joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

IL-22-опосередковане метаболічне репрограмування нирок через PFKFB3 для лікування пошкодження нирок

Вей Чен та ін

Графічний Анотація

IL-22 слабшаєниркатравмашляхом метаболічного перепрограмування ниркових ТЕС, регулює мітохондріальну функцію та гліколіз у пошкоджених ТЕС, а також зменшує накопичення мітохондріальних АФК і дисфункціональних мітохондрій шляхом індукції активності AMPK/AKT і PFBFK3. ПоліпшенняниркатравмаIL-22 через регуляцію метаболізму, відповідну передачу сигналів підтверджено на тваринних моделях ураження нирок, викликаного цисплатином, і діабетичної нефропатії.

Анотація

Пошкодження нирок ініціює погіршення метаболічних станів у клітинах канальців, що призводить до розвитку термінальної стадії ниркової недостатності (ESTD). Інтерлейкін-22 (IL- 22) є ефективним терапевтичним антидотом дляниркатравмачерез сприяння відновленню нирок, але мало відомо про основні молекулярні механізми. Тут ми спочатку надаємо докази того, що IL-22 послаблюєтьсяниркатравмачерез метаболічне перепрограмування епітеліальних клітин ниркових канальців (ТЕК). Зокрема, наші дані свідчать про те, що IL-22 регулює функцію мітохондрій і гліколіз у пошкоджених TEC. Подальші спостереження показують, що IL-22 зменшує накопичення мітохондріальних активних форм кисню (АФК) і дисфункціональних мітохондрій шляхом індукції сигналізації AMPK/AKT і активності PFBFK3. У мишей поліпшення стануниркатравмаа також некроз і покращення функцій нирок шляхом регуляції відповідної сигналізації метаболізму та мітохондріальної придатності рекомбінантного IL-22 підтверджено на тваринних моделях пошкодження нирок, викликаного цисплатином, і діабетичної нефропатії (ДН). Взяті разом, наші висновки відкривають нові механізми уявлення про захисну дію IL-22 на нирки та висвітлюють терапевтичні можливості IL-22 і залучених метаболічних регуляторів при різних захворюваннях нирок.

КЛЮЧОВІ СЛОВАінтерлейкін-22,ниркатравма, метаболічне перепрограмування, мітохондріальна дисфункція

Цистанхеtubulosaзапобігає захворюванням нирок, натисніть тут, щоб отримати зразок

1. ВВЕДЕННЯ

Гострийниркатравма(ГПН), загальна проблема охорони здоров’я, пов’язана з високою смертністю та захворюваністю, вражає мільйони госпіталізованих пацієнтів у всьому світі та демонструє швидке зростання захворюваності.1–3 Основна патофізіологія ГПН не повністю з’ясована, але включає пошкодження та апоптоз ниркової тубулярні епітеліальні клітини (ТЕК), особливо в проксимальному канальці.4–7 Багато видів літератури підтверджують, що їх серйозне та стійке пошкодження часто спричиняє неповне та неадаптивне відновлення тканин, що призводить до запальної відповіді, тубулярної дегенерації, фіброзу нирок та можливого прогресування до термінальна стадія ниркової недостатності (ESTD).8-10 На жаль, крім підтримуючої терапії на основі діалізу, немає добре встановлених терапевтичних засобів дляниркатравмадоступні. Тому проактивне лікування є дуже необхідним, щоб зменшити страждання, які воно завдає пацієнтам, і значний фінансовий тягарниркатравмаіндивідам і суспільству.

Інтерлейкін-22 (IL-22), важливий член сімейства цитокінів IL-10, нещодавно привернув величезну увагу як агент виживання при численних захворюваннях, спричинених пошкодженням епітелію.11–13 IL -22 викликає захист тканин і гомеостаз головним чином через активацію сигнального шляху STAT3 і сприяння проліферації епітелію.14,15 Важливо, що дослідження показали, що експресія IL-22R1 обмежена нирковими проксимальними TEC , а лікування IL-22 може захистити від ушкодження ниркового епітелію та прискорити регенерацію канальців.16,17 Однак, хоча накопичення доказів свідчить про те, що IL- 22 є ефективним терапевтичним антидотом дляниркатравма, мало відомо про основні механізми відновлення TEC, викликаного IL- 22-. Розуміння молекулярної основи IL-22 має важливе значення як для вивчення того, як IL-22 діє на пригнічення AKI або ESTD, так і для виявлення молекулярних модифікаторів, а також важливих процесів, пов’язаних із запобіганням пошкодженню нирок.

Відновлення нирок після пошкодження є метаболічно залежним і складним процесом.18 Останні дані вказують на те, що метаболічні сигнатури клітин можуть регулювати виживання та пластичність ниркових клітин і, таким чином, надають корисну механістичну інформацію про те, як метаболічні процеси контролюють відновлення тканин.19,20 Зокрема, ці висновки показують, що метаболічне перепрограмування за допомогою PGC1 або системи S-нітрозо-КоА-редуктази захищає відниркатравма. Механічно посилений гліколіз і окисне фосфорилювання (OXPHOS) може сприяти росту та захисним сигнальним шляхам або може забезпечувати вищі енергетичні потреби мітозу та анаболічного біосинтезу під час відновлення органів.19,21 Нещодавно наші дослідження продемонстрували, що IL-22 полегшує мітохондріальна дисфункція в печінці, яка залучає клітинні метаболічні процеси.22,24 Таким чином, ми запитуємо, чи захищає IL-22 від пошкодження нирок і апоптозу шляхом регулювання їх метаболічних станів. Щоб визначити механізми відновлення нирок, опосередкованого IL-22, ми обробляємо клітини проксимального тубулярного епітелію людини (PTEC) за допомогою стресової стимуляції. Ми припускаємо, що IL-22 стимулює метаболічне перепрограмування для посилення гліколізу та OXPHOS, які запобігають дисфункції TEC. Крім того, ми демонструємо, що IL-22 індукував цю програму через активацію сигналізації AMPK/AKT та її молекулярних модифікаторів для полегшення мітохондріальної дисфункції. Наші спостереження проливають світло на регуляцію метаболічних станів для лікування та профілактики захворювань нирок і дають нове розуміння для розробки ефективних нових втручань для ушкодження органів загалом.

