптикою DIC, і фотографували за допомогою кольорової цифрової камери Axiocam 305 і програмного забезпечення Zen 2.3 (Zeiss).

Імунолокалізація для фосфоенолпіруваткарбоксикінази (PEPCK) була виконана за допомогою модифікованих процедур імунопероксидази, як описано раніше (20, 22, 38–40). Коротко, зрізи депарафінізували в етанолі, повторно гідратували, нагрівали в Trilogy (Cell Marque, Роклін, Каліфорнія) до 96 C протягом 60 хвилин, охолоджували протягом 30 хвилин і промивали PBS. Активність ендогенної пероксидази блокували шляхом інкубації зрізів у 3% H2O2 у метанолі протягом 45 хв. Зрізи обробляли 0.5% Triton X-100 у PBS протягом 15 хв. Потім зрізи кілька разів промивали PBS, що містив 1% BSA, 0.05% сапоніну та 0,2% желатину, після чого блокували протягом 15 хвилин безсироватковим білковим блоком (DAKO Cytomation), а потім інкубували протягом ночі при 4°C. з первинними антитілами. Зрізи промивали PBS, що містив 0,1 відсотка BSA, 0,05 відсотка сапоніну та 0,2 відсотка желатину, потім PBS та інкубували протягом 60 хвилин з полімерно-зв’язаним пероксидазно-кон’югованим козячим анти-кролячим IgG (MACH2, Biocare Medical, Concord, CA), знову промивають у PBS, а потім піддають дії діамінобензидину протягом 5 хв.

Негативний контроль

Кожен імуногістохімічний експеримент включав секцію, яка була піддана процедурам імуномаркування без первинних антитіл, щоб переконатися, що мітка зумовлена ​​лише первинним зв’язуванням антитіл.

Морфометричний аналіз

Об’ємну щільність проксимального канальця в корі та зовнішній смужці зовнішньої мозкової речовини, а також збірної протоки в корі та внутрішній смузі зовнішньої мозкової речовини визначали за допомогою стандартних методів підрахунку точок, як описано раніше (20–22, 41). ).

Кількісна імуногістохімія

Кількісну імуногістохімію проводили, як ми вже описували та перевіряли (20, 22, 33, 37, 42). Сегменти проксимальних канальців досліджували в зрізах, позначених за ідентичних умов у тому самому експерименті з імунологічного мічення спостерігачем, який не бачив групу лікування. Специфічні сегменти проксимального канальця, які вимірювали, були початковим проксимальним звивистим канальцем (PCT), визначеним як сегменти PCT, що не перериваються з капсулою Боумена, проксимальним прямим канальцем (PST) у медулярному промені та PST у зовнішній смузі зовнішнього довгастого мозку. Ми використовували цифрові мікрофотографії з високою роздільною здатністю, зроблені випадково вибраними ділянками кори нирки та зовнішньої смужки зовнішнього мозкового шару за допомогою мікроскопа Zeiss Axio Imager A2, оснащеного кольоровою цифровою камерою Axiocam 305 та програмним забезпеченням Zen 2.3 (Zeiss), не використовуючи методи покращення зображення. . Використовуючи програмне забезпечення ImageJ (v, 1.34j, Національний інститут здоров’я, Бетесда, штат Меріленд), ми вимірювали інтенсивність пікселів по прямій лінії, проведеній від просвіту канальця через окрему клітину. Потім ці дані були проаналізовані за допомогою спеціального програмного забезпечення, виконаного в Microsoft Excel 2016. Чиста інтенсивність кожного пікселя на лінії потім була визначена як різниця між абсолютною інтенсивністю та середньою фоновою інтенсивністю пікселів, виміряною поза коміркою. Загальну клітинну експресію визначали шляхом інтегрування чистої інтенсивності пікселів по всій клітині. Висоту клітини визначали як відстань у пікселях між апікальним і базолатеральним краями клітин і конвертували в абсолютну довжину за допомогою каліброваного визначення розміру окремого пікселя. Було проаналізовано щонайменше 15 окремих клітин із принаймні чотирьох мікрофотографій кожної нирки. Дані всіх досліджених клітин певного типу сегмента проксимального канальця були усереднені, щоб отримати одну точку даних на тварину для статистичного аналізу.

