Кількісний протеомний аналіз пацієнтів із COVID-19: фетуїн-А та тетранектин як потенційні модулятори вроджених імунних відповідей

АНОТАЦІЯ

Лікування важких випадків коронавірусної хвороби 2019 (COVID-19) є надзвичайно важливим для мінімізації смерті та ураження кінцевих органів. Тут ми провели протеомний аналіз зразків плазми пацієнтів із легкою, середньою та важкою формами COVID-19. Аналіз виявив диференційовано експресовані білки та різні терапевтичні потенційні мішені, пов’язані з вродженими імунними відповідями, такі як фетуїн-А, вітронектин (TN) і параоксоназа-1 (PON1). Крім того, зміни білків у плазмі показали порушення регуляції комплементу та каскадів згортання крові у пацієнтів із COVID-19 порівняно зі здоровими особами контролю. На завершення наші протеомні дані свідчать про те, що фетуїн-A і TN є потенційними мішенями, які можна використовувати для діагностики, а також для кращого розуміння патогенезу захворювання COVID-19.

Кінцеві органи відносяться до тканин або органів, які остаточно виконують певні функції в організмі людини, наприклад, печінка, нирки та легені. Пошкодження цих органів може призвести до різноманітних серйозних захворювань, таких як хронічна хвороба нирок, цироз печінки та хронічне обструктивне захворювання легень. Імунітет — це імунна відповідь організму на чужорідні патогенні мікроорганізми та тканини. Імунітет організму залишається в нормі, що дозволяє запобігти виникненню і подальшому загостренню захворювань. Тому пошкодження кінцевих органів тісно пов’язане з імунітетом, і вони взаємодіють, впливаючи на імунну функцію організму людини.

Пошкодження кінцевих органів може призвести до погіршення кількості та якості імунних клітин в організмі. Наприклад, пацієнти із захворюваннями печінки відчуватимуть лейкопенію, порушення функції печінки та знижений синтез антитіл, що зробить їх більш чутливими до інфекції після хвороби; зниження функції нирок призведе до уремії. Синдром, анемія, остеопороз та інші захворювання, ці фактори також впливатимуть на імунну функцію організму. З іншого боку, імунна відповідь організму також може впливати на кінцеві органи, наприклад, надмірна імунна відповідь може призвести до імунного гепатиту або анафілактичної пневмонії. Взаємодія пошкодження кінцевих органів і імунної дисфункції робить організм більш сприйнятливим до хвороб і скорочує його тривалість життя.

Таким чином, підтримання нормальної функції кінцевих органів і міцної імунної функції є ключовим фактором для підтримки доброго здоров’я. Люди повинні запобігати пошкодженню кінцевих органів шляхом правильного способу життя, такого як здорове харчування, належні фізичні вправи та відпочинок, і підтримувати нормальну імунну функцію шляхом активної профілактики та лікування захворювань. Видно, що потрібно приділяти увагу своєму імунітету. Цистанка може підвищити імунітет, і ефект хороший. Полісахариди в м’ясі можуть регулювати імунну відповідь імунної системи людини, покращувати здатність імунних клітин до стресу та зміцнювати імунні клітини. бактерицидний ефект.

Клацніть на переваги цистанчі для здоров’я

1. Введення

Тяжкий гострий респіраторний синдром, коронавірус 2 (SARS-CoV-2), спричинив коронавірусну хворобу 2019 (COVID-19) [1]. Хвороба COVID-19 характеризується різними клінічними фенотипами, починаючи від безсимптомних, легких і помірних до важких або вкрай важких, що характеризуються важкою пневмонією та високим ризиком смерті серед літнього населення, особливо у пацієнтів старше 70 років [ 2,3]. Вакцини були створені наприкінці 2020 року, і більшість людей у ​​всьому світі були щеплені щонайменше 2 дозами. Незважаючи на зменшення кількості інфікованих, а також зареєстрованих важких випадків, проблема ще далека від вирішення, а причина прогресування захворювання до важкого стану залишається невідомою. Крім того, SARS-CoV-2, як і інші віруси, змінюється з часом, і нові варіанти можуть мати модифікацію у початкових властивостях, таких як поширення та пов’язана з цим тяжкість захворювання, і ставати меншими (варіант омікрон) [4] або більшими (дельта варіант) [5] важкий. Потенційна поява нових варіантів все ще можлива, і розуміння механізму шляхів захворювання COVID-19 є дуже важливим.

Загальновідомо, що дисфункція імунної відповіді є основною проблемою проти вірусу та одужання від хвороби. Крім того, вроджені імунні відповіді вважаються ключовими факторами в модулюванні прогресування захворювання до безсимптомних, легких, помірних, важких або надзвичайно важких клінічних фенотипів [6,7]. Нейтрофіли та моноцити/макрофаги є ключовими елементами захисту на передовій лінії, що керують вродженими імунними реакціями під час інфекції [8,9]. Спайковий білок SARS-CoV-2 може активувати макрофаги безпосередньо через рецептор ACE2, присутній у цих клітинах [10].

Під час зараження імунні клітини вивільняли кілька білків, цитокінів і медіаторів для регулювання запалення та підтримки фізіологічного гомеостазу організму. Протеоміка на основі плазми — це практичний підхід до аналізу білкових профілів і сортування змін, пов’язаних із патофізіологічними станами або прогресуванням захворювання [11]. Були проведені різні дослідження протеоміки, щоб ідентифікувати та охарактеризувати профілі протеомів у різних когортах COVID-19 за допомогою тканин [12,13], клітин [14] або плазми [15,16]. Тому ми застосували протеоміку на основі плазми, щоб ідентифікувати потенційні білки, пов’язані з вродженою імунною системою, які мають відношення до хвороби COVID-19 і її тяжкості. Ми прагнемо вивчити закономірності експресії білка плазми у здорових та інфікованих COVID-19-пацієнтів і оцінити потенційну взаємодію з вродженою імунною відповіддю.

2. Результати

2.1. Протеомні профілі плазми

Щоб оцінити реакцію господаря на SARS-CoV-2, було проведено аналіз протеоміки плазми когорти пацієнтів із COVID-19 та здорових пацієнтів із контролю. У нашому дослідженні метод iTRAQ 4plex був ретельно обраний порівняно з іншими методами, позначеними протеомікою, через високу відтворюваність і покриття протеома [17]. Крім того, для кращої глибини загального протеомного покриття ми поєднали потужне фракціонування катіонообмінного пептиду з iTRAQ. Ілюстрація робочого процесу дослідження представлена ​​на рис. 1. Загалом 176 білків було ідентифіковано у всіх зразках плазми COVID-19 і здорових контрольних із частотою помилкових виявлень<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1.20 для підвищення регулювання та<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Результати показали, що кількість білків, які змінилися в групах порівняння, змінювалася, як показано на рис. 2а. Порівняльні результати показали, що 27 відсотків вимірювань диференціально експресованого білка збігаються у всіх трьох групах (рис. 2b). Діаграма Венна також показала, що кількість унікальних білків у попарному співчутті м’якої групи проти контрольної має більшу кількість порівняно з іншими групами. Це не обов’язково відображає відмінності на рівні ідентифікації білка, але кількісний рівень, враховуючи, що статистичні критерії були вибрані для зміни кратності та значення p. Щоб оцінити, чи можна розрізнити вимірювання диференціально експресованого білка для всіх порівнянь між групами COVID-19, було застосовано аналіз PCA. Цікаво, що результати показали, що існує чітке розмежування між групами COVID-19, як показано на рис. 3. Крім того, диференційовано експресовані білки були представлені шляхом створення графіка вулкана для всіх парних порівнянь здорового контролю та COVID{{ 7}} груп (рис. 4). Деякі білки з диференціальною експресією в нашому наборі даних раніше вважалися біомаркерами COVID-19 [16,18].

Аналіз онтології та шляхів генів за допомогою онлайн-інструменту «STRING» було проведено на вимірюваннях диференціально експресованого білка для здорових пацієнтів контрольної групи та пацієнтів із COVID{{0}} незалежно від групи, до якої вони належать. Для аналізу збагачення go більшість Було виявлено, що білки з диференціальною експресією беруть участь у біологічній регуляції, позаклітинній області та регуляторі молекулярної функції для біологічного процесу, клітинного комплементу та молекулярної функції відповідно (додатковий матеріал, рис. S1). Крім того, ми вивчили диференціально експресовані білки та їхню участь в аналізі шляху за допомогою бази даних KEGG. Статистичні критерії аналізу збагачення були обрані як p <0,01, а ранжування термінів шляху базувалося на кратному збагаченні, як показано в додатковому матеріалі (рис. S2). Під час інфікування пошкоджені та мертві клітини ініціюють великі імунні відповіді та вивільняють різні клітинні компоненти та ендотоксини, які активують каскад згортання крові [19]. Активація таких шляхів призводить до ендотеліальної дисфункції та запалення, а також до стимуляції міграції лейкоцитів та тканинної інфільтрації, таким чином запускаючи активацію місцевих відповідей вродженого імунітету [20]. У нашому дослідженні було виявлено, що система комплементу, яка є центральним модулятором вродженого імунітету та каскадних шляхів коагуляції, є найбільш значущою серед інших термінів шляху. Кілька досліджень протеоміки плазми пацієнтів із COVID-19 показали, що каскади комплементу та коагуляції були одними з найбільш збагачених шляхів [21,22]. Однак у центрі нашої дискусії три білки фетуїн-A, TN і PON-1 як потенційні нові мішені, що беруть участь у вроджених імунних відповідях на інфекцію SARS-COV-2 і тяжкість COVID{{ 14}} захворювання.

2.2. Рівень TNF у плазмі пов’язаний із симптомами хвороби COVID-19

Цитокіновий шторм, спричинений Sars-CoV2, є однією з ознак важких випадків захворювання COVID-19 [23]. Повідомлялося, що надмірне вивільнення TNF пов’язане з тяжкістю та поганим прогнозом у пацієнтів із захворюванням COVID-19 [24,25]. У нашому дослідженні вимірювання рівня TNF у плазмі показало очікуване збільшення в групах COVID-19 порівняно зі здоровими контрольними групами, що підтверджується подальшим збільшенням у важких зразках порівняно з помірними або легкими.\

3. Обговорення

Для вивчення змін у зразках сироватки/плазми COVID-19 було використано кілька нецільових досліджень протеоміки. Кількість ідентифікованих білків у цих дослідженнях різна через різні методи, які використовувалися. Підхід кількісної оцінки без міток із використанням незалежного від даних методу збору показав більш високе покриття протеомів плазми [26]. Для протеомного підходу на основі маркування метод кількісного визначення ТМТ на основі Orbitrap LC-MS/MS показав більш високе покриття протеомів плазми/сироватки з кількістю ідентифікованих білків, що досягає 900 [27]. У нашому дослідженні загальна кількість ідентифікованих білків становила 176, що дуже близько до двох опублікованих досліджень, у яких використовувався той самий аналізатор маси (TripleTOF), де ідентифіковано 179 і 189 білків [28,29]. Циркулюючі білки в плазмі пацієнтів із COVID-19 є вікном для виявлення прогресування та тяжкості захворювання, а також сигнатур запалення та вроджених і адаптивних імунних реакцій.

Виробництво та надмірне вивільнення прозапальних цитокінів вважається ключовим моментом у зміні клінічного фенотипу від помірного до важкого стану у пацієнтів із COVID-19. Під час інфекції вроджені імунні відповіді модулюються молекулярними структурами, пов’язаними з пошкодженням (DAMP) або молекулярними структурами, пов’язаними з патогеном (PAMP) [30]. Білки гострої фази (АРР), такі як фетуїн-А, систематично вивільняються в плазму для підтримки протизапального процесу під час запалення. У нашому дослідженні ми спостерігаємо чітке зниження плазматичного фетуїну-А у помірних і важких випадках порівняно зі здоровими особами контролю (рис. 4). Було продемонстровано, що фетуїн-A може пригнічувати ранні (TNF, IL-1, IL-6 та INF) і пізні (HMGB1) медіатори, що вивільняються клітинами вродженого імунітету, такими як макрофаги [31]. Аналіз TNF у нашій когорті COVID-19 вказує на тенденцію до збільшення концентрації в плазмі порівняно зі здоровими донорами, які більш потенціюються у важких випадках (додатковий матеріал, рис. S3). Під час запалення активовані моноцити/макрофаги вивільняють прозапальні цитокіни, які послаблюються повсюдним біогенним аміном, що називається сперміном [32]. Однак протизапальний ефект сперміну залежить від фетуїну-А. Таким чином, спермін не може пригнічувати функцію клітин з дефіцитом фетуїну-А моноцитів/макрофагів [33]. Крім того, зниження рівня фетуїну-А може бути пов’язане з судинними аномаліями та тромбозом, виявленим у надзвичайно важких випадках через збільшення кальцифікації судин та ендотеліальної дисфункції [34,35] та окисного стресу [36], пов’язаного з рівнями фетуїну-А. .

