Переналагодження метаболізму глюкози та ліпідів, викликане глушінням G-білкового рецептора 17, забезпечує перехід олігодендроцитів-попередників до мієлінізуючих клітин

Анотація:У зрілій центральній нервовій системі (ЦНС) олігодендроцити (ОЛ) забезпечують підтримку та ізоляцію аксонів завдяки виробленню мієлінової оболонки. Під час їх дозрівання до мієлінізуючих клітин ОЛпотрібна енергія та будівельні блоки для ліпідів, що передбачає великі інвестиції венергетичне паливоімолекулярні джерела вуглецю. Олігодендрогліальний G-білковий рецептор 17 (GPR17) став ключовим гравцем у дозріванні OL; він досягає максимальної експресії в пре-ОЛ, але потім його потрібно інтерналізувати, щоб забезпечити термінальне дозрівання. У цьому дослідженні ми прагнемо з’ясувати роль фізіологічного GPR17зниження регуляції метаболізму ПРшляхом застосування транскриптоміки, метаболоміки та ліпідоміки для диференціації ПР. Після глушіння GPR17 ми виявили значне збільшення зрілих маркерів OL і зміни кількох генів, залучених дообмін глюкозиібіосинтез ліпідів. Ми також спостерігали підвищеннявиділення лактату, який частково відповідає заприскорення дозріванняіндукованийЗменшення GPR17. Одночасно виснаження GPR17 також змінило кінетику специфічного мієлінукласи ліпідів. У всьому світі це дослідження розкриває функціональний зв’язок міжВираз GPR17, виділення лактатуісклад мієлінуі припускає, що інноваційні втручання, спрямовані на GPR17, можуть сприяти ендогенній мієлінізації при демієлінізуючих захворюваннях.

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ CISTANCHE, ЩО ПОВ’ЯЗАНО ЗСПРИЯННЯ ЕНДОГЕННОЇ МІЄЛІНІЗАЦІЇ

Ключові слова:клітина-попередник олігодендроцита; олігодендроцит;енергетичний обмін; гліколіз; лактат; мієлінові ліпіди; транскриптоміка;метаболоміка; ліпідоміка; мієлінізація

1. Введення

У центральній нервовій системі (ЦНС) олігодендроцити (ОЛ) є клітинами, відповідальними за виробництво мієліну, ізоляційної структури, що характеризується винятково високим вмістом ліпідів, що зберігає функцію аксонів і забезпечує швидку нейрональну провідність [1]. Ці спеціалізовані функції вимагають, щоб клітини-попередники олігодендроцитів (OPC) пройшли чітко організовану програму диференціювання, під час якої вони поступово змінюють свій метаболізм і змінюють склад своєї плазматичної мембрани шляхом синтезу типових ліпідів мієліну [2]. Один OL може мієлінізувати до 50 аксонів із 150 шарами ущільненої мієлінової мембрани на сегмент, що вимагає значної енергетичної потреби [3]. Дослідження in vitro показали, що швидкість гліколізу порівняно з окисним фосфорилюванням залежить від стадії диференціювання OL [4,5], і припустили, що новоутворені OL/пізні OPC є найбільш вразливими до інгібування комплексу I [6]. За оптимальних умов культивовані постнатальні OPCs та OLs покладаються на окисне фосфорилювання для синтезу АТФ, тоді як дорослі OL переважно використовують гліколіз [7]. Цікаво, що за наявності середовища з низьким вмістом глюкози розвиток OL і мієлінізація можуть підтримуватися монокарбоксилатами, такими як кетонові тіла та лактат, транспортування яких у клітину/з клітини вимагає монокарбоксилатних транспортерів (MCT). Варто відзначити, що Ітіхара та його колеги показали, що лактат здатний врятувати цикл OPC і диференціацію в умовах низького вмісту глюкози, і що цей ефект пригнічується інгібітором транспортера лактату, що свідчить про те, що доступність лактату дозволяє OL підтримувати окисне фосфорилювання та синтез ліпідів мієліну [4]. . Різні класи ліпідів присутні в OL і мієлінових мембранах, включаючи холестерин, фосфоліпіди та глікосфінголіпіди. Хоча в мієліні немає унікальних видів ліпідів, послідовні зміни частки кількох видів ліпідів були описані в мембрані OL під час диференціювання [8].

ОЛ також відіграють активну та динамічну роль у метаболізмі нейронів [9]. Вони поглинають глюкозу, що надходить із кровотоку, і здійснюють гліколіз для виробництва пірувату та лактату, який потім доставляється до аксонального відділу через MCT, таким чином уможливлюючи мітохондріальне дихання та генерацію АТФ [10].