Цистанхея може лікуватиниркатравма

2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

2.1 Реактиви

Олігоміцин, ротенон і ціанід п-трифторметоксифенілгідразон (FCCP) були отримані від Sea horse Biosciences; рекомбінантний IL-22 надано компанією Novoprotein (Китай); отримано цисплатин (Crisp.), MitoTrackerGreen, LY294002, 5,5′,6,6′-тетрахлоро-1,1′,3,3′-тетраетилбензімідазолілкарбоціанініодид (JC-1) та сполуку С. від Beyotime Biotechnology (Китай); антитіла, націлені на Glut1, -Actin, p-AMPK, AMPK і GAPDH, були придбані в Abcam; антитіла до STAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473), PFKFB3 і Caspase-3 були придбані в Cell SignalingTechnology; рапаміцин, пальмітинова кислота (Palm.), Z-VAD-FMK і глюкоза були отримані від Sigma-Aldrich; MitoSOX, Hoechst33342, MitoTracker Red і PKH26 були отримані від Invitrogen.

2.2 Культура клітин

Епітеліальну клітину проксимального канальця людини (HK{{0}}) було отримано з банку клітин Шанхайського інституту біохімії та клітинної біології Академії наук Китаю та зберігалося відповідно до стандартних протоколів. HK-2 висівали в шестилункові планшети (1 × 106 клітин/лунку) або 96-лункові планшети (1 × 105 клітин/лунку) і культивували в 90% середовищі RPMI1640 (Gibco) з додаванням 100 ОД/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) (Gibco). Спочатку ми інкубували HK-2 з IL-22 (0,5 мкг/мл) протягом 0,5 години, потім 50 мМ d-глюкози або 5 мкг/мл цисплатину або 0,2 мМ пальмітинової кислоти або або 4 мкМ доксорубіцину (DOX ) протягом 24 год. У деяких випадках клітини культивували в присутності Z-VAD-FMK (10 мкМ), сполуки C (5 мкМ), LY294002 (20 мкМ) або рапаміцину (50 нМ) протягом зазначеного часу.

2.3 Експерименти з морським коником

Ми проаналізували TEC за допомогою аналізатора позаклітинного потоку Seahorse XF96 для виявлення змін рівня позаклітинної кислоти (ECAR) і швидкості споживання кисню (OCR). Коротко, HK-2 (1 × 105) вирощували на 96-лункових пластинах Seahorse протягом ночі. Потім ми промили клітини середовищем для аналізу морського коника, що містило 1 мМ пірувату, 10 мМ глюкози та 2 мМ глутаміну (або без глюкози для тестування ECAR) в атмосфері без CO2 при 37 ◦C протягом {{18 }}.5 год. Експериментальні дані були записані після введення згаданих нижче інгібіторів в оптимальній концентрації FCCP (1.0 мкМ), олігоміцину (1,0 мкМ), ротенону/антиміцину А (0,5 мкМ), 2-DG (50 мМ) або глюкози (10 мМ).

Цистанхея може лікуватиураження нирок

2.4 Моделі мишей і тварин

Самці мишей BALB/c (6–8 тижнів) були придбані у Slaccas Experimental Animal Co. (Шанхай, Китай). Db/db та Db/m миші були надані Модельним дослідницьким центром тварин Нанкінського університету (Нанкін, Китай). Усіх мишей утримували в приміщеннях, вільних від патогенів (SPF), і вирощували відповідно до стандартних протоколів. Для моделі AKI миші BALB/c отримували цисплатин (20 мг/кг) або фізіологічний розчин шляхом внутрішньочеревної ін’єкції. Db/db мишей годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD) у зазначені моменти часу, щоб викликати діабетичну нефропатію (DN). Db/m мишей годували харчовими дієтами як контрольну групу. В експериментах на тваринах з AKI IL-22 вводили внутрішньоочеревинно в дозі 0,5 мг/кг/день або 1,5 мг/кг/день протягом 4 днів поспіль. В експериментах на тваринах з DN внутрішньочеревно вводили IL-22 у дозі 2,5 мг/кг двічі на тиждень протягом восьми тижнів поспіль. Контрольні миші отримували відповідну кількість PBS. Наші експериментальні процедури на тваринах проводилися згідно з протоколами, оціненими та схваленими Комітетом з етики догляду та використання тварин Фармацевтичної школи Університету Фудань. Імуногістохімічне фарбування, вимірювання потенціалу мітохондріальної мембрани, гістологічне фарбування та фарбування активних форм кисню (АФК) зрізів нирок проводили, як описано раніше.22–24

2.5 ПЛР у реальному часі

Ми отримали загальну РНК за допомогою реагентів TRNzol (Beyotime Biotechnology, Китай) із зразків клітин або тканин, а потім транскрибували їх у кДНК за допомогою набору для тестування зворотної транскриптази MMLV (Beyotime Biotechnology). Рівень експресії мРНК аналізували за допомогою приладів ПЛР у реальному часі (BioRad) з використанням набору для аналізу qPCR-mix SYBR green (Beyotime Biotechnology) і стандартизували відповідно до GAPDH.

2.6 Проточна цитометрія

Клітини нирок вирощували та обробляли, як описано вище. Фарбування MitoSOX (АФК мітохондрій), MitoTracker Green (загальна маса мітохондрій) і MitoTracker Red (потенціал мітохондріальної мембрани) проводили відповідно до інструкцій виробника та попередніх досліджень.22–24 Ми отримали результати за допомогою проточного цитометра Beckman Coulter і Програмне забезпечення CytExpert (BD Biosciences).

2.7 Поглинання глюкози

Ми виміряли концентрацію глюкози в надосадовій рідині клітинної культури за допомогою аналізу поглинання глюкози згідно з протоколом виробника та попередніми дослідженнями (GAHK20; Sigma). Нормалізацію результатів проводили за кількістю клітин.