Ми визначили інтеркальований розмір клітин типу А та експресію клітинно-специфічного білка, як описано раніше (20, 22). Коротко, ми отримали потужні цифрові мікрофотографії внутрішньої смуги зовнішньої мозкової речовини зрізів тканини, які піддалися імуногістохімії на інтеркальований клітинно-специфічний маркер Rhbg або Rhcg. Окремі інтеркальовані клітини були обмежені за допомогою програмного забезпечення ImageJ (версія 1.34j, Національні інститути здоров'я). Розмір комірки визначався як кількість пікселів у межах окреслених областей і перетворювався на площу за допомогою каліброваного вимірювання пікселів на мікрометр. Інтенсивність імунної мітки в кожному пікселі визначали як різницю між абсолютною інтенсивністю пікселів і середньою інтенсивністю фону, а інтенсивність імунної мітки для однієї клітини визначали шляхом інтегрування чистої інтенсивності пікселів у клітинці за допомогою спеціального програмного забезпечення, виконаного в Microsoft Excel 2016.

Cistanche лікує захворювання нирок, щоб підвищити сексуальну здатність

РЕЗУЛЬТАТИ

Перевірка нирково-специфічної делеції АР

Фармакологічне блокування АР або глобальна делеція спричиняє широкий спектр фенотипових змін (43), які можуть опосередковано змінювати структурні реакції нирок та аміачну реакцію. Щоб уникнути цих проблем, ми створили мишей KS-AR-KO за допомогою техніки Cre loxP. Ми підтвердили ефективність ниркової делеції АР за допомогою імуногістохімії (рис. 1). У мишей WT імуногістохімія показала ядерну імуномаркеру AR, обмежену проксимальним канальцем; це було подібно до наших знахідок у нормальній нирці миші (22). У нирці KO не було виявлено імуномаркери AR в обох статей (рис. 1). Ці результати показують покоління мишей з нирковою делецією AR.

статистичний аналіз за допомогою програмного забезпечення SPSS (26.2) і Microsoft Excel 2016.

Оскільки тестостерон має численні екстраренальні ефекти, які, можливо, можуть опосередковано змінювати кислотно-лужні механізми нирок, ми розглянули можливість того, що KS-AR-KO може змінювати рівні тестостерону або естрадіолу в плазмі. Однак концентрації тестостерону та естрадіолу в плазмі істотно не відрізнялися між мишами WT і KO обох статей (таблиця 2).

Фізіологічна характеристика нирково-специфічної делеції AR Маса тіла була більшою у самців мишей WT, ніж у самок мишей WT, незважаючи на відсутність статевих відмінностей у споживанні їжі, як повідомлялося раніше (22), що відповідає відомим екстраренальним впливам статі на масу тіла. Однак KS-AR-KO не змінював щоденне споживання їжі або масу тіла в обох статей (таблиця 2).

Маса нирок була значно більшою у самців мишей WT, ніж у самок мишей WT (рис. 2), подібно до того, про що ми раніше повідомляли у нормальних мишей (22). KS-AR-KO суттєво зменшив вагу нирок у самців мишей KS-AR-KO настільки, що вага нирок самців KS-AR-KO істотно не відрізнявся від маси нирок WT або KS-AR-KO самців (рис. 2). . У самок мишей KS-AR-KO істотно не змінив масу нирок. Таким чином, вплив статі на вагу нирки вимагає експресії АР у чоловічій нирці.

Ні концентрації Naþ, K þ, ні бікарбонату в плазмі істотно не відрізнялися між мишами WT і KS-AR-KO для обох статей (таблиця 2). Кліренс сечовини, який використовується як маркер швидкості клубочкової фільтрації, істотно не відрізнявся між мишами WT і KS-AR-KO обох статей (таблиця 2).

Чисте виділення кислоти

Загальна екскреція кислоти включає два процеси: екскрецію амонію (NH4þ ) та екскрецію титрованої кислоти. У мишей-самців KS-AR-KO значно збільшив виділення аміаку, що усунуло статеву різницю у виділенні аміаку (рис. 2). Екскреція аміаку не була істотно змінена у самок мишей під дією KS-AR-KO. Екскреція кислоти, яку можна титрувати, суттєво не змінювалася під впливом KS-AR-KO в обох статей (табл. 2). KS-AR-KO значно знизив рН сечі у самців мишей, але не у самок мишей (табл. 2); однак вплив KS-AR-KO на виведення аміаку зберігався після статистичного аналізу рН сечі (P < 0.001="" за="" anova).="" таким="" чином,="" ar="" проксимального="" канальця="" опосередковує="" статеві="" відмінності="" в="" екскреції="" аміаку="" у="" самців="" мишей,="" але="" його="" видалення="" не="" мало="" істотного="" впливу="" на="" екскрецію="" аміаку="" у="" самок="">

