Контактна особа:jerry.he@wecistanche.com

Лінь Бай|Гуйін Ши|Я-цзюнь Ян|Вей Чен|Лянь-фен Чжан|Чуань Цінь

Цистанхея має антивіковий ефект

Анотація

Фон: Пов’язане з часом зниження регенераційної здатності та гомеостазу органів є основною ознакоюстаріння. Rehmannia glutinosa і Astragalus membranaceus використовувалися як традиційні китайські рослинні ліки для зміцнення імунітету та продовження життя. Однак механізм, за допомогою якого цей фітопрепарат уповільнює старіння, невідомий. У цьому дослідженні ми досліджували механізм дії травантивіковий ефект.

Методи: Мишей годували дієтами з додаванням R. glutinosa або A. membranaceus протягом 10 місяців; контрольну групу годували стандартною дієтою. Фенотипи оцінювали за допомогою системи оцінки балів і аналізу виживання. Відсоток фенотипів старіння гемопоетичних стовбурових клітин (HSC) визначали за допомогою аналізу сортування клітин, активованих флуоресценцією. Функцію та механізм HSCs аналізували за допомогою клоногенного аналізу та полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі.

Результати: Theантивіковий ефектR. glutinosa пов'язано з посиленою функцією HSC. Миші, яких годували R. glutinosa, показали характеристики уповільненогостарінняпроцесу, включаючи зниження старіння та підвищення рівня виживання. Аналіз проточної цитометрії показав зниження кількості клітин Lin–Sca1 плюс c-kit– (LSK), довготривалих HSC (LT-HSC) і короткострокових HSC (ST-HSC) у групі R. glutinosa. In vitro клоногенні аналізи показали підвищену здатність до самовідновлення LT-HSC з групи R. glutinosa, а також підтримку LSK у стані спокою за рахунок посиленої експресії p18. Група R. glutinosa також продемонструвала зниження рівнів активних форм кисню та відсотка ‐gal+клітин через зниження рівня клітинного старіння, асоційованого з білками p53 та p16.

Висновок: Rehmannia glutinosa дієпроти старіннявпливають шляхом підтримки спокою та зменшення старіння HSC.

КЛЮЧОВІ СЛОВА: антистаріння, гемопоетичні стовбурові клітини, спокій, Rehmannia glutinosa

1|ВСТУП

Старіння визначається як залежне від часу функціональне погіршення, яке впливає на більшість живих організмів.1 Довголіття організмів в основному підтримується стовбуровими клітинами.2 Тканеспецифічні стовбурові клітини мають здатність до самовідновлення та диференціювання в різноманітні ефекторні клітини. 3 Однак у процесі старіння ця здатність до самовідновлення знижується, що зрештою призводить до накопичення невідновлених пошкоджених тканин у літніх організмах.4 Втрата здатності підтримувати баланс між станом спокою та диференціюванням у стовбурових/клітинах-попередниках Крім того, останні дослідження показують, що омолодження стовбурових клітин може змінити фенотип старіння.5,6 У кровотворній системі гемопоетичні стовбурові клітини (ГСК) відповідають за виробництво клітин крові. У літніх мишей кровотворна система демонструє порушення Т- і В-лімфоїдних клітин, а кількість мієлоїдних клітин збільшується. Старі ГСК показали знижену активність самовідновлення та знижену здатність до реконструкції кровотворення. Примітно, що вікові зміни в компартменті HSC проявляються у старіючого хазяїна як анемія, підвищена схильність до мієлопроліферативних новоутворень, зниження імунної функції та збільшення захворюваності на рак.7-9 Однак механізм старіння HSC і вплив фітопрепаратів на старіння HSC невідомий.10

Люди з давніх-давен піклувалися про уповільнення процесу старіння та збереження молодостіпроти старінняє предметом поточних досліджень. Традиційна китайська медицина приділяє все більше уваги лікуванню різних захворювань, пов’язаних зі старінням. Відомо, що багато трав, які використовуються в традиційній китайській медицині, надають позитивний ефект проти старіння за допомогою різних механізмів. Rehmannia glutinosa і Astragalus membranaceus широко використовувалися таким способом протягом тисячоліть.

Rehmannia glutinosa використовується для лікування різних діабетичних розладів, посилення метаболізму кісток при остеопорозі та пригнічення запалення та фіброзу печінки. Крім того, ця трава має й інші ефекти, в тому числіпроти втоми, антидепресивні та нейропротекторні властивості. В останні кілька років фармакологічні дослідження R. glutinosa та його активних компонентів були зосереджені головним чином на його широкій дії на кров, ендокринну, серцево-судинну та нервову системи.11-14 Таким чином, R. glutinosa має сильний імунітет. ‐посилення активності, яка забезпечила теоретичну базу для подальших досліджень.

Astragalus membranaceus має тонізуючі, гепатопротекторні, сечогінні та відхаркувальні властивості15 і, як було показано, має імуномодулюючу,16протизапальні ліки,іантиоксидантефектів.17 З’ясування молекулярних механізмів, що лежать в основі ефектів традиційної китайської медицини в клінічній практиці, є ключовим кроком до їх застосування в усьому світі, і ця тема зараз є предметом інтенсивного дослідницького інтересу.

Таким чином, у цьому дослідженні ми годували мишей дієтами з R. glutinosa та A. membranaceus протягом 10 місяців, щоб дослідити механізм, що лежить в основі здатності R. glutinosa збільшувати тривалість життя.

2|МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

2.1|Групування тварин і лікування

Самок мишей C57BL/6J утримували в середовищі, вільному від патогенів, і годували стандартною дієтою. Використання тварин у цьому дослідженні було схвалено комітетами з догляду та використання тварин Інституту лабораторних тварин Пекінського медичного коледжу. Мишей (віком 10 місяців) випадковим чином розділили на три групи (n=20/групу). Контрольну групу годували стандартною дієтою (Beijing HFK Biosicence, Пекін, Китай). Дієти двох інших груп були доповнені меленими R. glutinosa та A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Пекін, Китай) відповідно в дозі 200 мг/добу протягом 10 місяців. Ця доза була обрана за допомогою методу нормалізації площі поверхні тіла, щоб підтвердити дози препарату в дослідженнях на людях і на мишах. Масу тіла визначали кожні 2 місяці, а виживання реєстрували щодня.

2.2|Оцінка ступеня старіння

Для оцінки ступеня старіння було прийнято систему класифікації балів відповідно до критеріїв, визначених Takeda та ін.18. Кожна категорія, перерахована в протоколі, була обрана з клінічних ознак, пов’язаних із процесом старіння. Кожну мишу оцінювали у віці 18 місяців, і оцінку в кожній категорії підсумовували для визначення загальної оцінки.

2.3|Проточна цитометрія

Клітини збирали з тимуса, селезінки, периферичної крові (PB) і кісткового мозку (BM). Селезінку та тимус негайно вирізали, промивали фізіологічним розчином і зважували. Селезінки та тимуси обережно гомогенізували в скляному гомогенізаторі, а клітини суспендували в стерильному фосфатно-сольовому буфері (PBS). Клітини з PB застосовували для лізису еритроцитів крові (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Клітини з BM виділяли шляхом промивання обох гомілок і стегнових кісток стерильним PBS. Усі клітини виділяли фільтрацією через стерильну нейлонову сітку та фарбували протягом 30 хвилин при 4 градусах наступними антитілами, кон’югованими з флуорофором: анти-CD3, кон’югованими з фікоеритрином (PE) (G4.18), антитілами, кон’югованими з алофікоціаніном (APC). ‐ CD4 (OX35) і PE-Cy7-кон’югований анти-CD8a (OX8). Для клітин BM маркери лінії були пофарбовані з використанням кон’югованих з біотином антимишачих CD4 (RM4-5), CD5 (53-7,3), CD8a (53-6,7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER‐ 119) і Gr1 (RB6‐8C5) з подальшим фарбуванням антитілом APC‐eFluor 780-кон’югованим стрептавідином також було отримано від eBioscience (Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Для фарбування поверхні використовували такі антитіла: імуноглобулін APC (Ig)M (II/41), флуоресцеїн ізотіоціанат (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca-1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) і PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). Усі антитіла були отримані від eBiosciences (Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Дані були отримані FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) та проаналізовано за допомогою програмного забезпечення FlowJo (Three Star, Ashland, OR, USA).

2.4|Аналіз клітинного циклу

Для аналізу клітинного циклу загальні клітини BM пофарбували на поверхневі маркери стовбурових клітин (Lin–Sca‐1 плюс c‐KitHigh; LSTKs), потім фіксували та пермеабілізували (00‐5123‐43; Becton Dickinson ) перед фарбуванням FITC Ki‐

67 антитіло та 7-аміноактиноміцин D (7-AAD). Збір даних проводили на FACS Aria II (Becton Dickinson). Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo.

2,5|Пов'язане зі старінням фарбування gal

Активність, пов’язану зі старінням (SA)-gal, також аналізували за допомогою проточної цитометрії з використанням C12FDG, як описано виробником (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Коротко кажучи, стовбурові клітини спочатку фарбували на маркери клітинної поверхні, а потім інкубували з 100 нмоль L-1 бафіломіцину А1 протягом 1 години при 37 градусах, щоб індукувати підлужнення лізосом. Після промивання PBS клітини інкубували з 2 ммоль L-1 C12FDG протягом 1-2 годин при 37 градусах, а потім аналізували за допомогою FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Визначення утворення активних форм кисню (АФК).

Клітини інкубували з дихлор-дигідро-флуоресцеїн діацетатом (DCFH-DA; Beyotime, Шанхай, Китай) при 37 градусах протягом 20 хвилин. DCFH-DA пасивно дифундує в клітини, де деацетилюється естеразами з утворенням нефлуоресцентного 2',7'-дихлорофлуоресцеїну (DCFH). Рівень випромінюваної флуоресценції корелює з кількістю АФК у клітині. Дані були отримані на FACS Aria I (Becton Dickinson) та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення FlowJo.

2.7|Аналіз полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у реальному часі

Загальну РНК екстрагували з клітин за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) відповідно до інструкцій виробника. Цікаві гени були ампліфіковані з сумарних РНК, оброблених ДНКазою I, за допомогою зворотної транскриптази M-MLV (Promega, Медісон, Вісконсин, США)

і праймери poly-dT. Для ПЛР використовували такі праймери: p21 (5′-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3′ і 5′-CGAAGAGACAACGG-CACACT-3′, Tm=60 ступінь, 30 циклів), p53 (5′-CATGAACCGCCGACC-TATC- 3′ і 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 ступінь , 35 циклів), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3’ і 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3’, Tm=62 ступінь , 35 цикли), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3’ і 5’‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3’, Tm=61 ступінь , 30 циклів), p19 (5’‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3’ і 5’‐GTAGTGGGGTCCTCGCAGTT‐3 ′, Tm=61 градус , 35 циклів), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ і 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 ступінь , 30 циклів), гліцеральдегід 3-фосфат дегідрогеназа (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ і 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 ступінь, 25 циклів). ПЛР у реальному часі (RT) проводили за допомогою SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japan) на системі виявлення ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, США).

2.8|Клоногенні аналізи

Довгострокові (LT)- HSC були відсортовані за допомогою флуоресцентно-активованого сортування клітин (FACS), а потім культивовані в 96-лункових клітинних планшетах з використанням середовища на основі метилцелюлози (HSC007; R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) . Для кожного зразка готували десять повторних лунок. Ми використовували 96-лунковий планшет для культури клітин, три клітини на лунку. Через два тижні після посіву кількість і розміри колоній підраховували під мікроскопом.