2.8 Генний нокдаун

Ми використовували малу інтерферуючу РНК (siRNA; RiboBio, Китай), щоб знищити певні гени. Спочатку Lipofectamine RNAiMAX і siRNA (100 пмоль) обережно змішували за допомогою піпетування та інкубували при 37 ◦C протягом 0,5 години. Потім ми змінили стандартне культуральне середовище клітин на коктейль для трансфекції та інкубували клітини протягом 6 годин для трансфекції гена siRNA. Далі ми замінили коктейль для трансфекції на свіже середовище для культивування клітин. Через 48 годин клітини нирок інкубували з IL-22 для подальших досліджень.

Цистанхея може лікуватиураження нирок

2.9 Вестерн-блот

Ми екстрагували загальні білки з клітин або тканин за допомогою буфера для лізису RIPA (Beyotime Biotechnology, Китай). Потім ми зібрали лізати центрифугуванням при 4 ◦ C при 12 000 об/хв протягом 10 хв. Потім лізати нагрівали з буферами для зразків при 100 ◦C протягом 15 хвилин, піддавали електрофорезу в додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі (SDS–PAGE) і електропереносили на мембрану з полівінілідендифториду (PVDF) (Millipore, Німеччина). Потім мембрани блокували 5-відсотковим бичачим сироватковим альбуміном (BSA) протягом 2 годин і спільно інкубували з первинними антитілами при 4°C протягом ночі. Після триразового промивання мембрани інкубували з вторинними антитілами, кон’югованими з пероксидазою хрону (CST, США). Білкові плями візуалізували за допомогою системи хемілюмінесцентної візуалізації.

2.10 Імунофлуоресценція

Клітини нирок фіксували 3–4 відсотками параформальдегіду та пермеабілізували за допомогою 0.1% Triton X-100. Потім ми блокували клітини 5% BSA протягом 2 годин. Клітини інкубували протягом ночі з антитілом проти GLUT1 при 4°C, промивали чотири рази, а потім фарбували PKH26. Згодом клітини нирок фарбували Hoechst 33342 і встановлювали на предметні скла. Дані отримані методом конфокальної мікроскопії.

2.11 RNA-seq і біоінформатика

Зразки TEC (2 × 107) лізували, а загальну РНК екстрагували за допомогою міні-набору RNeasy згідно з протоколами виробника (Beyotime, Шанхай, Китай). РНК-секвенування еукаріотів було виконано з використанням технології секвенування наступного покоління (NGS) у системі секвенування Illumina HiSeq, що забезпечує 50-основну довжину зчитування. Вирівнювання зчитувань послідовності було виконано з використанням TopHat v2.0.12 проти збірки UCSC mm10. Диференціальний аналіз експресії розраховували за допомогою пакета DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html), а аналіз статистичної значущості проводили в R (v3.1.1; http://www). .r-project.org/). Надмірне представлення шляху було виконано за допомогою пакета R ReactomePA.

2.12 Статистика

Дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення (SD) і були показані за допомогою GraphPad Prism 5.0. Для результатів порівняння двох або більше груп різницю обчислювали за допомогою t-критерію Стьюдента або одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA): ***p < 0.00="" 1,="" **p="">< 0,01="" і="" *p=""><>

Цистанхея може лікуватиураження нирок

3 РЕЗУЛЬТАТИ

3.1 IL-22 зберігає клітинний метаболізм у ТЕС

Оскільки вважалося, що мітохондрії є важливими органелами, які інтегрують клітинний метаболізм і процеси апоптозу, ми оцінили функцію мітохондрій у ТЕС, які стимулювали за допомогоюниркатравмафакторів і обробляли IL-22.25 Як показано на малюнках 1A–D, базальна швидкість споживання кисню мітохондріями (OCR), максимальна дихальна ємність (MRC) і дихання суттєво блокувалися в TEC під час стресових ситуацій. Примітно, що цим аномаліям значною мірою запобігло лікування IL- 22. Гліколіз у пошкоджених TECs, підтверджений швидкістю позаклітинного підкислення (ECAR), також був помітно обмеженим порівняно з IL-22 плюс TECs, викликаними стимулами (рис. 1B і E). Крім того, ми продемонстрували, що порушене окисне фосфорилювання (OXPHOS) і гліколіз у пошкоджених TEC не були вторинними ефектами апоптозу через спільне лікування інгібітором пан-каспази (рис. S1). І IL-22-опосередковані репаративні ефекти на метаболічні дефекти були специфічними для ниркових TEC (рис. S2). Крім того, IL-22 сприяв OXPHOS і гліколізу клітин HK2 за відсутності подразників, що вказує на те, що вплив IL-22 на метаболічні шляхи не був специфічним для пошкоджених TEC (рис. S3). Крім того, наші результати також показали, що IL-22 сприяє експресії та транслокації IL-22R1. Тим часом фосфорилювання STAT3 і метаболічний репрограмуючий ефект IL-22 були повністю знешкоджені нокдауном IL-22R1 (рис. S4). Ці результати свідчать про те, що IL-22 відновлює метаболічний стан TEC шляхом безпосередньої активації IL-22R1. Оскільки численні докази свідчать про те, що Glut1 відіграє головну роль у гліколізі та гомеостазі глюкози26, ми запитали, чи впливає IL-22 на транслокацію або експресію Glut1. Як і очікувалося, ми продемонстрували, що IL-22 не тільки сприяє транслокації Glut1 на поверхню клітинної мембрани (PKH26) і експресії Glut1, але також посилює поглинання глюкози (рис. 1F і G). Загалом, ці спостереження показали, що IL-22 може посилювати OXPHOS і гліколіз у пошкоджених TEC.

МАЛЮНОК 1 IL-22 зберігає мітохондріальну придатність і гліколіз у TEC. (A і B) Ми використовуємо аналізатор позаклітинного потоку Seahorse XF96 для перевірки змін рівня позаклітинної кислоти (ECAR) і споживання кисню (OCR) TEC. OCR та ECAR у TEC, інкубованих з 50 мМ глюкози, або 5 мкг/мл цисплатину, або 0,2 мМ пальмітинової кислоти, або 4 мкМ DOX у присутності чи відсутності IL{{8} }. (C) Максимальна дихальна здатність (MRC) TEC, оцінена за змінами OCR у реальному часі. (D і E) Криві OCR і ECAR TEC після інкубації з олігоміцином, FCCP, глюкозою, ротеноном і {{10}}DG. (F) Локалізація та експресія ядерної (синій), Glut1 (зелений) і плазматичної мембрани (червоний) у TEC. (G) Споживання глюкози в TEC після лікування IL-22 протягом 24 год. n=3; шкала, 20 мкм; Т-критерій Стьюдента (непарний); ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.2 IL-22 зменшує накопичення дисфункційних мітохондрій у TEC через активацію мітофагії

утворення LC3 puncta в TEC після впливу подразників (рис. 2F). Потім ми виснажили мітофагію, щоб оцінити її функцію на метаболізм клітин канальців через siRNA-ATG5 (рис. S6). Наші дані свідчать про те, що виснаження мітофагії в TEC значно пригнічує захисні ефекти IL-22 у збереженні мітохондріальної придатності (рис. 2E), вказуючи на те, що IL-22 запобігає мітохондріальній дисфункції через активацію мітофагії.