Вплив нирково-специфічної делеції AR на структуру проксимального канальця

На проксимальні канальці припадає більша частка кортикального об’єму чоловічої нирки, ніж жіночої нирки, і це залежить від тестостерону (20, 22). Таким чином, ми визначили вплив делеції KS-AR у самців і самок мишей на структуру проксимальних канальців. Використовуючи імунологічну мітку PEPCK як маркер, специфічний для проксимальних канальців, імуногістохімія якісно показала, що KS-AR-KO зменшує частку кори, яка є проксимальними канальцями (рис. 3A). Кількісний аналіз із застосуванням формальних методів підрахунку балів (41) показав, що KS-AR-KO значно зменшує об’ємну щільність проксимальних канальців у корі самців, що відповідає зміні ваги нирок (рис. 3B). Навпаки, у зовнішній смужці зовнішньої мозкової речовини KS-AR-KO не змінював істотно об’ємну щільність проксимальних канальців у мишей-самців (рис. 3B). У самок мишей KS-AR-KO якісно не змінював пропорцію кори головного мозку, яка була проксимальним канальцем (рис. 3A), і кількісно не змінював об’ємну щільність проксимальних канальців ні в корі, ні в зовнішньому мозковому шарі (рис. 3B). Статева різниця в об’ємній щільності кортикальних проксимальних канальців у мишей WT не була у мишей KS-AR-KO. Таким чином, у чоловічій нирці АР опосередковує статеві відмінності в об’ємній щільності проксимальних канальців у корі. У зовнішній мозковій речовині експресія AR не впливає на об’ємну щільність проксимальних канальців в обох статей.

Ці зміни в структурі проксимальних канальців у самців мишей KS AR-KO, очевидно, включають зміни розміру клітин. У самців мишей KS-AR-KO значно зменшував висоту клітин проксимальних канальців як у PCT, так і в кортикальному PST, тобто по всій корі (рис. 3C). Висота клітин у PST у зовнішньому мозковому шарі істотно не змінювалася (рис. 3C). Ці результати відповідають результатам об’ємної щільності. Нирково-специфічна делеція AR у самок мишей не змінювала висоту клітин проксимальних канальців ні в PCT, ні в кортикальному PST, ні в PST у зовнішньому мозковому шарі, що відповідає відсутності впливу на об’ємну щільність і загальний розмір нирки в жіночій нирці (рис. 2B).

Маса нирки, об’ємна щільність кортикального проксимального канальця та висота клітин у PCT та кортикальному PST були більшими в чоловічій нирці WT, ніж у жіночій нирці WT, що відповідає нашим попереднім спостереженням (20, 22). У самців мишей KS-AR-KO ця статева різниця більше не існувала, і кожен із цих параметрів не відрізнявся суттєво від тих, що спостерігалися у самок мишей WT або KS-AR-KO. Таким чином, статеві відмінності у вазі нирок, щільності кортикального проксимального канальця та висоті клітин у PCT та кортикальному PST залежать від експресії AR.

Вплив нирково-специфічної делеції AR на структуру збиральної протоки

Існують важливі статеві відмінності в збиральній протоці, при цьому об’ємна щільність збиральної протоки є більшою в частці кори головного мозку або зовнішньої мозкової речовини, яка була збиральною протокою у самців або самок мишей (рис. 4A). Кількісний морфометричний аналіз показав, що KS-AR-KO не змінював суттєво об’ємну щільність збиральної протоки ні в корі, ні в зовнішньому мозковому шарі обох статей (рис. 4B). Таким чином, нирковий АР не опосередковує статевий диморфізм у щільності об’єму збірної протоки.

Експресія аміаку. Результати аналізу чистої кислотної екскреції показують, що нирково-специфічна делеція AR збільшує виведення аміаку у мишей-самців, навіть якщо вона зменшує об’ємну щільність проксимальних канальців і висоту клітин у корі головного мозку. Це вказує на те, що вплив на виведення аміаку не можна віднести просто до гіпертрофії проксимальних канальців, що призводить до посиленого утворення аміаку, а натомість є результатом окремих і специфічних впливів на утворення аміаку та/або транспорт аміаку. Таким чином, далі ми досліджували ключові білки, що беруть участь у утворенні аміаку та транспортуванні аміаку.