Під час їх диференціювання на OPC впливають зовнішні фактори, які динамічно модулюють їхні функції через взаємодію зі специфічними рецепторами [11]. Серед них G-білковий рецептор 17 (GPR17) став багатообіцяючою мішенню для ремієлінізації при розсіяному склерозі (РС). GPR17 є рецептором, який тимчасово експресується в OPCs, досягаючи своїх максимальних рівнів у пре-OL на проміжних стадіях диференціювання, експресуючи незрілий маркер O4. Його тимчасова експресія необхідна для своєчасного та фізіологічного дозрівання OPC; справді, після O4-позитивної стадії, цей рецептор має бути поступово знижений, щоб забезпечити кінцеве дозрівання та мієлінізацію [12,13]. Будь-яке втручання в цю своєчасну та фізіологічну експресію призводить до дисфункції та, зрештою, до збою мієлінізації. Надмірна експресія GPR17 була описана в кількох моделях захворювань, таких як ішемія головного мозку [14], демієлінізація, спричинена купризоном і лізолецитином [15,16], стани, подібні до хвороби Альцгеймера [17], бічний аміотрофічний склероз [18] та експериментальна аутоімунна хвороба. енцефаломієліт (ЕАЕ) [15,19]. Помітне підвищення регуляції GPR17 та/або накопичення клітин, що експресують GPR17-, на межі демієлінізованих уражень також спостерігалося у пацієнтів із РС [19,20], черепно-мозковою травмою [21] та вродженою лейкоенцефалопатією [22]. За наявності сильних прозапальних станів клітини, що експресують GPR17-, накопичуються в місцях ураження, залишаючись застряглими на проміжних стадіях і не здатними сприяти ремієлінізації, що свідчить про те, що дисрегуляція понижувальної регуляції рецепторів сприяє збою ремієлінізації та хворобі прогресування. Незважаючи на ці дані, молекулярні події, що є наслідком зниження регуляції GPR17, не були повністю з’ясовані. Слід зазначити, що вважається, що метаболічні дисфункції відіграють важливу роль у механізмі прогресування різних нейродегенеративних розладів [23], у тому числі РС [24–26]. Наявність метаболічної дисфункції при РС вимагає кращого розуміння ролі біоенергетичних метаболітів та пов’язаних з ними механізмів у регуляції функції ПР. Виходячи з цих міркувань, у цьому дослідженні ми прагнемо зрозуміти, чи і як модуляція GPR17 безпосередньо впливає на біоенергетику OL під час диференціювання за допомогою профілювання транскриптів, метаболітів і ліпідів. Транскриптомний аналіз показав, що глушіння GPR17 у диференційованих OPCs збільшує експресію зрілих маркерів і індукує зміни в кількох генах, залучених до регуляції транскрипції гомеостазу ліпідів і глюкози. Крім того, наш метаболомічний аналіз показав, що після зниження регуляції GPR17 OL перебудовують свій метаболізм і збільшують вивільнення лактату, що може безпосередньо впливати на програму диференціації OL. Крім того, за допомогою ліпідомічного аналізу ми також показали, що глушіння GPR17 змінює велику кількість мієліноспецифічних ліпідів. Разом ці результати свідчать про те, що зниження регуляції GPR17 у диференціюючих OL викликає зміни як енергетичного метаболізму, так і мембранних ліпідів, необхідних для їх диференціації в зрілі мієлінізуючі клітини, і що націлювання на GPR17 можна використовувати для порятунку метаболічних дисфункцій, які зазвичай пов’язані з демієлінізуючими захворюваннями.

2. Матеріали та методи

2.1. Дотримувались інструкцій Animal Care International (Європейський закон Директива 2010/63/UE) та національних (Італійський закон DL № 26, 4 березня 2014 р.) рекомендацій щодо догляду та використання тварин. Усі процедури були схвалені Міністерством охорони здоров’я Італії (5247B.N.L2Y to MPA). Вагітних щурів придбали у Charles River Italia та утримували в режимі 12-год світла/12-год темряви при 21 ◦C, із дієтою та водою ad libitum та збагаченням середовища.