МАЛЮНОК 2 IL-22 пригнічує мітохондріальну дисфункцію та накопичення мітохондріальних АФК шляхом індукції мітофагії. (A) Мітохондріальну масу пофарбували та оцінили за допомогою MitoTracker Green та проточної цитометрії. Мітохондріальні АФК оцінювали в ТЕС, пофарбованих MitoSOX (B). Потенціал мітохондріальної мембрани оцінювали в ТЕС, пофарбованих MitoTracker Green і MitoTracker Red (C); накопичення АФК у мітохондріях оцінювали за допомогою MitoTracker Green та MitoSOX (D). (E) Результати конфокального зображення свідчать про виробництво мітохондріальних АФК, мічених MitoSOX. (F) Репрезентативні мікроскопічні зображення вказують на утворення пунктату LC3-GFP у присутності або відсутності IL-22 TEC, стимульованих як (A) протягом 24 годин. (E) OCR оцінювали в присутності або відсутності IL-22 і siRNA-ATG5 протягом 24 годин. n=3; Т-критерій Стьюдента (непарний); ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.3 IL-22 підтримує мітохондріальну цілісність TEC через активацію сигналізації AMPK/AKT

Передача сигналів AMPK, як ключовий сигнальний вузол, що зв’язує виживання та метаболізм клітин, контрольований метаболізм глюкози, синтез ліпідів і функцію мітохондрій.28 Відповідно до ниркового захисного ефекту інтерлейкіну-22, опосередкованого метаболічним перепрограмуванням TEC, ми оцінили, чи IL-22 регулював цілісність мітохондрій шляхом активації трансдукції сигналу AMPK. Ми виявили, що IL-22 підвищує активність передачі сигналу STAT3/AMPK/AKT у пошкоджених TEC, про що свідчить фосфорилювання STAT3, AMPK і AKT (рис. 3A). Крім того, ці процеси були заблоковані в тубулярних клітинах без STAT3, що продемонструвало, що IL-22 регулював передачу сигналів AMPK/AKT через STAT3 (рис. 3B і C; рис. S7). Ми далі інкубували TEC із сполукою C і LY294002, щоб безпосередньо інгібувати сигнальні трансдукції AMPK/AKT, а потім оцінили їхні мітохондріальні функції та стан метаболізму. Результати показали, що спільне лікування цими сигнальними інгібіторами значною мірою запобігало покращенню OXPHOS і гліколітичного потоку, викликаного лікуванням IL-22 (рис. 3D–I), що свідчить про те, що IL-22 сприяє метаболізму TEC через активацію AMPK /AKT сигнальний шлях.

МАЛЮНОК 3. Індукція сигналізації AMPK/AKT за допомогою IL-22 підтримує придатність мітохондрій. ТЕС стимулювали 50 мМ глюкози, або 5 мкг/мл цисплатину, або 0,2 мМ пальмітинової кислоти, або 4 мкМ DOX у присутності або за відсутності IL-22, Сполука C або LY294002 для вказаного часу. (A і B) Активацію сигнального шляху AMPK/AKT у TEC або STAT3-WT і STAT3–KD TEC оцінювали за допомогою Вестерн-блот аналізу. (C і D) Проаналізовано зміни в OCR та ECAR ТВК. (E) Активацію сигнального шляху AMPK/AKT у TEC оцінювали за допомогою вестерн-блот-аналізу. (F–I) Зміни в OCR і ECAR TEC вимірювали в TEC порівняно з TEC, обробленими Сполукою C і LY294002. Т-критерій Стьюдента (непарний); n=3; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.4 IL-22 зберігає клітинний метаболізм і мітохондріальну цілісність TEC через індукцію PFKFB3

Крім того, щоб дослідити, як мітохондріальна пристосованість і метаболізм TEC покращилися, ми використали аналіз секвенування РНК (RNA-seq) для оцінки експресії генів після пошкодження стимулів і лікування IL-22. Ми продемонстрували, що кілька генів були значно змінені в TEC після інкубації IL-22 (рис. 4A). Використовуючи доступні бази даних, було проведено аналіз збагачення набору генів цих генів з підвищеною регуляцією, який припустив значне збагачення генів у сигнальному шляху AMPK і сигнальному шляху MYC-мішеней (рис. S8). Примітно, що PFKFB3 був значно індукований IL-22 з числа генів під часниркатравмафактори стимуляції (рис. 4А). Ці спостереження також були підтверджені конфокальними зображеннями, Q-PCR та вестерн-блотом. Висока експресія PFKFB3 була залежною від передачі сигналу AMPK/AKT (рис. 4B і C; рис. S9).

Попередні дослідження показали, що PFKFB3 можна регулювати за допомогою численних сигнальних трансдукцій для прискорення регенерації та відновлення епітелію після пошкодження.29,30 Таким чином, ми припустили, що IL-22 індукує PFKFB3 для збереження клітинного метаболізму TEC і підтримки їх мітохондріальної придатності . Ми помітили, що інгібування передачі сигналу AMPK/AKT знижує експресію PFKFB3 (рис. 4D). Отже, ми заглушили PFKFB3 для подальшого вивчення його функцій у TEC після інкубації IL-22. Наші висновки показали, що приглушений PFKFB3 пом’якшував метаболічний репрограмуючий вплив IL-22 на відновлення ECAR і OCR (рис. 4E і F), ​​а також запобігав поглинанню глюкози, а також дисфункції мітохондрій (рис. 4G і H). Більше того, ми додатково продемонстрували, що метаболічні перепрограмувальні ефекти IL-22 були повністю знешкоджені нокдауном STAT3-, тоді як надмірна експресія PFKFB3 могла врятувати ці фенотипи, припускаючи, що IL-22 відновив метаболічний стан пошкоджених епітеліальних клітин нирки за допомогою безпосередньої передачі сигналу STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3 (рис. S10). У сукупності ці результати показали, що активація PFKFB3 відіграє важливу роль у мітохондріальній пристосованості та елімінації дисфункціональних мітохондрій післяниркатравма.