PEPCK є ключовим ферментом проксимальних канальців, необхідним для утворення аміаку, і міститься виключно в проксимальних канальцях нирок (16, 44). У самців мишей KS-AR-KO значно підвищував кортикальну експресію PEPCK; не було жодного ефекту KS-AR-KO у самок мишей (рис. 5A). Збільшення експресії PEPCK у самців мишей KS-AR-KO усуває статеву різницю у мишей WT (рис. 5A). Дослідження експресії імунних міток PEPCK показало, що самці мишей KS-AR-KO мали більшу інтенсивність імунних міток PEPCK у PCT та кортикальному PST, ніж у мишей WT (рис. 5B). У зовнішній смужці зовнішньої мозкової речовини не було помітної різниці в інтенсивності імунної мітки PEPCK (рис. 5B). Кількісна імуногістохімія самців мишей показала, що KS-AR-KO значно підвищив інтенсивність імунної мітки PEPCK як у PCT, так і в кортикальному PST, але не у зовнішній смужці зовнішньої мозкової речовини (рис. 5C). Таким чином, у мишей-самців, але не у мишей-самок, експресія AR проксимальних канальців знижує експресію PEPCK у кортикальних сегментах проксимальних канальців, але не в PST у зовнішньому мозковій речовині.

Проксимальний каналець має здатність рециркулювати аміак за участю GS (37, 42, 45, 46). Ні в самців, ні в самок мишей KS-AR-KO істотно не змінив експресію GS (рис. 5D). Таким чином, нирковий АР, здається, не модулює експресію GS.

Вплив нирково-специфічної делеції AR на експресію NBCe1

NBCe1 — інтегральний мембранний білок проксимальних канальців, який відіграє важливу роль у реабсорбції фільтрованого бікарбонату, який також регулює метаболізм аміаку (47–49). Два варіанти сплайсингу NBCe1, NBCe1-A та NBCe1-B, присутні в нирці миші (50, 51). Використовуючи антитіло pan-NBCe1, яке розпізнає обидва варіанти NBCe1, ми виявили, що KS-AR-KO значно знижує кортикальну експресію NCBe1 у чоловічих, але не жіночих нирках (рис. 6A).

Вплив нирково-специфічної делеції AR на транспортери аміаку. Екскреція аміаку нирками включає скоординований транспорт NH3/NH4þ за допомогою специфічних мембранних білків (10, 16, 52). Це залучає транспортери в проксимальному канальці (NHE3), TAL петлі Генле (NKCC2), а імуномаркеру збиральної протоки не було виявлено у зовнішніх сегментах проксимального канальця медулярної частини (рис. 6C), як повідомлялося раніше (48). Потім ми використали кількісний імуногістохімічний аналіз для кількісної оцінки сегментоспецифічних змін експресії NBCe1-A. Це показало, що KS-AR KO у самців мишей знижує експресію NBCe1-A в PCT і кортикальному PST, тобто в усій корі (рис. 6D). Таким чином, експресія AR регулює експресію кортикального проксимального канальця NBCe1-A в чоловічій нирці, але не в жіночій нирці.

(Rhbg і Rhcg). Статеві відмінності в екскреції аміаку корелюють з відмінностями в експресії кожного з них (6, 20), а тестостерон регулює експресію як NHE3, так і NKCC2 (22). NKCC2 опосередковує реабсорбцію аміаку TAL (10, 16, 52). У мишей-самців KS-AR-KO значно підвищив експресію білка NKCC2 за допомогою імуноблот-аналізу; у мишей-самок суттєвих змін не було (рис. 8). Ця зміна в експресії у самців мишей, ймовірно, сприяє зміненому медулярному шунтуванню аміаку і, таким чином, сприяє ефекту KS-AR-KO для збільшення виведення аміаку у самців мишей.

Rh глікопротеїни Rhbg і Rhcg є основними білками, які опосередковують секрецію аміаку в збірних протоках, і їх експресія, як правило, відповідає змінам у виведенні аміаку (10, 16, 52). Однак KS-AR-KO не змінював суттєво експресію білка Rhbg у самців або самок мишей KS-AR-KO ні в корі головного мозку, ні у внутрішній смузі зовнішнього мозкового шару (рис. 9). Вплив на експресію Rhcg був подібним. Імуногістохімія Rhcg, оцінена якісно та з використанням кількісної імуногістохімії, не показала значних змін інтенсивності імуномітки Rhcg в інтеркальованих клітинах зовнішньої смужки зовнішнього мозкового шару в обох статей (рис. 10). Таким чином, нирковий АР, здається, не модулює експресію ні Rhbg, ні Rhcg.