2.2. Ізоляція OPC щурів

Первинні OPC щурів були отримані з постнатального дня 2 (P2) кори головного мозку щурів Sprague-Dawley, об’єднаної разом, як описано раніше [27, 28]. OPCs поміщали на полі-D, вкриті L-орнітином (кінцева концентрація 50 мкг/мл; Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) 10 см чашки (2–4 × 105 клітин/накривне скло) для метаболомічного аналізу, на полі-D , вкриті L-орнітином 13-мм скляні покривні скельця для імуноцитохімії (1–2 × 104 клітин/покривне скельце), а також на полі-D, вкриті L-орнітином 6-лункові планшети (7 × 104 клітин/ накривне скельце) для ліпідомічного та QRT-PCR аналізу. Клітини поміщали в нейробазальне середовище з додаванням 2 відсотків B27 (Life Technologies, Монца, Італія), 2 мМ L-глутаміну, 10 нг/мл тромбоцитарного фактора росту людини-BB (Sigma-Aldrich, Мілан, Італія) і 10 нг/мл основного фактора росту фібробластів людини (Life Technologies, Монца, Італія) для сприяння проліферації протягом 3 днів.

2.3. трансфекція siRNA

OPC трансфікували одразу після переходу з проліферуючого середовища на диференційоване (нейробазальне середовище з додаванням 2 відсотків B27 (Life Technologies, Монца, Італія), 2 мМ L-глутаміну та 15 нМ гормону Т3). МіРНК On-target плюс SMARTpool, специфічні для транскрипту GPR17 щурів (Dharmacon, Lafayette, CO, USA), трансфікували в кінцевій концентрації 50 нМ реагентом Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies, Монца, Італія), дотримуючись протоколу виробника. Трансфекція пулу нецільової РНК використовувалася як негативний контроль.

2.4. Профілювання транскриптома та аналіз мікрочипів

Екстракцію РНК і аналіз транскриптомів проводили відповідно до опублікованих протоколів [27]. Коротко, OPC лізували буфером RLT (Qiagen, Мілан, Італія) через 2 дні після трансфекції siRNA, а загальну РНК екстрагували за допомогою набору RNeasy Micro (Qiagen, Мілан, Італія), дотримуючись протоколу виробника. Якість РНК оцінювали за допомогою біоаналізатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Мілан, Італія). РНК із числом цілісності РНК (RIN) > 7 використовували для аналізу мікрочипів. Мічену кРНК синтезували із 100 нг загальної РНК за допомогою одноколірного набору для мічення Quick-Amp Low Input (Agilent Technologies, Мілан, Італія) у присутності ціаніну 3-CTP. Загальну РНК гібридизували на мікрочипах SurePrint G3 Rat Gene Expression Microarrays (#G4858A-074036, Agilent Technologies, Мілан, Італія). Цей мікрочип складається з 60-мерних ДНК-зондів, синтезованих in situ, які представляють 30 584 транскрипти щурів. Гібридизацію проводили при 65 ◦C протягом 17 годин в обертовій печі (Microarray Facility, Laboratorio per le Tecnologie delle Terapie Avanzate, LTTA, Феррара, Італія). Аналіз одноколірної експресії генів проводили згідно з процедурою виробника. Програмне забезпечення Feature Extraction 10.7.3 (Agilent Technologies, Мілан, Італія) використовувалося для отримання необроблених даних мікрочипів. Для отримання списку генів, що диференційовано експресуються між двома експериментальними умовами, враховували кратну зміну ±1,5 і скориговане за FDR значення p < 0,07.

2.5. Біоінформаційний аналіз

Програмне забезпечення Metacore™ (Clarivate Analytics, Лондон, Великобританія) і QIAGEN Ingenuity® Pathway Analysis (IPA®, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity, доступ 14 травня 2017 р.) використовувалися для виконання кластеризації на основі шляху на диференціально експресовані гени після сайленсингу GPR17 в OPC, щоб ідентифікувати загальні біологічні процеси. ToppGene Suite використовувався для виконання аналізу збагачення на основі онтології генів [29].