МАЛЮНОК 4 IL-22 підтримує цілісність мітохондрій і клітинний метаболізм TEC за допомогою індукції PFKFB3. (A) Графік вулкана для експресії генів у TEC, стимульованих глюкозою, або цисплатином, або пальмітиновою кислотою, або CCl4 у присутності або відсутності IL-22 протягом 24 годин. (B) Конфокальні мікроскопічні дані продемонстрували надмірну експресію PFKFB3 у TEC після лікування IL-22, що вимагало активації сигналу AMPK/AKT. (C) Результати ПЛР у реальному часі вказують на те, що IL-22 індукував надмірну експресію PFKFB3 у TEC, яка могла бути інгібована блокуванням сигналів AMPK/AKT. (D) Активація сигнального шляху AMPK/AKT/PFKFB3 у TEC після обробки Сполукою C і LY294002. (E і F) ECAR і OCR в TEC за наявності або відсутності IL-22 або si-PFKFB3 протягом 24 год. (G) Споживання глюкози в TEC після обробки IL-22 або si-PFKFB3 протягом 24 год. (H) Мітохондріальну дисфункцію оцінювали в ТЕС, пофарбованих MitoTracker Red і MitoTracker Green. Т-критерій Стьюдента (непарний); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.5 IL-22 полегшує ураження нирок при ГПН, спричиненому цисплатином, шляхом пригнічення накопичення АФК у нирках і мітохондріальної дисфункції

Щоб перевірити нашу гіпотезу про те, що IL-22 регулює ниркові метаболічні профілі для пригнічення пошкодження ниркових канальців in vivo, ми спочатку оцінили функції нирок у мишей, які отримували IL-22-, яким вводили цисплатин (рис. 5A). Через чотири дні після ін’єкції цисплатину IL-22 не тільки суттєво зменшив ушкодження клітин канальців і крововилив; їхня ниркова дисфункція також була значно послаблена, що оцінювали за рівнями азоту сечовини крові (BUN) і креатиніну (Cr) у сироватці крові (рис. 5B–D). Крім того, ми запропонували запобігти IL-22ниркатравмашляхом посилення регенерації нирок та активації сигналізації AMPK/AKT і PFKFB3 (рис. 5E і F; рис. S11). Далі ми використали MitoSOX (мітохондріально-специфічний барвник АФК) і JC-1 (барвник, що залежить від потенціалу мітохондріальної мембрани), щоб оцінити мітохондріальну дисфункцію, яка бере участь у клітинному метаболізмі та апоптозі. У зрізах нирок мишей, які отримували цисплатин, спостерігалося порівняне накопичення АФК. Слід зазначити, що через чотири дні після лікування IL-22 рівні АФК були помітно знижені в пошкоджених нирках порівняно з АФК у мишей після лікування PBS (рис. 5G). У сукупності ці спостереження свідчать про те, що IL-22 відіграє захисну роль у спричиненому цисплатином ГПН шляхом контролю мітохондріальної придатності.

МАЛЮНОК 5 IL-22 полегшує пошкодження нирок при ГПН, спричиненому цисплатином, шляхом пригнічення накопичення АФК у нирках і дисфункції мітохондрій. (A) Схематична діаграма експериментальних протоколів для оцінки захисних ефектів IL-22 у пошкодженні нирок, викликаному цисплатином (20 мг/кг). PBS як контрольна група для носія та N-ацетил-1-цистеїн (NAC, 150 мг/кг) як позитивна контрольна група. (B і C) Були оцінені рівні сироваткового BUN, рівні сироваткового Cr, вага нирок і маса тіла. Були представлені репрезентативні зображення зрізів нирок HE (D), фарбування Ki-67 (E), MitoSOX (G) і JC{{10}} (G). (F) Порівняння активації STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 в екстрактах нирок мишей, які отримували IL-22-, оцінювали за допомогою вестерн-блоттингу. Т-критерій Стьюдента (непарний); n=3; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.6 IL-22 зменшує спричинене діабетом пошкодження нирок шляхом інгібування мітохондріальної дисфункції шляхом активації сигналізації AMPK/AKT і PFKFB3

Ми та інші продемонстрували, що IL-22 може проявляти захисну дію при діабетичній нефропатії (ДН), яка була основною причиною ESTD.31–33 Для подальшого вивчення механізмів, що лежать в основі, ми годували db/db мишей високою дієти з жирами (HFD), а потім лікували їх IL-22 (2,5 мг/кг, IP) протягом 8 тижнів (Малюнок 6A). Коли мишей годували лише HFD, ми виявили фіброз ниркових канальців і дилатацію на додаток до атрофії. Навпаки, коли мишей лікували IL-22, фіброз нирок і гістопатологія значно покращилися, а також функції нирок. Поліпшення функції нирок також було продемонстровано зниженням сироваткового Cr, рівня BUN і загального рівня альбуміну в сечі/24 години (ОАЕ) (рис. 6B–E). Щоб дослідити, чи була ця діяльність пов’язана з мітохондріями, ми оцінили функцію мітохондрій, яка бере участь у клітинному метаболізмі та апоптозі. Результати показали, що підвищені рівні мітохондріальних АФК і накопичені дисфункціональні мітохондрії були значно пом’якшені лікуванням IL-22 (рис. 6F і G). Для подальшого вивчення того, чи захисні функції IL-22 у нирках були опосередковані через PFKFB3, ми ввели мишам аденовірус shRNA PFKFB3, щоб знищити PFKFB3. Наші дані показали, що сприятливий вплив IL-22 на пошкодження нирок, спричинене HFD, некроз, стеатоз, мітохондріальну дисфункцію та накопичення АФК, а також активацію пов’язаних сигнальних шляхів були значно заблоковані нокдауном PFKFB3 (рис. 6B–G) . Підвищена експресія сигналізації AMPK/AKT також спостерігалася після лікування IL-22 (рис. 6H). Разом із полегшенням дисфункції нирок експресія PFKFB3 і важливих ферментів у клітинному метаболізмі також була покращена в нирках мишей, які отримували IL-22- (рис. 6H і I). Крім того, гістологічний аналіз основних органів вказав на відсутність морфологічних пошкоджень після ін’єкції IL-22, що свідчить про те, що IL-22 може бути безпечним антидотом без значних побічних ефектів або токсичних реакцій дляниркатравмарозлади (Малюнок 12S). Загалом наші дані свідчать про те, що IL- 22 полегшує пошкодження нирок шляхом активації трансдукції сигналу AMPK/AKT, пригнічення накопичення ROS і регуляції функції мітохондрій через PFKFB3.

МАЛЮНОК 6 IL-22 полегшує пошкодження нирок, викликане діабетом, через передачу сигналів AMPK/AKT та інгібування дисфункціональних мітохондрій через активацію PFKFB3. (A) Схематична діаграма експериментальних протоколів для оцінки захисних ефектів IL-22 при пошкодженні нирок, спричиненому діабетом. Db/m як контрольна група автомобіля. (B–D) Були оцінені рівні BUN у сироватці крові, рівні Cr у сироватці крові та UAE. Були представлені репрезентативні зображення зрізів нирок HE (E), MitoSOX (F) і JC-1 (G). (H та I) Порівняння активації STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 в екстрактах нирок мишей, які отримували IL-22-, оцінювали за допомогою вестерн-блоттингу. Т-критерій Стьюдента (непарний); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

4 ОБГОВОРЕННЯ

IL-22 секретується імунними клітинами, такими як NK-клітини, нейтрофіли, вроджені лімфоїдні клітини (ILC) і Т-клітини, але не впливає безпосередньо на ці клітини. Він переважно регулює функції епітеліальних клітин завдяки обмеженій експресії IL-22R1 на епітеліальних клітинах, включаючи TEC.15,34 Раніше дослідження показали, що IL-22 може захищати від пошкодження епітелію нирок і прискорювати регенерацію канальців. через інгібування інфламмасоми NLRP3 та активацію передачі сигналів STAT3 та AKT.16,31 Однак основні механізми цього захисту ще не з’ясовані. Для подальшого визначення молекулярної основи функції IL- 22 униркатравма, спочатку ми досліджуємо, чи може IL-22 полегшити дисфункцію клітин нирок і подальший апоптоз шляхом регулювання їх метаболічних станів. Крім того, ми вивчаємо дві моделіниркатравмазахворювань (ГПН та ДН) із застосуванням IL-22 і порівняйте спостереження із спостереженнями контрольних груп. Ми вказуємо, що IL-22 коригує метаболічне перепрограмування для підтримки цілісності мітохондрій, зменшує накопичення мітохондріальних АФК у пошкоджених ТЕС і полегшує прогресуюче пошкодження нирок і некроз. Більше того, наші результати свідчать про те, що IL- 22 може активувати пов’язані з AMPK/AKT сигнальні шляхи в TEC і нирках, важливі медіатори загоєння епітеліальних ран і виживання клітин, щоб полегшити мітохондріальну дисфункцію та погіршення метаболічних профілів і відкрити новий шлях поле для IL-22 опосередкованого захисного механізму нирок. Загалом наші результати вказують на те, що ниркові захисні ефекти IL-22 опосередковуються процесами метаболічного перепрограмування.

Критична роль OXPHOS і гліколізу в захисті нирок була виявлена ​​в попередніх дослідженнях, де збалансоване використання палива шляхом інгібіторного S-нітрозилування піруваткінази M2 (PKM2) захищає відниркатравма.19 Наші результати, які свідчать про стимулювання OXPHOS і гліколізу за допомогою IL-22 через збільшення експресії метаболічних регуляторів і поглинання глюкози, демонструють, що IL-22 змінює погіршення метаболічних станів, пов’язаних зниркатравма. Ці спостереження узгоджуються з нирковими захисними функціями рекомбінантного іризину, а також з результатами гепатоцитів, де OXPHOS і гліколіз необхідні для клітинних функцій, але якщо вони пригнічуються, то клітини первинних канальців і гепатоцити стають дисфункціональними.35, 36

Мітохондріальна дисфункція стала ключовою молекулярною основою, яка об’єднує метаболічні профілі та загибель клітин. Тут ми показуємо, що після стимуляції факторів ушкодження лікування TECs IL-22 покращило накопичення мітохондріальних АФК і дисфункціональних мітохондрій порівняно зі зниженням цілісності та функції мітохондрій у контрольних групах. Важливо, що сигнальні шляхи AMPK, критичні енергетичні датчики, модулюють метаболічні процеси для підтримки клітинного гомеостазу та запобігання пошкодженню клітин або тканин.37–39 У поточному дослідженні наші спостереження показують, що IL-22 зберігає цілісність і функцію мітохондрій шляхом активації Передача сигналів AMPK/AKT, щоб продемонструвати, що IL-22 запобігає мітохондріальній дисфункції прямим методом, що життєво важливо для підтримки дихальної здатності TEC. Крім того, ми демонструємо, що передача сигналу IL-22 через STAT3 безпосередньо впливає на збереження мітохондріальної придатності, оскільки раніше було досліджено, що індуковане фосфорилювання STAT3 є критичним для збереження цілісності мітохондрій.40,41

У багатьох видах літератури раніше вказувалося, що PFKFB3 відіграє роль центрального модулятора клітинного метаболізму.29–30,42 Тут ми спочатку демонструємо, що IL-22 сприяє активації PFKFB3 через передачу сигналів AMPK/AKT у TEC, що свідчить про IL{ {6}} регулює метаболічні стани шляхом залучення контролю PFKFB3. Крім того, попередні дослідження вказують на те, що PFKFB3 важливий для контролю надлишкового OXPHOS і гліколізу в багатьох клітинах або тканинах.42,43 Згідно з цими дослідженнями, наші спостереження також вказують на сприяння OXPHOS і гліколізу в IL-22- оброблені TEC через активацію PFKFB3. Серед багатьох досліджених нижніх модуляторів IL-22 наші дані показують, що PFKFB3 значно посилюється після обробки IL-22 під час пошкодження TEC і що вісь STAT3–AMPK/AKT PFKFB3 є життєво важливою для збереження цілісності мітохондрій під часниркатравма(Малюнок 7). Їх ще потрібно дослідити, чи IL-22 також регулює інші метаболічні регулятори та процеси, пов’язані з ушкодженням нирок, шляхом активації сигнального шляху STAT3–AMPK/AKT-PFKFB3.

МАЛЮНОК 7. Наші результати демонструють важливу роль IL-22 у контролі метаболізму клітин нирок для лікування пошкодження нирок шляхом активації осі STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3. Ці результати свідчать про те, що терапевтичні можливості IL-22 і націлювання на пов’язану метаболічну передачу сигналів можуть бути безпосередньо сприятливими для лікування чи профілактики численних ушкоджень нирок

5 ВИСНОВКИ

На закінчення ми продемонстрували терапевтичний потенціал і основні механізми IL-22 при пошкодженні нирок. ІЛ-22 регулював метаболізм ниркових клітин шляхом метаболічного перепрограмування для збереження цілісності мітохондрій. Інгібування їх регуляторів (тобто AMPK, Akt і PFKFB3) могло призвести до аномальних метаболічних профілів і втрати мітохондріальної пристосованості, як зазначено в TEC зі спонтанним -22 лікуванням, яке призвело до збільшення дисфункціональних мітохондрій і мітохондріального накопичення АФК. Найважливіше те, що пошкодження нирок через мітохондріальну дисфункцію та накопичення АФК у моделях мишей було суттєво полегшено лікуванням IL-22 через активацію передачі сигналу STAT3-AMPK-AKT-PFKFB3. Таким чином, наше дослідження показало, що націлювання на пов’язану метаболічну передачу сигналів може бути безпосередньо сприятливим для численних захворювань, пов’язаних з ушкодженнями нирок, і IL-22 є потенційним терапевтичним засобом для запобігання та лікування цих захворювань.

Продукти Cistanche можуть лікуватиураження нирок

Від: 'ІЛ-22-опосередковане метаболічне перепрограмування нирок через PFKFB3 для лікуванняниркатравма' відВей Чен та ін

---Clin. переклад Мед. 2021;11:e324.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Mehta RL, Burdmann EA, Cerdá J, et al. Розпізнавання та лікування гострихниркатравмау Міжнародному товаристві нефрології 025 Global Snapshot: багатонаціональне перехресне дослідження. Ланцет. 2016;387:2017-2025.

2. Lameire NH, Bagga A, Cruz D та ін. Гострийниркатравма: глобальне занепокоєння зростає. Ланцет. 2013;382:170-179.

3. Mehta RL, Cerdá J, Burdmann EA та ін. Ініціатива Міжнародного нефрологічного товариства 0by25 для гострихниркатравма(нуль запобіжних смертей до 2025 року): справа про права людини для нефрології. Lancet. 2015;385:2616-2643.

4. Леві А.С., Джеймс М.Т. Гострийниркатравма. Ann Intern Med.2017;167:ITC66-ITC80.

5. Янсен MPB, Florquin S, Roelofs JJTH. Роль тромбоцитів в гостромуниркатравма. Nat Rev Nephrol. 2018;14:457-471.

6. Агарвал А, Донг З, Харріс Р та ін. Клітинні та молекулярні механізми ГПН. J Am Soc Nephrol. 2016;27:1288-1299.

7. Linkermann A, Chen GC, Dong G, Kunzendorf U, KrautwaldS, Dong Z. Регульована клітинна смерть при AKI. J Am Soc Nephrol.2014;25:2689-2701.

8. Ференбах Д.А., Бонвентр Ж.В. Механізми дезадаптивного відновлення після ГПН, що призводить до прискореного старіння нирок і ХХН. Nat Rev Nephrol. 2015;11:264-276.

9. Чавла Л.С., Еггерс П.В., Стар Р.А., Кіммел П.Л. Гострийниркатравмата хронічна хвороба нирок як взаємопов’язані синдроми. N Engl J Med. 2014; 371: 58-66.

10. He L, Wei QQ, Liu J та ін. ГПН при ХХН: посилення травми, пригнічення відновлення та механізми, що лежать в основі. Kidney Int.2017;92:1071-1083.

11. Forbester JL, Lees EA, Goulding D та ін. Інтерлейкін -22 сприяє фаголізосомальному злиттю, щоб індукувати захист від Salmonella enterica Typhimurium в епітеліальних клітинах людини. Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115:10118-10123.

12. Geng H, Bu HF, Liu F та ін. У запалених кишкових тканинах і епітеліальних клітинах передача сигналів інтерлейкіну 22 збільшує експресію довгої некодуючої РНК H19, яка сприяє регенерації слизової оболонки. Гастроентерологія. 2018;155:144-155.

13. Аден К., Тран Ф., Іто Г. та ін. ATG16L1 керує передачею сигналів інтерлейкіну-22 в кишковому епітелії через cGAS-STING. J ExpMed. 2018; 215: 2868-2886.

14 Huber SN, Gagliani LA, Zenewicz FJ та ін. IL-22BP регулюється інфламмасомою та модулює пухлиногенез у кишечнику. природа 2012; 491: 259-263.

15. Lindemans CA, Calafiore M, Mertelsmann AM та ін. Інтерлейкін -22 сприяє регенерації епітелію, опосередкованій кишковими стовбуровими клітинами. природа 2015; 528: 560-564.

16. Xu MJ, Feng D, Wang H, Guan Y, Yan X, Gao B. IL-22 полегшує ішемічно-реперфузійне пошкодження нирок, націлюючись на епітелій проксимального канальця. J Am Soc Nephrol. 2014;25:967-977.

17. Kulkarni OP, Hartter I, Mulay SR та ін. 4-індукований IL-22 Toll-подібний рецептор прискорює регенерацію нирок. J Am Soc Nephrol. 2014;25:978-989.

18. Kang HM, Ahn SH, Choi P та ін. Дефектне окислення жирних кислот в епітеліальних клітинах ниркових канальців відіграє ключову роль у розвитку фіброзу нирок. Nat Med. 2015;21:37-46.

19. Zhou HL, Zhang R, Anand P та ін. Перепрограмування метаболізму системою S-нітрозо-КоА-редуктази захищає відниркатравма. природа 2019;565:96-100.

20. Dumesic PA, Egan DF, Gut P та ін. Еволюційно збережений uORF регулює PGC1 і окислювальний метаболізм у мишей, мух і блакитного тунця. клітинний метаб. 2019;30:190-200.

21. Shyh-Chang N, Zhu H, Yvanka de Soysa T та ін. Lin28 покращує відновлення тканин шляхом перепрограмування клітинного метаболізму. Стільниковий. 2013;155:778-792.

22. Chen W, Luan J, Wei G та ін. Гепатоцелюлярна експресія інтерлейкіну-22 in vivo з використанням гібридних наночастинок на основі проникнення як потенційних терапевтичних засобів проти гепатиту. Біоматеріали. 2018;187:66- 80.

23. Chen W, Zhang X, Fan J та ін. Прив’язування інтерлейкіну-22 до аполіпопротеїну AI полегшує у мишей ураження печінки, спричинене ацетамінофеном. Тераностика. 2017; 7: 4135-4148.

24. Zai W, Chen W, Wu Z та ін. Цільова доставка гена інтерлейкіну-22 в печінку за допомогою поліметформіну та гібридних наночастинок на основі проникнення для лікування неалкогольної жирової хвороби печінки. ACS Appl Mater Interfaces. 2019;11:4842-4857.

25. Хачо М., Гарріс Р., Слек Р.С. Мітохондрії як центральні регулятори долі нервових стовбурових клітин і когнітивної функції. Nat Rev Neurosci. 2019;20:34-48.

26. Ip WKE, Hoshi N, Shouval DS, Snapper S, Medzhitov R. Протизапальний ефект IL-10, опосередкований метаболічним перепрограмуванням макрофагів. Наука. 2017; 356: 513-519.

27. Saito Y, Chapple RH, Lin A, Kitano A, Nakada D. AMPK захищає клітини, що ініціюють лейкемію, при мієлоїдних лейкозах від метаболічного стресу в кістковому мозку. Стовбурові клітини. 2015;17:585- 596.

28. Михайлова М.М., Шоу Р.Я. Сигнальний шлях AMPK координує ріст клітин, аутофагію та метаболізм. Nat Cell Biol. 2011;13:1016-1023.

29. Li FL, Liu JP, Bao RX та ін. Ацетилювання накопичує PFKFB3 у цитоплазмі для сприяння гліколізу та захисту клітин від індукованого цисплатином апоптозу. Нац комун. 2018; 9: 508.

30. De Bock K, Georgiadou M, Schoors S та ін. Роль гліколізу, керованого PFKFB3-, у проростанні судин. Стільниковий. 2013;154:651-663.

31. Дудаков Я.А., Ханаш А.М., ван ден Брінк М.Р. Інтерлейкін-22: імунобіологія та патологія. Annu Rev Immunol. 2015;33:747- 785.

32. Wang S, Li Y, Fan J та ін. Інтерлейкін-22 полегшував ушкодження нирок і фіброз при діабетичній нефропатії шляхом інгібування активації запалення NLRP3. Смерть клітин Dis. 2017; 8: e2937.

33. Shen YL, Chen W, Han L та ін. Антитіло VEGF-B і злитий білок інтерлейкіну-22 полегшують діабетичну нефропатію шляхом інгібування накопичення ліпідів і запальних реакцій. Acta Pharm Sin B. 2020. https://doi.org/10.1016/j. апсб.2020.07.002.

34. Ouyang W, O'Garra A. IL-10 сімейства цитокінів IL-10 та IL-22: від фундаментальної науки до клінічного перекладу. Імунітет. 2019;50:871- 891.

35. Xiang X, Feng D, Hwang S та ін. Інтерлейкін-22 полегшує гостру або хронічну печінкову недостатність шляхом перепрограмування порушених шляхів регенерації у мишей. J Гепатол. 2020;72:736-745.

36. Chen W, Zai W, Fan J та ін. Інтерлейкін -22 керує адаптивним перепрограмуванням метаболізму для підтримки мітохондріальної придатності та лікування пошкоджень печінки. Тераностика. 2020;10:5879-5894.

37. Peng H, Wang Q, Lou T та ін. Перехресні перешкоди між м’язами та нирками, опосередковані міокінами, пригнічують метаболічне перепрограмування та фіброз у пошкоджених нирках. Нац комун. 2017; 8: 1493.

38. Saberi B, Ybanez MD, Johnson HS, Gaarde WA, Han D, Kaplowitz N. Протеїнкіназа c (PKC) бере участь у гепатотоксичності ацетамінофену через c-jun-n-кінцеву кіназу (jnk)-залежні та незалежні сигнальні шляхи. Гепатологія. 2014;59:1543-1554.

39. Mo R, Lai R, Lu J та ін. Посилена аутофагія сприяє захисним ефектам IL-22 проти пошкодження печінки, спричиненого ацетамінофеном. Тераностика. 2018; 8: 4170-4180.

40. Wegrzyn J, Potla R, Chwae YJ та ін. Функція мітохондріального Stat3 у клітинному диханні. Наука. 2009;323:793-797.

41. Chen W, Hu Y, Ju D. Генна терапія нейродегенеративних розладів: досягнення, ідеї та перспективи. Acta Pharm Sin B. 2020; 10: 1347-1359.

42. Cao Y, Zhang X, Wang L та ін. PFKFB3-опосередкований ендотеліальний гліколіз сприяє розвитку легеневої гіпертензії. Proc Natl Acad Sci США. 2019;116:13394-13403.

43. Doménech E, Maestre C, Esteban-Martínez L та ін. AMPK і PFKFB3 опосередковують гліколіз і виживання у відповідь на мітофагію під час мітотичної зупинки. Nat Cell Biol. 2015;17:1304- 1316.