ДИСКУСІЯ

Це дослідження надає важливу нову інформацію щодо механізму того, як АР модулює статевий диморфізм у нирках. Оскільки AR має численні позаниркові ролі, що може ускладнити розуміння його ролі в нирках, ми створили першу мишу KS-AR-KO. KS-AR-KO у мишей-самців збільшив виведення аміаку, але зменшив загальний розмір нирок, об’ємну щільність проксимальних канальців і висоту клітин проксимальних канальців, усуваючи раніше визначені статеві відмінності. Експресія багатьох ключових білків (PEPCK і NKCC2), залучених до обробки аміаку, була збільшена за допомогою KS-AR-KO, що, ймовірно, сприяло підвищенню виведення аміаку. Одночасно знижувалася експресія інших білків (NHE3 і NBCe1-A), що призводило до притуплення змін у виведенні аміаку. KS-AR-KO не мав помітного ефекту у самок мишей або в збірній протоці обох статей. Таблиця 3 показує ці ефекти. Ці результати свідчать про те, що ниркова обробка аміаку та структура проксимальних канальців включають ниркові АР-залежні сигнальні шляхи в корі чоловічої нирки, але не жіночої нирки та не в зовнішньому мозковому шарі обох статей.

Перше важливе відкриття в цьому дослідженні полягає в тому, що експресія AR опосередковує статеві відмінності в розмірі нирок. Попередні дослідження на людях, щурах і мишах показали, що чоловіча нирка більша за жіночу (3, 56, 57). Першим доказом того, що це включало тестостерон-залежний сигнальний шлях, було спостереження, що надмірне введення андрогену якісно збільшило розмір проксимальних канальців щурів (57). Додаткові дані щодо дорослих чоловіків свідчать про дозозалежне збільшення об’єму нирок, за оцінками, збільшення на 4.04-см3 на 100 мг щотижневої дози тестостерону (58). Нещодавно ми показали, що миші-самці мають більший розмір нирок і проксимальних канальців, ніж миші-самки (20, 22), і що ці відмінності залежать від тестостерону (22). У відповідності з цими попередніми висновками, це дослідження демонструє, що у мишей-самців ниркова експресія АР регулює розмір як цілої нирки, так і розміру проксимального канальця. Крім того, KS-AR-KO призводить до того, що розмір нирок у чоловіків такий самий, як і у жінок із незмінною експресією AR. Таким чином, у самців мишей тестостерон, діючи через ниркові АР-залежні сигнальні шляхи, може повністю пояснити статевий диморфізм у нирках і розмірі проксимальних канальців.

Другий важливий висновок полягає в тому, що статеві відмінності у виведенні аміаку опосередковуються АР-залежними шляхами у самців мишей. Наші попередні дослідження показали, що миші-самки виділяють із сечею приблизно вдвічі більше аміаку, ніж миші-самці (20–22), використовують різні шляхи відповіді, щоб відповісти на кислотне навантаження (21), і що різниця в базальній екскреції аміаку включає залежність від тестостерону механізм (22). Дане дослідження розширює ці висновки, показуючи, що KS-AR-KO усуває статевий диморфізм у виділенні аміаку. Зміни в дієтичних фіксованих кислотних навантаженнях можуть змінити виведення аміаку, але зміни у виведенні аміаку у мишей з делецією AR не можна віднести до цього механізму, оскільки KS-AR-KO не змінював споживання їжі. Більшість змін, які відбуваються в метаболізмі аміаку, як, наприклад, при метаболічному ацидозі або гіпокаліємії, призводять до змін у розмірі нирок і проксимальних канальців, що відбувається паралельно з екскрецією аміаку (59–61). Однак миші-самці з нирковою делецією AR мають підвищену екскрецію аміаку, але зменшили загальний розмір нирки та проксимальних канальців, що вказує на те, що вплив на екскрецію аміаку не є неспецифічною відповіддю на зміни маси нирок. Цей неконгруентний розмір нирок і реакція аміаку у відповідь на ниркову делецію AR збігаються з результатами наших попередніх досліджень із використанням моделі гонадектомії, яка оцінювала вплив тестостерону (22). Таким чином, у самців мишей тестостерон, діючи через нирковий АР у самців, регулює виведення аміаку через шляхи, не пов’язані з впливом на розмір нирок, розмір проксимальних канальців і ендогенне кислотне навантаження, пов’язане з прийомом їжі.