2.6. Цільова метаболоміка та ліпідоміка

Метаболомічні дані були отримані за допомогою рідинної хроматографії в поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS), як описано раніше [30,31], з деякими модифікаціями, описаними нижче. Ми використовували потрійний квадрупольний мас-спектрометр API-3500 (AB Sciex, Framingham, MA, USA) у поєднанні з ExionLC™ AC System (AB Sciex). Клітини OPC з різних часових проміжків і/або трансфіковані siRNA розбивали тканинним лазером протягом 1 хв на максимальній швидкості в 250 мкл крижаного метанолу/води/ацетонітрилу 55:25:2{{5{{ 66}}}}. Лізати обертали при 15,000× g протягом 15 хвилин при 4 ◦C. Потім зразки висушували під N2 при 40 ◦C і ресуспендували в 125 мкл крижаного MeOH/H20/ACN 55:25:20 для наступних аналізів. Кількісне визначення амінокислот проводили за допомогою попередньої дериватізації. Коротко, 25 мкл із 125 мкл зразків було зібрано та висушено окремо в потоці N2 при 4{{80}} ◦C. Висушені залишки ресуспендували в 50 мкл фенілізотіоціанату (PITC), EtOH, піридину та води 5 відсотків:31,5 відсотків:31,5 відсотків:31,5 відсотків, а потім інкубували протягом 20 хвилин при RT, сушать під N2 при 40 ◦C протягом 90 хв і остаточно ресуспендують через 1{{1{{1{{1{{1{{110}} 9}}6}}5}}1}}0 мкл 5 мМ ацетату амонію в MeOH/H2O 50:50. Кількісне визначення різних амінокислот проводили за допомогою колонки C18 (Biocrates, Інсбрук, Австрія), яку підтримували при 50 ◦C. Рухомими фазами для аналізу позитивних іонів були фаза A: 0.2% мурашиної кислоти у воді та фаза B: 0.2% мурашиної кислоти в ацетонітрилі. Градієнт був T0: 100 відсотків A, T5,5: 5 відсотків A, T7: 100 відсотків A зі швидкістю потоку 500 мкл/хв. Кількісне визначення енергетичних метаболітів і кофакторів проводили за допомогою ціанофазної колонки LUNA (50 мм × 4,6 мм, 5 мкм; Phenomenex) шляхом 5,5-хвилинного циклу в режимі негативних іонів з двома окремими циклами. Протокол А; рухомою фазою A була вода, а фазою B був 2 мМ ацетат амонію в MeOH, а градієнт був T0: 80 відсотків B 0,5 мл/хв; T1: 80 відсотків B 0,5 мл/хв; T1.01: 20 відсотків B 0,5 мл/хв; T2.0: 20 відсотків B 0,5 мл/хв; T2.01: 80 відсотків B 0,5 мл/хв; T5.5: 80 відсотків B 0,5 мл/хв. протокол B; рухомою фазою A була вода, а фазою B був 2 мМ ацетат амонію в MeOH, а градієнт був T0: 50 відсотків B 0,5 мл/хв; T1: 50 відсотків B 0,5 мл/хв; T1.01: 0 відсотків B 0,5 мл/хв; T2.0: 0 відсотків B 0,5 мл/хв; T2.01: 50 відсотків B 0,5 мл/хв; T5.5: 50 відсотків B 0,5 мл/хв. Кількісне визначення ацил-карнітинів проводили на тих самих зразках за допомогою колонки C18 (Biocrates, Інсбрук, Австрія), яку підтримували при 50 ◦C. Зразки аналізували шляхом 5,5-хвилинного циклу в режимі позитивних іонів. Мобільні фази були A: 0,1 відсотка мурашиної кислоти в H20 B: 0,1 відсотка мурашиної кислоти в MeOH, а градієнт був T0:30 відсотків B, T0,8: 30 відсотків A, T2: 100 відсотків B, T3: 100 відсотків B, T3 .01: 30 відсотків B, T5.5: 30 відсотків B зі швидкістю потоку 500 мкл/хв.

Рівні фосфоліпідів і жирних кислот оцінювали за допомогою (LC)-MS/MS відповідно до опублікованого протоколу [32,33] з деякими модифікаціями, описаними нижче. Фосфоліпіди аналізували як негативною, так і позитивною іонізацією на екстрактах MeOH/H20/ACN за допомогою потрійного квадрупольного мас-спектрометра API-4000 (AB Sciex, Framingham, MA, США) у поєднанні з системою ВЕРХ (Agilent ) і автосамплер CTC-PAL HTS (система PAL). Для негативного іонізаційного аналізу ліпіди розділяли через ціанофазну колонку LUNA (50 мм × 4,6 мм, 5 мкм; Phenomenex) протягом 5 хвилин, а рухомою фазою був 5 мМ ацетат амонію в MeOH. Для позитивної іонізації аналіти розділяли на колонці XTerra RP18 3.5 мкм 4,6 мм × 100 мм (Waters) протягом 8 хвилин, а рухомою фазою була 0,1% мурашина кислота в MeOH. Вільні жирні кислоти аналізували в режимі негативних іонів на колонці Hypersil Gold C8 (Life Technologies) з рухомою фазою, що складається з 10 мМ діізопропілетиламіну та 15 мМ оцтової кислоти в H2O/MeOH 97:3. Усі метаболіти, проаналізовані в описаних протоколах, попередньо перевірялися за допомогою чистих стандартів, за винятком фосфоліпідів, де перевірялися лише представники різних класів. Програмне забезпечення MultiQuant™ (версія 3.0.3, AB Sciex) використовувалося для аналізу даних і перегляду піків хроматограм. Для обробки даних необроблені площі були нормалізовані за медіаною всіх площ метаболітів у тому самому зразку. Зокрема, ми визначили відносну кількість метаболітів (ma N) як:

де Xn являє собою площу піку метаболіту n для зразків a, b, . . . , z і Ma n =1 a представляє медіану площ піків метаболіту n для зразків a, b, . . . , z. Потім отримані дані були перетворені за допомогою log10-перетворення та масштабування за Парето для корекції гетероскедастичності, зменшення асиметрії даних і зменшення ефектів маски [34]. Детально отримані значення були перетворені за допомогою log10, а потім масштабовані за методом Парето наступним чином:

де xi — перетворене значення в матриці даних (i (метаболіти), j (зразки)), а si — стандартне відхилення перетворених значень метаболітів [35]. Отримані значення вважали відносними рівнями метаболітів. Обробку та аналіз даних проводили за допомогою веб-інструменту MetaboAnalyst 5.0 [36].

2.7. Імуноцитохімія та підрахунок клітин

Клітини фіксували в 4-відсотковому параформальдегідно-фосфатному буферному розчині, що містить 4 відсотки сахарози. Були використані такі первинні антитіла: кролячі анти-GPR17 (1:100; Cayman Chemical) і щурячі анти-MBP (1:200; Merck Millipore, Мілан, Італія). Інкубацію первинних антитіл проводили протягом 2,5 год при кімнатній температурі або протягом ночі при 4 ◦C. Потім клітини інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з вторинними антитілами, кон’югованими з AlexaFluor 488 або AlexaFluor 555 (1:600; Life Technologies, Монца, Італія). Усі антитіла розводили у фосфатно-буферному блокуючому розчині (рН 7,4), що містив 0,3% Triton X-100. Ядра мічили УФ-флуоресцентним барвником Hoechst 33258 (1:10, 000; Life Technologies, Монца, Італія). Потім покривні скла встановлювали у флуоресцентне монтажне середовище (Dako). Позитивні клітини для вибраних маркерів підраховували з 20 випадкових полів для кожного покривного скла (0,07 мм2/Fifield). Результат було виражено у відсотках від кількості ядер, а потім нормалізовано порівняно з контролем, встановленим на 100 відсотків.

2.8. Лікування AR-C155858

Через день після трансфекції siRNA (день у диференціації 1) контрольні та GPR17-заглушені OPC обробляли AR-C155858 (Tocris, Великобританія; кінцева концентрація: 1 мкМ) або носієм (0.04 відсотка ДМСО). Через два дні (день диференціювання 3) OPC лізували для подальшого аналізу РНК або знову обробляли, а потім збирали в день диференціювання 5.

2.9. Загальна екстракція РНК, ретротранскрипція та аналіз КПЦР

Клітини лізували реагентом Trizol (Life Technologies, Монца, Італія) через 1, 2, 3 або 5 днів після трансфекції. Тотальну РНК екстрагували за допомогою набору для мікропрепаратів Direct-zol RNA (Zymo Research, Німеччина). Для аналізу експресії генів синтез кДНК проводили, починаючи з 400–800 нг загальної РНК, використовуючи набір для синтезу кДНК SensiFAST™ (Bioline, Лондон, Великобританія). Експресію всіх генів аналізували за допомогою SensiFAST™ SYBR Supermix (Bioline, Лондон, Великобританія) і нормалізували до експресії GAPDH за допомогою системи ПЛР у реальному часі CFX96 (Bio-rad, Мілан, Італія) згідно з протоколом виробника.

2.10. Статистичний аналіз

Дані представлено як середнє ± SEM і проаналізовано за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 8.0.1. Для всіх порівнянь між двома групами з нормальним розподілом було виконано двобічний непарний t-тест Стьюдента. Двосторонні парні t-тести Стьюдента використовували для аналізу зразків людей. Для множинних порівнянь груп із нормальним розподілом використовували односторонній або двосторонній дисперсійний аналіз (ANOVA), що супроводжувався множинним ретроспективним тестом Тьюкі або Сідака. Якщо не зазначено інше, p < 0.05 вважалося статистично значущим.

Запитуйте ще:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон: плюс 86 15292862950

МАГАЗИН:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop