Going Micro при лептоспірозній хворобі нирок Ⅱ

4. Реакція імунітету господаря на Leptospira spp.

Основним шляхом проникнення лептоспір є безпосереднє проникнення через кров, тканини, сечу або забруднену воду на слизові оболонки або відкриті ділянки шкіри, які поширюються по системному кровотоку і поширюються в ряд органів, наприкладпечінка, легені та проксимального канальцянефрон в нирках, де він може розмножуватися і виживати протягом місяця [51]. У початковій фазі зараженнявроджена імунна відповідьвідіграє фундаментальну роль як перша лінія захисту при лептоспірозі, впливаючи на реакціюрецептори розпізнавання образів, макрофагальний фагоцитоз, індукція позаклітинноїнакопичення нейтрофілів, івтручання системи комплементу [52].

Theімунна відповідьу людини відіграє істотну роль врозвиток клінічних ознак, як і фактори вірулентності деяких патогенних штамів. Більшість лептоспірозів у людей протікає безсимптомно або в легкій формі, і лише в 10% випадків розвиваються важкі форми з поліорганною недостатністю та підвищенням рівня смертності, пов’язаної зцитокіновий штормі статус імунопаралічу. Патогенні види стимулюють гуморальну відповідь у фазі бактеріємії, хоча подальша поведінкаімунна відповідьнезрозуміло. У дослідженнях пацієнтів із кількома клінічними проявами лептоспірозу тяжкість клінічної картини була пов’язана з різними рівнями сироваткових цитокінів, таких як TNF-, IL-10 та IL-6 [53], але цей висновок залишається дискусійним [54]. Ці умови призвели до підвищення інтересу до розуміння імунної відповіді в цілому та біологічних подій, які відбуваються під час інфекції.

СКІЛЬКИ ЧАСУ ДІЄ CISTANCHE?

4.1. Лептоспіри та система комплементу

Протеолітична активність лептоспіральних протеаз проти позаклітинного матриксу дозволяє інфекції проникати в кровоносне русло. Система комплементу в системі кровообігу є одним із основних механізмів вродженої імунної відповіді на патогенні лептоспіри. Однак Leptospira розробила стратегії, щоб уникнути атаки системи комплементу, зв’язуючи білки з молекулами комплементу та виробляючи протеази, такі як термолізин, термостабільний нейтральний металопротеїназний фермент, який впливає на білковий ланцюг С3. Патогенні штами зв’язують фактор H (FH), білок 1, пов’язаний з фактором комплементу H (FHR-1), фактор-H-подібний білок 1 (FHL-1) і білок, що зв’язує C4b (C4BP), усі з яких відповідають за інгібування системи комплементу [55]. Існують три основні стратегії ухилення від комплементу патогенних лептоспір [55,56] через втручання регуляторів комплементу хазяїна, протеази хазяїна та бактеріальної протеази. Для регуляторів комплементу Leptospira використовує фактор H (FH; регулятор альтернативного шляху комплементу) і білок, що зв’язує C4 (C4BP; регулятор класичного та лектинового шляхів комплементу), щоб прискорити розпад C3-конвертаз, а також діяти як кофактори для фактора I для розщеплення C3b і C4b [57,58]. Лептоспіральний білок (LcpA) разом із вітронектином (Vn; кінцевий регулятор шляху) зв’язує C9 та інгібує його полімеризацію [59], таким чином потенційно блокуючи утворення мембраноактивуючого комплексу (MAC) [60]. Крім того, патогенні лептоспіри зв’язують кілька протеаз хазяїна, таких як активатор плазміногену типу урокінази (uPA), які індукують активний плазмін [61] (серинову протеазу) для перетравлення C3b, C4b і C5 на поверхні лептоспір [62]. Крім того, металопротеази та термолізин, ендогенна протеаза Leptospira, можуть розщеплювати та інактивувати кілька білків комплементу (C2, C3, C4 та фактор B) [60]. Комбінація регуляторів комплементу від хазяїна та патогенних лептоспір сприяє колонізації бактерій в органах-мішенях хазяїна [63].

4.2. Лептоспіри і нейтрофіли

Під час інфекції патогенні види Leptospira викликають сильну активацію нейтрофілів і прозапальну відповідь. Нейтрофіли важливі для контролю над мікроорганізмами, але вони також сприяють пошкодженню тканин хазяїна. Було продемонстровано, що низькі рівні позаклітинного накопичення нейтрофілів через низьку активність нейтрофілів у кровообігу збільшують лептоспіремію, вказуючи на те, що внутрішньосудинне утворення рекрутів нейтрофілів може бути критичним у запобіганні ранньому поширенню патогенних лептоспір [64].

4.3. Лептоспіри та макрофаги

У початковій фазі зараження лептоспірами макрофаги відіграють важливу роль у елімінації спірохети. Цей ефекторний механізм разом з ефективною цитокіновою відповіддю пов’язаний з фагоцитозним контролем і поширенням інфекції, хоча Leptospira spp. Було показано, що індукує апоптоз у макрофагах через шлях Fas/FasL-caspase-8/-3 і полегшує їх виживання та проліферацію в хазяїні завдяки вивільненню мітохондріального фактора, що індукує апоптоз, і ендонуклеази в інфікованих макрофаги [65]. Недавні дослідження були проведені на мікротранскриптомах макрофагів, інфікованих Leptospira, для визначення епігенетичних механізмів, таких як посттранскрипційна регуляція за допомогою РНК. Макрофаги, інфіковані лептоспірами, показали, що мікроРНК (міРНК) регулюються шляхом інфікування спірохетами, демонструючи, що ця регуляція життєво важлива у відповіді цих клітин імунної системи на інфекцію лептоспір [66]. У макрофагах людини активація запалення, опосередкована активними формами кисню та лізосомальним катепсином B, що генерується інфекцією Leptospira, має значні рівні NLRP3 та IL-18, що сприяє виробленню IL-1 і призводить до високого рівня можливість фагоцитозу та швидке моделювання деяких цитокінів, що корелює з резистентністю до лептоспірозу [67].

4.4. Гуморальна реакція на лептоспіри

Специфічна гуморальна відповідь проти Leptospira характеризується виробленням антитіл IgM та IgG на третій день після появи симптомів. Крім того, повідомлялося про вироблення IgA з першого дня до дев’ятого місяця після інфікування; фактично підвищення рівня IgM використовувалося як альтернативний захід у ранній діагностиці лептоспірозу [68]. Ефект гуморальної відповіді у людини з лептоспірозом дозволяє проводити серологічний діагноз після природного зараження [69]. Найважливішим аспектом гуморальної відповіді при інфекції Leptospira може бути утворення захисних антитіл. Вакцини, які зараз доступні проти лептоспірозу, складаються з повних клітинних препаратів і мають обмеження, такі як низька ефективність, численні побічні ефекти, слабке формування імунної пам’яті та відсутність перехресного захисту для відмінностей серовару. Таким чином, розробка нових вакцин необхідна для контролю захворювання, і в даний час проводяться дослідження для отримання вакцин з генетичної імунізації [70]. OMP лептоспіри вважаються антигеном із кращою імуногенністю для В-лімфоцитів, які включають структурні епітопи OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} та LipL41263-282 [71]. Ці епітопи є перспективними кандидатами для розробки універсальної вакцини.

4.5. Адаптивна імунна відповідь на лептоспіри: Т-клітини та цитокіни

Патогенні види Leptospira індукують імунну відповідь, опосередковану Т- і В-лімфоцитами, що супроводжується експресією цитокінів, які можуть бути пов’язані з гравітаційними діаграмами. Активація Т-клітин під час інфікування лептоспірами ініціює запальну відповідь, головним чином через продукцію цитокінів. Це має вирішальне значення для раннього усунення інфекції, але неконтрольоване виробництво прозапальних цитокінів також може призвести до надмірного виробництва цитокінів з наступним станом імунного паралічу, який може призвести до сепсису та поліорганної недостатності. Т-лімфоцити виробляють IL-1, IL-6, IL-12, інтерферон (IFN)- і TNF-, які функціонують як хіміоатрактанти для рекрутування лейкоцитів у місці інфекції. Цікаво, що in ex vivo наївні δ Т-клітини проліферували в культурах мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC), стимульованих антигенами Leptospira, разом із продукуванням IL-17 та IFN [72]. Крім того, у той час як інфіковані лептоспірозом миші дикого типу продемонстрували вищі рівні великої кількості цитокінів, включаючи IL-4, IL-10 та IL-13, порівняно з неінфікованими мишами, індукована лептоспірами мишача хронічна нефрит (у мишей Daf1-/-) виявлено вищу експресію актину гладких м’язів, IL-10, IL-13, але немає різниці між IL-12 та IL{{21} } рівні [73]. Таким чином, Daf1 та IL-17 можуть відігравати вирішальну захисну роль у прогресуванні ХХН як зв’язок між спричиненою лептоспірами ХХН миші та фіброзом нирок [72,73]. Однак гіпотеза про реакцію вибраних цитокінів на прогресування захворювання досі непереконлива щодо лептоспірозу людини. У пацієнтів із тяжким лептоспірозом і ураженням легень було отримано підвищені рівні IL-6, CXCL8 та IL-10 порівняно з пацієнтами з легким лептоспірозом [53]. Ці високі концентрації цитокінів у пацієнтів з лептоспірозом підкреслюють їх ключову роль у розвитку тяжкого лептоспірозу.

У пацієнтів із тяжкою інфекцією виявлено CD4+ T-лімфоцити з прозапальним профілем і продуцентами IL-2 та IFN-, тоді як CD4+ CD25 виявляють високу кількість продуцентів IL-10 майже відсутні. Регулювання імунної відповіді, опосередкованої Т-лімфоцитами, здається, не запобігає пошкодженню тканин, спричиненому запальною відповіддю на Leptospira. У CD4+ T-лімфоцитах людей з тяжким лептоспірозом продукція TNF- та інших прозапальних цитокінів вища, ніж у пацієнтів з легкою формою захворювання, що вказує на те, що ці цитокіни можна використовувати як маркери тяжкість в імунологічній фазі інфекції [74]. Вироблення IL-10 пов’язане з ризиком смерті у людей з лептоспірозом; однак дослідження, проведене на людях, які зазнали впливу та без симптомів, пов’язали продукцію цього цитокіну з контролем запальної відповіді та виживанням [74]. Під час інфікування лептоспірами медіатори запалення та дія деяких лейкоцитів, таких як Т-лімфоцити, швидко регулюються у резистентних осіб, на відміну від того, що відбувається в осіб із важкими формами лептоспірозу [75].

Підводячи підсумок, можна сказати, що імунна відповідь на лептоспірозну інфекцію не повністю вивчена через клінічну поведінку пацієнтів з лептоспірозом, які взаємодіють з різними факторами вірулентності бактеріального геному, що надає лептоспірам серйозну патогенну здатність.

5. Клінічні прояви

Клінічні прояви лептоспірозу різноманітні, починаючи від легких, неспецифічних симптомів, таких як грипоподібні симптоми (лихоманка, міалгія та головний біль), до важких симптомів разом із кінцевою стадією ураження органів (наприклад, ГПН, гостра печінкова недостатність). , і геморагічний діатез, також відомий як синдром Вейля), гостре кровохаркання внаслідок легеневої кровотечі, гостра сплутаність свідомості внаслідок асептичного менінгоенцефаліту та гостра серцева недостатність внаслідок гострого або підгострого міокардиту [7]. Відповідно, три ознаки підозри на лептоспірозну інфекцію складаються з (i)гостре гарячкове захворювання, (ii) жовтяниця та (iii)гостре ураження нирок[12]. Провісниками важкої форми лептоспірозу є виражена міалгія на початку захворювання, схильність до сильних кровотеч, виражена жовтяниця. Цікаво наявність будь-якої попередньоїхронічні захворювання нирок(маленький розмір нирки) або збільшені, застійні нирки з анурією пов’язані з найгіршим результатом [12]. Таким чином, пацієнтам із захворюванням нирок, пов’язаним із лептоспірозом, необхідно негайно надавати допомогу.

6. Діагностика

6.1. Клінічний діагноз

Діагноз лептоспірозу базується на історії контакту, факторах ризику та клінічних проявах. Високий індекс підозри може уникнути подальшого пошкодження органів. Однак симптоми лептоспірозу часто приймають за інші причини гострого гарячкового синдрому, такі як інфекція денге, малярія, гепатит і активне аутоімунне захворювання. Відсутність патогномонічних ознак лептоспірозу означає, що діагноз орієнтовно ґрунтується на оцінці лихоманки та міалгії у пацієнтів з ендемічної території. З цієї причини необхідна лабораторна діагностика лептоспірозу.

6.2. Лабораторна діагностика

Лептоспіроз важко діагностувати лабораторно, особливо під час гострої фази. Його можна виконати шляхом безпосередньої ідентифікації спірохет або їх компонентів у рідинах або тканинах організму, виділення лептоспір у культурі або виявлення конкретних антитіл на різних клінічних фазах. Лептоспіроз важко відрізнити від таких захворювань, як малярія, лихоманка Денге, рикетсія, грип, гепатит і жовта лихоманка через його нечіткі клінічні прояви. Тому для підтвердження діагнозу необхідні лабораторні дослідження. Виявлення антитіл проти лептоспір, самих лептоспір або їх дезоксирибонуклеїнової кислоти є основою для цих тестів (ДНК). Сучасна лабораторна діагностика включає як пряму ідентифікацію (виявлення спірохет Leptospira або ДНК у зразках або виділення мікроорганізму зі зразків), так і непряму діагностику (серологічна діагностика або серологія для виявлення лептоспірної інфекції, яка базується на виявленні специфічних антитіл проти різних Лептоспіральні антигени) (табл. 1).

6.2.1. Пряме мікроскопічне дослідження, культура та виявлення антигену

Лептоспіри — це тонкі, яскраві, активно рухливі спіралі з характерним швидким обертанням (посмикувальна рухливість) під звичайним темнопольним мікроскопом (DFM), і для виявлення однієї клітини на поле необхідно приблизно 10 лептоспір/мл. При тривалості зараження на тиждень більше, у виході DFM є приблизно 10% померлих (від 100 до 90%). Для підвищення чутливості кілька спеціальних методів фарбування; Фарбування Warthin–Starry silver [76] та імунне фарбування (імуногістохімія, імунофлюоресценція, імуномагнітне захоплення антигену та фарбування імунопероксидазою [77]), для яких потрібні первинні антитіла, специфічні до серовару (в ізоляції або в комбінації).

Таблиця 1. Лабораторні дослідження для діагностики лептоспірозу.

LAMP, ізотермічне посилення, опосередковане петлею; ПЛР, полімеразна ланцюгова реакція; NGS, секвенування наступного покоління; IHA, непряма гемаглютинація; ІФА, імуноферментний аналіз; IgM, імуноглобулін М; МАТ, реакція макроскопічної аглютинації; MCAT, реакція мікрокапсульної аглютинації; ДНК, дезоксирибонуклеїнова кислота; DFM, темнопольна мікроскопія

Паралельно культура лептоспір з крові, сечі, спинномозкової рідини та біопсії тканини можлива протягом перших кількох днів до 10 днів після появи симптомів хвороби (стадія лептоспірозу). Оскільки вони повільно ростуть (час подвоєння становить 6–8 годин), вибагливі та схильні до контамінації, зразки культури необхідно зберігати принаймні 3–4 місяці, перш ніж їх викинути як негативні) з лише 23% чутливістю, але це необхідно для тесту на лікарську чутливість [6]. Таким чином, середовище EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) (комплекс олеїнового альбуміну) складається з бичачого сироваткового альбуміну (фракція V), Tween 80, тіаміну хлориду амонію, монокалію фосфату, динатрію фосфату та різних поживних речовин [78]. зазвичай використовується, тоді як для деяких сероварів потрібні більш спеціалізовані середовища T80/40/LH (полісорбат 40, гідролізат лактальбуміну, супероксиддисмутаза та сироватка кролика) [79]. Для первинної ізоляції великого та різноманітного діапазону вибагливих патогенних лептоспір Hornsby–Alt–Nally (HAN) є хорошим середовищем [80].