Більшість утворення аміаку відбувається в проксимальному канальці. Наша попередня робота виявила статевий диморфізм у виробленні аміаку в проксимальних канальцях, який залежить від тестостерону, отриманого з яєчок (22). Результати цього дослідження ще більше розширюють ці висновки, показуючи, що нирковий АР у мишей-самців регулює експресію ферменту PEPCK, що генерує аміак, але не ферменту рециркуляції аміаку GS. Цей вплив на експресію PEPCK не є неспецифічним ефектом, пов’язаним із змінами розміру проксимальних канальців, оскільки ефекти ниркової делеції AR на розмір проксимальних канальців протилежні її впливу на експресію PEPCK. Крім того, виявлення того, що ниркова делеція AR не змінює експресію GS, вказує на те, що GS регулюється за допомогою механізмів, відмінних від тих, що використовуються для PEPCK.

Аміак, що утворюється в проксимальному канальці, секретується переважно в рідину просвіту через апікальний NHE3-залежний механізм (54, 55). Попередні дослідження показали, що втрата тестостерону знижує експресію NHE3 (22, 62). Результати цього дослідження ще більше розширюють ці висновки, показуючи, що ниркова делеція AR у самців мишей знижує експресію NHE3. Таким чином, тестостерон, діючи через активацію AR, здається, збільшує експресію кортикального проксимального канальця NHE3. Однак важливо визнати, що ці ефекти не пов’язані з виведенням аміаку, а натомість, за прогнозами, мінімізують спостережувані зміни у виведенні аміаку. Натомість, оскільки NHE3 також має вирішальне значення для фільтрованого NaCl та реабсорбції води, ці ефекти можуть сприяти більшій реабсорбції NaCl у проксимальних канальцях, присутній у чоловіків (6, 7).

Реабсорбція аміаку в TAL встановлює інтерстиціальний градієнт аміаку, необхідний для збору секреції аміаку з протоки (63, 64). Попередні дослідження нашої групи показали, що експресія NKCC2 більша у мишей-самок, ніж у мишей-самців (20–22), що існує статевий диморфізм у відповіді NKCC2 на кислотне навантаження (21), і що різниця в базальній експресії NKCC2 включає тестостеронзалежний механізм (22). Це дослідження показує, що втрата ниркової АР у самців мишей збільшує експресію NKCC2. Величина цього ефекту була майже ідентичною різниці, яку ми ідентифікували між самцями та самками мишей (20, 21), і в поточному дослідженні усунув статевий диморфізм експресії NKCC2. Крім того, виявлена ​​різниця між мишами-самцями з неушкодженою нирковою АР та делецією АР відповідає нашим раніше визначеним відмінностям між мишами-самцями з орхіектомією порівняно з інтактною та фіктивно оперованою контрольною групою (24). Таким чином, тестостерон, діючи через AR, здається, опосередковує статевий диморфізм у експресії NKCC2. Однак ця регуляція виглядає непрямою, оскільки ні в нашому попередньому звіті (22), ні в цьому дослідженні не було виявленої експресії AR у TAL. Одним із можливих непрямих механізмів, що пояснює це спостереження, є те, що у чоловіків делеція AR призводить до зменшення розміру проксимальних канальців, що в поєднанні зі зниженою експресією NHE3 проксимальних канальців збільшує посилене надходження розчиненої речовини до TAL, що стимулює експресію NKCC2.

Секреція аміаку в збірних протоках є основним фактором, що визначає екскрецію аміаку з сечею, а Rh-глікопротеїни Rhbg і Rhcg є основними транспортерами аміаку в збірних протоках (16, 65–68). Раніше ми показали статевий диморфізм у об’ємній щільності збиральної протоки та експресії глікопротеїнів Rh, причому миші-самки мали більшу об’ємну щільність збиральної протоки, розмір інтеркальованих клітин та експресію Rhbg і Rhcg (20). У цьому дослідженні не виявлено помітних змін у щільності збиральної протоки або експресії Rhbg і Rhcg у відповідь на KS-AR-KO як у самців, так і в самок мишей. Це відповідає відсутності впливу дефіциту тестостерону, спричиненого орхіектомією, на об’ємну щільність збиральної протоки, розмір інтеркальованих клітин та експресію Rhbg і Rhcg (22). Ми робимо висновок, що статевий диморфізм у збірній протоці відбувається через механізми, які не включають тестостерон і АР-залежні сигнальні шляхи.