2.9|Статистичний аналіз

Дані були проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з використанням програмного забезпечення Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, США) і GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Дані були представлені як середнє ± SD. P < 0.05="" вважалося="" статистично="">

3|РЕЗУЛЬТАТИ

3.1|R. glutinosa і A. membranaceus виявляють ефект проти старіння

Для підтвердженняантивіковий ефектR. glutinosa та A. membranaceus ми досліджували вплив введення як харчової добавки (200 мг/добу). Згодом ми реєстрували масу тіла, ступінь старіння та виживаність мишей. Маса тіла мишей, яких годували R. glutinosa або A. membranaceus, була нормальною порівняно з мишами в контрольній групі, хоча спостерігалося зменшення маси тіла в групі R. glutinosa та A. membranaceus через 20 місяців (рис. 1A). Аналіз ступеня старіння виявив постійне та необоротне підвищення балів оцінки з віком у групах R. glutinosa та A. membranaceus порівняно з контрольною групою, хоча збільшення було більш помітним у A. membranaceus група (Малюнок 1B). Високий бал оцінки був зумовлений більш раннім початком втрати пасивності та реактивності, втрати блиску шкіри та збільшення грубості, випадання волосся, періофтальмальних уражень, посилення лордокіфозу хребта та більш помітного посилення його тяжкості.18 Миші в A Група мишей membranaceus показала більш помітні характеристики фенотипу старіння, включаючи втрату блиску шкіри та випадання волосся. Криві виживання показали, що тривалість життя мишей у групах R. glutinosa та A. membranaceus була трохи довшою, ніж у контрольній групі (рис. 1C). Ці дані підтвердилиантивіковий ефектяк R. glutinosa, так і A. membranaceus, хоча R. glutinosa виявилася більш ефективною у сповільненні процесу старіння.

МАЛЮНОК 1 Rehmannia glutinosa та Astragalus membranaceus малиантивіковий ефект. Мишей годували дієтами, доповненими меленим R. glutinosa або A. membranaceus (200 мг/день); контрольну групу годували стандартною дієтою. A, Зміни маси тіла мишей вимірювали кожні 2 місяці. B, Зміни оцінки старіння мишей з віком. C, Криві виживання. Дані представляють середнє значення ± SD; n=20 мишей/групу. Дані представляють середнє значення ± SD; n=5 мишей/групу.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa зменшила кількість гемопоетичних стовбурових клітин

Вважається, що виснаження стовбурових клітин є інтегральним наслідком багатьох типів пошкоджень, пов’язаних зі старінням, і однією з основних причин старіння тканин і організму.1 Недавні дослідження показують, що омолодження стовбурових клітин може змінити фенотип старіння на рівні організму.5 Ми припустив, щоантивіковий ефектR. glutinosa опосередковується посиленням функції стовбурових клітин. Таким чином, ми провели проточний цитометричний аналіз кількості гемопоетичних стовбурових/клітин-попередників, виділених у мишей (віком 20 місяців), яких годували дієтами з R. glutinosa або A. membranaceus (200 мг/день) протягом 10 місяців (рис. 2A). . Відсоток LSK був знижений у групах R. glutinosa та A. membranaceus (рис. 2B). Кількість LT- і короткострокових (ST)- HSC була зменшена приблизно вдвічі в групі R. glutinosa порівняно з кількістю в контрольній групі (рис. 2C-D). Більшу кількість загальних лімфоїдних попередників (CLP) було виявлено в групі R. glutinosa порівняно з кількістю в контрольній групі (рис. 2I). Не було відмінностей у кількості мультипотентних попередників (MPP), загальних мієлоїдних попередників (CMP), гранулоцитарно-макрофагових попередників (GMP) і мегакаріоцитарно-еритроїдних попередників (MEP) у групі R. glutinosa порівняно з кількістю в групі R. glutinosa. контрольна група. У групі A. membranaceus не було значної різниці в кількості LT- і ST-HSC порівняно з кількістю в контрольній групі (рис. 2C-D). Крім того, не було різниці в кількості клітин MPP, CMP, MEP і CLP порівняно з кількістю в контрольній групі (рис. 2E, 2F, 2H і 2I); однак кількість GMP була знижена в групі A. membranaceus. Таким чином, у мишей, яких годували дієтами з R. glutinosa, спостерігалося зниження кількості гемопоетичних стовбурових клітин і клітин-попередників.

3.3|R. glutinosa посилював функцію та підтримував стан спокою HSC

Щоб оцінити функцію HSC, клоногенний потенціал LT-HSC досліджували in vitro. Ми відсортували клітини LT-HSCs у середовище на основі метилцелюлози за допомогою FACS і підрахували кількість і розмір колоній через 14 днів. Порівняно з кількістю та розміром колоній, утворених клітинами мишей у контрольній групі, клітини мишей у групі R. glutinosa показали збільшення кількості колоній, особливо для малого розміру (P=0.0241 ) і клон великого розміру (P=0.0418), тоді як не було різниці в кількості від мишей у групі A. membranaceus (рис. 3). Збільшення розміру та кількості колоній у групі R. glutinosa свідчить про те, що ця рослина посилює потенціал самовідновлення LT-HSC.

Більшість HSC у дорослих мишей залишаються в стані спокою;19 отже, підтримка клітинного спокою є важливим механізмом для самовідновлення стовбурових клітин.20,21 Спостережуване зниження HSC свідчить про зниження проліферації клітин у R. glutinosa та A. перетинчасті групи; тому ми перевірили стан клітинного циклу HSC за допомогою аналізу маркера проліферативних клітин Ki-67 у поєднанні з визначенням вмісту ДНК 7-AAD у популяції LSK. Ми спостерігали збільшення кількості клітин LSK у фазі G0 у групах R. glutinosa та A. membranaceus порівняно з контрольною групою (рис. 4A). Ці результати вказують на те, що R. glutinosa і A. membranaceus підтримували стан спокою HSC.

ПЛР-аналіз регуляторів клітинного циклу в клітинах LSK у режимі реального часу показав, що p18, p19 і p57 відіграють вирішальну роль у підтримці спокою HSC.22-24 Для p57 і p19 не спостерігалося очевидних змін (рис. 4C- D), і р18 був підвищений у групі R. glutinosa порівняно з такою в контрольній групі та дещо підвищений у групі A. membranaceus (рис. 4B).

МАЛЮНОК 2 Rehmannia glutinosa та Astragalus membranaceus вплинули на кількість гемопоетичних стовбурових клітин/клітин-попередників. Миші (у віці

20 місяців) годували дієтами з додаванням R. glutinosa або A. membranaceus (200 мг/день) протягом 10 місяців (n=5/група); контрольну групу годували стандартною дієтою. Свіжовиділені клітини кісткового мозку (КМ) фарбували зазначеними антитілами та аналізували за допомогою проточної цитометрії. A, Репрезентативні профілі фарбування BM гемопоетичних стовбурових клітин і популяцій клітин-попередників. B, Відсоток клітин Lin–Sca1 плюс c-kit– клітин (LSK) у клітинах BM. C‐ I, кількість клітин (C) довготривалого (LT; Lin–, Sca‐ 1 плюс , c‐ Kit , CD34 плюс – , Flt3–); D, короткочасний (ST; Lin–, Sca‐1 плюс, c‐Kit, CD34 плюс плюс, Flt3–); E, мультипотентний попередник (MPP; Lin–, Sca‐1 плюс, c‐Kit плюс, Flt3 плюс); F, загальний мієлоїдний попередник (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, гранулоцитарно-макрофагальний попередник (GMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, мегакаріоцит-еритроїдний попередник (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit– , CD34–, CD16/CD32–); і I, загальний лімфоїдний попередник (CLP; Lin– ​​, Sca‐1low, c‐ Kitlow, CD127 plus ). Дані представляють середнє значення ± SD; n=5 мишей/групу. *P <0,05, **p=""><>

3.4|R. glutinosa затримував старіння HSC

Довготривалі харчові добавки з R. glutinosa можуть подовжити тривалість життя мишей. Клітинне старіння посилюється з віком; тому ми досліджували старіння HSC у старіючих мишей за допомогою проточної цитометрії забарвлених SA-gal HSC з використанням флуоресцентного субстрату gal (C12FDG).25 Відсоток SA-gal-позитивних клітин був знижений у R. glutinosa групи, що вказує на те, що R. glutinosa затримує старіння клітин LSK (рис. 5A).

Активні форми кисню відіграють важливу роль у старінні HSC, і втрата стану спокою HSC часто корелює зі збільшенням клітинних ROS.26 Аналіз внутрішньоклітинних ROS у LSK показав, що рівні були знижені в групі R. glutinosa порівняно з контрольною групою. група (Малюнок 5B). Ці дані показали, що R. glutinosa може підтримувати стан спокою HSC і посилювати функцію HSC шляхом зниження рівня АФК.

Потім ми дослідили експресію кількох генів, залучених до клітинного старіння, за допомогою RT-ПЛР-аналізу клітин LSK. Порівняно

МАЛЮНОК 3 Функція гемопоетичних стовбурових клітин, посилена дієтичними добавками Rehmannia glutinosa. Клоногенний потенціал in vitro довготривалих зірчастих клітин печінки мишей (n=3)

у контрольній групі експресія клітинних білків p53 і p16, пов’язаних із старінням, була знижена в групі R. glutinosa (рис. 5D-E). Але експресія p53 і p16 не була істотно знижена між групою A. membranaceus і контрольною групою (рис. 5D-E). У сукупності ці дані показують, що кілька ключових генів клітинного циклу та клітинного старіння регулюють функцію HSC у мишей, яких годували дієтами, доповненими R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa посилює В-клітинний імунітет

І В, і Т-лімфоцити важливі для імунологічної відповіді. Т-лімфоцити відіграють важливу роль у клітинному імунітеті та його регуляції, тоді як В-лімфоцити беруть участь переважно в гуморальному імунітеті. Проліферація лімфоцитів є найбільш безпосереднім показником, що відображає органічний імунітет. Щоб дослідити роль у посиленні імунітету, було вивчено вплив R. glutinosa та A. membranaceus на проліферацію лімфоцитів.

Миші в групі R. glutinosa продемонстрували зниження кількості HSC і збільшення кількості CLP. Проточний цитометричний аналіз показав збільшення кількості зрілих B-клітин (B220 плюс) у PB, BM та селезінці мишей у групі R. glutinosa порівняно з кількістю, виявленою в контрольній групі (рис. 6A); однак не було суттєвих відмінностей у кількості Т-клітин (CD4 плюс і CD8 плюс), моноцитів і гранулоцитів (CD11b плюс) між двома групами (Рисунок 6B-D). Таким чином, ці результати вказують на те, що дієта R. glutinosa посилює імунітет В-клітин.

МАЛЮНОК 4 Дієтичні добавки Rehmannia glutinosa та Astragalus membranaceus підтримували стан спокою гемопоетичних стовбурових клітин. A, Відсоток клітин у кожній фазі клітинного циклу. Проточний цитометричний аналіз 7-аміноактиноміцину D (7-AAD) і фарбування Ki-67 клітин Lin–Sca1 плюс c-kit– (LSK). B. Аналіз полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу експресії генів відсортованих клітин LSK; Для нормалізації використовували GAPDH. Дані являють собою середнє значення ± SD трьох експериментів. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

МАЛЮНОК 5 Дієтичні добавки Rehmannia glutinosa зменшили старіння зірчастих клітин печінки (HSC). Мишей (віком 20 місяців) годували дієтами з добавками Rehmannia glutinosa або Astragalus membranaceus (200 мг/день) протягом 10 місяців (n {{4 }}/група); контрольну групу годували стандартною дієтою. A, Проточний цитометричний аналіз SA-gal-позитивних клітин Lin–Sca1 плюс c-kit– (LSK) з використанням флуоресцентного субстрату галактозидази (C12FDG). B, Відсоток позитивних активних форм кисню (АФК) клітин у LSK. Проточний цитометричний аналіз ROS-позитивних LSK. Дані представляють середнє значення ± стандартне відхилення (SD). *P < 0.05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" модель="" експресії="" клітинних="" генів,="" пов’язаних="" із="" старінням,="" у="" lsk;="" для="" нормалізації="" використовували="" gapdh.="" дані="" являють="" собою="" середнє="" значення="" ±="" sd="" трьох="" експериментів.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><>

4|ДИСКУСІЯ

У цьому дослідженні ми досліджували механізмантивіковий ефектR. glutinosa або A. membranaceus шляхом доповнення раціону мишей травами в дозі 200 мг/добу протягом 10 місяців. Було виявлено, що R. glutinosa демонструє ефекти проти старіння, включаючи зниження старіння та збільшення виживання HSC, а також

підвищений В-клітинний імунітет. З точки зору механізму вантивіковий ефект, ми виявили, що R. glutinosa зменшує кількість HSC, тоді як здатність до проліферації збільшується. Крім того, R. glutinosa підтримував стан спокою HSC і зменшував кількість SA--gal-позитивних клітин і рівнів АФК шляхом регуляції p18, p53 і p16. У поєднанні наші результати підтвердили, щоантивіковий ефектR. glutinosa у мишей лікують шляхом підтримання стану спокою та посилення функції HSC.

Rehmannia glutinosa, яка використовувалася як традиційна китайська трав’яна медицина протягом тисячоліть, може бути використана для лікування гіпоглікемії при різних діабетичних розладах.27,28 Також повідомлялося, що екстракт R. glutinosa покращує метаболізм кісток.29 Крім того, R. glutinosa пригнічує запальні реакції та синдроми, 30, 31 і захищає від пошкодження клітин шляхом поглинання вільних радикалів.антивіковий ефекті посилення імунітету В-клітин за рахунок підвищення проліферативної здатності LT-HSCs і зменшення кількості SA-gal-позитивних клітин і рівнів ROS.

Було встановлено, що ступінь окислювального пошкодження зростає з віком у різних клітинах і тканинах. Окислювальний стрес є критично важливим фактором самовідновлення HSC. Втрата спокою LT-HSC часто корелює зі збільшенням клітинних АФК, що негативно пов’язано з самовідновленням HSC.26 Каталпол є іридоїдним глюкозидом, який був знайдений у корені R. glutinosa. У попередньому дослідженні каталпол продемонстрував пригнічення окисного стресу, пошкодження ДНК і вкорочення теломер через шлях PGC‐1/TERT.33 У нашому дослідженні рівень АФК був знижений у клітинах LSK з групи R. glutinosa порівняно з контрольною групою. Таким чином, R. glutinosa подовжує виживання мишей, пригнічуючи окислювальний стрес у HSC.

МАЛЮНОК 6 Проточний цитометричний аналіз відсотка зрілих імунних клітин у периферичній крові (PB), кістковому мозку (BM), селезінці та тимусі. Мишей (віком 20 місяців) годували дієтами з додаванням Rehmannia glutinosa або Astragalus membranaceus (200 мг/день) протягом 10 місяців (n=5/група); контрольну групу годували стандартною дієтою. A, Проточний цитометричний аналіз відсотка В-клітин (B220 плюс) у PB, BM та селезінці. B, Проточний цитометричний аналіз відсотка клітин моноцитів і гранулоцитів (CD11b плюс ) у PB і BM. C і D, проточний цитометричний аналіз відсотка клітин CD4 plus і CD8 plus у PB, селезінці та тимусі. Дані представляють середнє значення ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus також використовується в традиційній китайській медицині для підвищення імунітету, зниження рівня цукру в крові та сприяння апоптозу пухлинних клітин, а також маєантиоксидантнаіпроти старіннявластивості. У цьому дослідженні ми виявили, що харчові добавки з A. memranaceus протягом 10 місяців не мали очевидних ефектів порівняно з тими, що спостерігалися у контрольних мишей, тоді як вага мишей зменшилася через 20 місяців. Таким чином, A. membranaceus може бути непридатним для лікування LT мишей, яких годують.

На закінчення, наші результати показують, що R. glutinosa може подовжувати тривалість життя мишей, підтримуючи стан спокою та посилюючи функцію HSC. Крім того, R. glutinosa може знижувати міжклітинні рівні АФК і кількість SA-gal-позитивних клітин і посилювати В-клітинний імунітет.

ПОДЯКА

Це дослідження було частково підтримано Національним науковим фондом Китаю (31672374), Інноваційним фондом медичних наук CAMS (CIFMS) (2016‐ 12M‐ 1‐012) та Молодіжним фондом PUMC (2017310018).

КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ

Жодного.

АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК

Усі зазначені автори відповідають вимогам до авторства. CQ і LFZ задумали та розробили експерименти. LB провів експерименти та написав основний тест рукопису. GYS виконала та проаналізувала дані FACS. YJY розробив експеримент про китайську традиційну медицину. WC керував мишами. Усі автори прочитали та схвалили рукопис.