Виявлення антигенів лептоспір за допомогою імунопероксидази, імунофлюоресценції або імуномагнітної системи захоплення антигенів було розроблено для зразків із низьким бактеріальним навантаженням, або темнопольна мікроскопія не може бути використана, але не виконується регулярно через обмеження первинних антитіл [77]. Навпаки, розпізнавання нуклеїнової кислоти з новою ампліфікацією ДНК; полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) (тобто гніздова ПЛР, кількісна ПЛР [qPCR]), ізотермічна ампліфікація, опосередкована петлею (LAMP), і секвенування наступного покоління (NGS) є цінними для ранньої та точної лабораторної діагностики, особливо з Виділення лептоспір за допомогою посіву на біологічне середовище та гібридизації ДНК (ДНК-зонд) [81,82]. Різноманітність лептоспіральних мішеней (таких як 16S рибосомальна РНК) або ДНК можна ампліфікувати для діагностики [83], а ПЛР у реальному часі (RT-PCR) є більш чутливою та специфічною, ніж стандартна ПЛР [84]. Оскільки деякі праймери RT-PCR можуть зв’язуватися з неспецифічним сайтом, що призводить до хибнопозитивних результатів, останні аналізи мультиплексної ПЛР у реальному часі були розроблені з використанням двох наборів праймерів [85]. Вкладена ПЛР також допомагає виявляти більш специфічні та чутливі ділянки ДНК за допомогою додаткових наборів праймерів [86,87]. Однак сучасні тенденції діагностики лептоспірозу полягають у використанні як серологічних, так і молекулярних методів, таких як ПЛР та ELISA (простіше, ніж золотий стандарт серологічного МАТ), для країн з обмеженими ресурсами [88,89]. Крім того, метод LAMP [90] для виявлення гена 16S рРНК (rrs) є економічно ефективним, швидким і високопродуктивним способом виявлення патогенних лептоспір у сечі. В даний час NGS є найбільш точним незалежним від культури методом аналізу основного геному в рідинах організму (крові та сечі) [91], і майбутнім напрямком тестів на лептоспіроз буде рух до молекулярної класифікації лептоспір, яка подолає обмеження культуральне виділення лептоспір з клінічних проб. Таким чином, значення ПЛР у клінічній діагностиці лептоспірозу особливо велике, і з’являється кілька сучасних методів.

6.2.2. Виявлення антитіл до лептоспір

Використовується кілька серологічних діагностик; наприклад, тести на родоспецифічні антитіла (непряма гемаглютинація [IHA], твердофазний імуноферментний аналіз [ELISA], Lepto Dri Dot [латексна аглютинація], мікрокапсульна аглютинація [MCAT]) і тести на серовароспецифічні антитіла (мікроскопічний тест аглютинації [ МАТ]) [92,93]. Таким чином, критеріями MAT для діагностики є (i) чотириразове підвищення титру в парних сироватках (сероконверсія поточної інфекції) або (ii) одиничний високий титр (більше або дорівнює 1:400 або 1:800, вище при епідемії області) (серопозитивність) (антитіла можуть зберігатися протягом деякого часу після інфікування або перехресної реакції з іншими захворюваннями). Крім того, MAT вимагає живої панелі всіх сероварів Leptospira в регіоні з панеллю локально стандартизованих сероварів [93,94] відповідно до Всесвітньої організації охорони здоров’я тварин (19 антигенів, що представляють 15 серогруп) [95]. Оскільки антитіла виявляються через 5–7 днів після зараження, тест на MAT може бути негативним (титр < 1:50) протягом перших кількох днів інфікування. Діагностика лептоспірозу може бути виконана за зразками сечі [96] з використанням як серології, так і молекулярної детекції (16S рРНК), особливо у пацієнтів з нещодавньою інфекцією (MAT більше або дорівнює 1:800 або ELISA IgM-позитивний або обидва) [97] .

З обмеженими ресурсами оцінка клінічного прогнозу [98] на основі відповідної історії хвороби та пов’язаних лабораторних тестів із оцінкою за семи аспектами є наступною: гіпотензія (3), жовтяниця (2), м’язовий біль (2), ГПН (1,5). , низький гемоглобін (3), гіпокаліємія з гіпонатріємією (3) і нейтрофільоз (1) запропоновано (пороговий узагальнений бал 4 має площу під кривою робочої характеристики приймача {{10}}).78 ( 95% ДІ 0.68–0.89) для діагностики лептоспірозу [77]). Ця оцінка вірогідності Thai-Lepto при надходженні може бути діагностичним інструментом для ранньої передбачуваної діагностики лептоспірозу у пацієнтів із серйозною клінічною підозрою на захворювання.