Зовнішній мозковий шар, здається, інакше реагує на стать, тестостерон і АР, ніж кора. На відміну від ниркової кори, у зовнішньому мозковій речовині немає статевого диморфізму в об’ємній щільності проксимальних канальців або висоті проксимальних канальців (20), немає впливу дефіциту тестостерону, спричиненого орхіектомією, на ці параметри (22), а також немає впливу на ниркові AR делеція (теперішнє дослідження). Відсутність впливу статі, тестостерону та експресії AR не пов’язана з відсутністю експресії AR, оскільки ми показали експресію AR у всьому проксимальному канальці, включаючи зовнішню мозкову речовину (22). Розуміння механізмів, що лежать в основі цієї осьової різниці у відповіді проксимальних канальців на стать, тестостерон і АР, буде важливим напрямком для майбутніх досліджень.

Останнє спостереження полягає в тому, що видалення AR не має помітного впливу на жіночу нирку. АР присутній у всьому проксимальному канальці в обох статей, і хоча експресія у жінок нижча, абсолютна різниця в експресії становила лише - 50 відсотків (22). Частково відсутність ефекту видалення AR може вказувати на зниження активації AR циркулюючим тестостероном, який, як показано в цьому дослідженні, значно менший у жінок, ніж у чоловіків. Однак імуногістохімія вказує на значну ядерну локалізацію АР у жіночій нирці (посилання 22 і дане дослідження), що зазвичай вказує на активацію АР-залежних процесів передачі сигналів. Ці спостереження припускають можливість того, що інші відмінності, залежні від статі, порушують AR-залежні сигнальні механізми в жіночих проксимальних канальцях.

Перспективи та значення

Краще розуміння механізму та біологічних наслідків впливу статі на структуру нирок і метаболізм аміаку має вирішальне значення для оптимізації нашої здатності доглядати за чоловіками та жінками з порушеннями кислотно-лужного балансу. Незважаючи на останні досягнення в нашому розумінні впливу сексу на метаболізм аміаку та ролі ниркової АР, необхідні додаткові дослідження. Існують, безперечно, тестостерон-незалежні ефекти сексу, механізм яких на даний момент не повністю вивчений. Незалежно від того, чи пов’язано це з прямим впливом інших статевих стероїдних гормонів, таких як естрогени або прогестерон, непрямим впливом активації AR проксимальних канальців або впливом статевих хромосом, які не залежать від гонадних гормонів, будуть важливі питання для вирішення майбутніх досліджень.

цистанхе усуває проблеми з нирками та покращує kфункція нирок

ПОДЯКА

Ми дякуємо доктору Шерон В. Метьюз і Чао Чену (Основна лабораторія електронної мікроскопії Університету Флориди, коледж медицини) за чудову обробку тканин для наших імуногістохімічних експериментів. Ми дякуємо Центру дослідження лігандів репродукції та аналізу Центру медичної школи Університету Вірджинії за вимірювання рівня тестостерону в сироватці крові. Ми дякуємо доктору Гейл Прінс за постачання антитіл проти АР та за їхній досвід у АР.

РОЗКРИТТЯ

Автори не заявляють про відсутність конфлікту інтересів, фінансового чи іншого характеру.

АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК

ANH та IDW задумали та спланували дослідження; ANH, RAC, H.-WL і JWV провели експерименти; Проаналізовані дані ANH, RAC, H.-WL, JWV та IDW; ANH, RAC, JWV та IDW інтерпретували результати експериментів; ANH підготовлені цифри; ANH підготував рукопис; ANH, RAC, H.-WL, JWV та IDW відредагували та переглянули рукопис; ANH, RAC, H.-WL, JWV та IDW схвалили остаточну версію рукопису.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Комітет Інституту медицини з розуміння біології статі та гендеру D; Wizemann TM, Pardue ML (Редактори). Дослідження біологічного внеску в здоров’я людини: чи має значення секс? Вашингтон, округ Колумбія: National Academies Press, 2001. doi:10.17226/10028.

2. Karp NA, Mason J, Beaudet AL, Benjamini Y, Bower L, Braun RE та ін. Поширеність статевого диморфізму у фенотипових ознаках ссавців. Nat Commun 8: 15475, 2017. doi:10.1038/ncomms15475.

3. Sabolic I, Asif AR, Budach WE, Wanke C, Bahn A, Burckhardt G. Гендерні відмінності у функції нирок. Арка Пфлюгерса 455: 397–429, b2007. doi:10.1007/s00424-007-0308-1.

4. Рамірез Л.А., Салліван Дж.К. Статеві відмінності при гіпертонії: де ми були і куди йдемо. Am J Hypertens 31: 1247–1254, 2018. doi:10.1093/ajh/hpy148.

5. Лейтон А.Т., Салліван Дж.К. Останні досягнення в статевих відмінностях у функції нирок. Am J Physiol Renal Physiol 316: F328–F331, 2019. doi:10.1152/ajprenal.00584.2018.

6. Veritas LC, Girardi ACC, Curry J, Pei L, Ralph DL, Tran A, Castelo-Branco RC, Pastor-Soler N, Arranz CT, Yu ASL, McDonough AA. Статева диморфія ниркових транспортерів і гомеостаз електролітів. J Am Soc Nephrol 28: 3504–3517, 2017. doi:10.1681/ASN.

7. Лі К'ю, Макдоно А.А., Лейтон Х.Е., Лейтон А.Т. Функціональні наслідки статевого диморфізму патернів транспортера разом із проксимальним канальцем щура: моделювання та аналіз. Am J Physiol Renal Physiol 315: F692–F700, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00171.2018.

8. Мітч МИ. Метаболічні та клінічні наслідки метаболічного ацидозу. J Nephrol 19 Suppl 9: S70–S75, 2006.

9. Хамм LL, Nakhoul N, Hering-Smith KS. Кислотно-основний гомеостаз. Clin J Am Soc Nephrol 10: 2232–2242, 2015. doi:10.2215/CJN.07400715.

10. Вайнер ID, Мітч WE, Сендс JM. Метаболізм сечовини та аміаку та контроль екскреції азоту нирками. Clin J Am Soc Nephrol 10: 1444–1458, 2015. doi:10.2215/CJN.10311013.

11. Wrong O, Davies HE. Виділення кислоти при захворюваннях нирок. QJ Med 28: 259–313, 1959.

12. Baertl JM, Sancetta SM, Gabuzda GJ. Зв'язок гострого виснаження калію з метаболізмом амонію в нирках у пацієнтів з цирозом. J Clin Invest 42: 696–706, 1963. doi:10.1172/JCI104761.

13. Maher T, Schambelan M, Kurtz I, Hunter HN, Jones JW, Sebastian A. Полегшення метаболічного ацидозу шляхом дієтичного обмеження калію у пацієнтів з гіперкаліємією та хронічною нирковою недостатністю. J Lab Clin Med 103: 432–445, 1984.

14. Шир Л., Габузда Г.Й. Дефіцит калію та ендогенне надлишок амонію з нирок. Am J Clin Nutr 23: 614–618, 1970. doi:10.1093/acne/23.5.614. F642 AJP-Renal Physiol doi:10.1152/ajprenal.00260.2021 www.ajprenal.org

15. Tannen RL, McGill J. Вплив калію на вироблення аміаку в нирках. Am J Physiol 231: 1178–1184, 1976. doi:10.1152/ajplegacy. 1976.231.4.1178.

16. Weiner ID, Verlander JW. Транспортери аміаку та їх роль у кислотно-лужній рівновазі. Physiol Rev 97: 465–494, 2017. doi:10.1152/physrev.00011.2016.

17. Kovesdy CP, Anderson JE, Kalantar-Zadeh K. Зв’язок рівнів бікарбонату сироватки зі смертністю у пацієнтів із ХХН, незалежною від діалізу. Nephrol Dial Transplant 24: 1232–1237, 2009. doi:10.1093/ndt/gfn633.

18. Navaneethan SD, Schold JD, Arrigain S, Jolly SE, Wehbe E, Raina R, Simon JF, Srinivas TR, Jain A, Schreiber MJ Jr, Nally JV Jr. Сироватковий бікарбонат і смертність у стадії 3 і 4 стадії хронічної хвороби нирок . Clin J Am Soc Nephrol 6: 2395–2402, 2011.

19. Рафаель К.Л., Мерфі Р.А., Шліпак М.Г., Саттерфілд С., Х’юстон Г.К., Себастьян А., Селлмейєр Д.Е., Пател К.В., Ньюман А.Б., Сарнак М.Дж., Ікс Дж.Х., Фрід Л.Ф.; Азбука здоров'я Дослідження. Концентрація бікарбонату, кислотно-лужний стан і смертність у дослідженні здоров'я, старіння та складу тіла. Clin J Am Soc Nephrol 11: 308–316, 2016.

20. Харріс А.Н., Лі Х.В., Осіс Г., Фанг Л., Вебстер К.Л., Верландер Дж.В., Вайнер І.Д. Відмінності ниркового метаболізму аміаку в нирках чоловіків і жінок. Am J Physiol Renal Physiol 315: F211–F222, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00084.2018.