Після вірусної інфекції апоптоз клітин є одним із захисних механізмів хазяїна. Однак надмірне накопичення апоптичних клітин через дефекти кліренсу апоптичних клітин пов’язане з гіперзапаленням і аутоімунітетом [37]. Зниження рівня фетуїну-А в плазмі може бути принаймні частково залученим до цього процесу, оскільки воно збільшує здатність фагоцитозу очищати апоптотичні клітини макрофагами [38] і везикули VSMC [39].

Нещодавно було повідомлено, що фетуїн-А відіграє вирішальну роль не лише як інгібітор кальцифікації, але й як мультизахисний компонент, зменшуючи фіброз і запалення та модулюючи поляризацію макрофагів [40].

Рудлофф та ін. продемонстрували, що фетуїн-A є цільовим геном HIF, який відіграє захисну роль у спричиненій гіпоксією дисфункції нирок [40]. Фетуїн-А зменшує перевантаження макрофагів кальцієм внаслідок гіпоксії. Нещодавно ми продемонстрували, що спайковий білок коронавірусу SARS-CoV-2 активує -1-подібні макрофаги та підвищує рівень внутрішньоклітинного кальцію [41]; таким чином, фетуїн-А може відігравати роль поглинача кальцію для регулювання клітинного гомеостазу та модуляції адекватної поляризації для розумних вроджених імунних відповідей, таким чином уникаючи надмірного запалення.

Синдроми поліорганної дисфункції (MODS) або пов’язані з інфекцією MODS вважаються однією з основних причин смерті у важких випадках COVID-19 [42]. Гіперзапалення та імунна дисрегуляція під час інфекції призводять до кінцевого пошкодження органів через недостатність вродженої імунної відповіді та гіперцитокінемію. За системної інфекції бактеріальні ендотоксини та вірусні РНК розпізнаються вродженою імунною системою, яка запускає експресію та вивільнення ранніх цитокінів (TNF та INF). Крім того, вроджені імунні відповіді передньої лінії стимулюють вироблення пізніх медіаторів, таких як група високої мобільності 1 (HMGB1) [43]. Внутрішньо- або позаклітинний HMGB1, експресований у більшості клітин, є сигналізатором, що вивільняється при стимуляції або після смерті клітини [44]. Гіпервивільнення HMGB1 запускає продукцію цитокінів, таких як IL-6 [45]. Підвищена концентрація IL-6 була пов’язана з тяжкими наслідками мультисистемного запального синдрому у дітей (MIS-C), пов’язаного з інфекцією SARS-CoV-2 [46]. IL-6 секретується головним чином моноцитами/макрофагами, особливо коли поляризований до M1--подібного фенотипу. Було також продемонстровано, що HMGB1 може поляризувати макрофаги через Toll-подібний рецептор (TLR) 4 [47].

Тетранектин (CLEC3B) є одним із білків, що зв’язують HMGB1-, і його взаємодія може модулювати біологічну функцію та запальний процес під час інфекції. Високоочищений білок TN інгібував залежно від дози LPS-індуковане вивільнення HMGB1 у макрофагах [48]. Порушення регуляції вродженої імунної системи, що призводить до імунної надмірної активації, є звичайним майбутнім важких випадків COVID-19 і сепсису. Нещодавно було продемонстровано, що концентрація вітронектину в крові різко знижується у пацієнтів з надзвичайно важким сепсисом [48]. Нещодавно Yuming Li та ін. [49] повідомили про зниження регуляції вітронектину у важких випадках COVID-19 пацієнтів за допомогою методу кількісної протеоміки без міток. Ми підтвердили значне зниження цього білка в плазмі в нашому дослідженні (рис. 4) з різними групами та на основі кількісного методу мітки. Таким чином, вітронектин можна вважати потенційним маркером вродженої імунної дисрегуляції, пов’язаної з тяжкістю симптомів COVID-19.

Тетранектин бере участь у системі фібринолізу, що веде до контролю аномальної коагуляції; таким чином, знижена регуляція TN пов’язана з серцево-судинними захворюваннями, такими як ішемічна хвороба серця (ІХС) [50]. Слід зазначити, що у багатьох важких випадках пацієнтів, інфікованих SARS-COV-2, спостерігається судинна дисфункція, можливо, через дефіцит TN. Зниження рівня ТН у ​​сироватці крові супроводжується зниженням параоксонази 1 (PON1) при різних серцево-судинних захворюваннях. У нашому дослідженні знижена регуляція PON1 (рис. 4) може бути маркером прогресування захворювання до важких симптомів, оскільки повідомлялося, що наявність запалення та окисного стресу пов’язана зі зниженням PON1 у сироватці крові при серцево-судинних захворюваннях [51] . Крім того, низький рівень PON1 може загострити вроджену прозапальну реакцію на вірусну інфекцію, оскільки було продемонстровано, що PON1 пригнічує надмірну реакцію макрофагів і підтримує запалення при атеросклерозі [52]. Порушення регуляції TN впливає на наступні ефектори AMPK, такі як HIF1, який регулює фенотип і функцію вроджених імунних клітин і модулює поляризацію макрофагів до M1--подібного фенотипу, а також дозрівання DC [53,54].

У сукупності знижена регуляція вітронектину, фетуїну-A та PON1, що спостерігається в помірних і важких випадках, може бути пов’язана з порушенням регуляції вроджених імунних реакцій через дисфункцію моноцитів/макрофагів, що призводить до гіпервивільнення цитокінів і прогресування COVID{{4} } захворювання до важкого стану.

Крім того, наш протеомний аналіз виявив підвищення регуляції APOE (додатковий матеріал, рис. S4) у важких випадках порівняно зі здоровими особами контролю. Відомо, що плазматичні рівні APOE модулюють функцію ліпопротеїнів і серцево-метаболічні захворювання. Крім того, APOE бере участь у запальному процесі шляхом перемикання поляризації макрофагів і впливу на про-/протизапальні фенотипи [55]. Згідно з цим, повідомлялося, що підвищення рівня APOE може бути пов’язане з тяжкістю COVID-19 [56].

Під час інфекції взаємодія системи макрофагів і комплементу важлива для вроджених імунних відповідей, а також для модуляції функцій комплементу та переходу від вроджених до адаптивних імунних умов [57]. Взаємодія компонентів комплементу з різними рецепторами на макрофагах стимулює запальний процес і продукцію цитокінів. У різних дослідженнях протеоміки повідомлялося, що порушення регуляції каскаду комплементу [58,59] у пацієнтів з COVID-19 і що активація системи комплементу посилює цитотоксичність Т-клітин у важких випадках [60]. Ми повідомили про значне збільшення комплементів 1q, 5, 6, 7 (додатковий матеріал, рис. S5) у пацієнтів з COVID-19 із середньою та важкою формами. У процесі апоптозного кліренсу клітин C1q контролює поляризацію моноцитів/макрофагів і пригнічує активність запалення [61]. Аналіз збагачення показав суттєвий зв’язок між компонентами комплементу C1q, C5, C6, C7 і каскадами коагуляції, де ми також знаходимо участь калікреїн-кінінової системи через кініноген-1, який модулює вроджені імунні реакції через шлях брадикініну.

Це дослідження має обмеження щодо розміру вибірки. Проте наші результати добре узгоджуються з попередніми дослідженнями протеоміки covid-19, у яких ми ідентифікували біомаркери, які виявляють подібну експресію. Це показує, що протеомічний підхід, використаний у цьому дослідженні, дійсний, але, можливо, не оптимальний.

4. Висновок

Під час інфекції SARS-COV-2 порушення імунної відповіді є основною проблемою, що призводить до ескалації захворювання COVID-19 до важких випадків. Механічні шляхи, що призводять до вродженої імунної дисфункції, є ключовими каменями у вирішенні ускладнень, пов’язаних із неконтрольованою інфекцією SARS-CoV-2. Наскільки нам відомо, це перше дослідження, яке використовує підхід iTRAQ для зразків плазми/сироватки COVID-19. Рівні TN, фетуїну-A та PON1 у сироватці є потенційними маркерами, принаймні частково залученими до вродженої імунної системи, зокрема до гіперактивації макрофагів, і, отже, їх можна вважати потенційними мішенями для лікування COVID-19.

5. Матеріали та методи

5.1. Дизайн дослідження та населення

Наші когорти дослідження включають 25 суб’єктів: здоровий контроль (n=5) і 20 пацієнтів, інфікованих SARS-COV-2, згрупованих відповідно до тяжкості захворювання (рис. 1) у легку (n=5) , помірний (n=5), важкий (n=5) ​​і мертвий (n=5). Групу померлих було виключено з початку дослідження через супутні захворювання суб’єктів, які могли вплинути на специфічність наслідків COVID-19. Усі пацієнти були набрані в спеціалізованій дитячій лікарні імені короля Абдалли (KASCH) і медичному центрі імені короля Абдаллазіза (KAMC). Усі учасники підписали інформовану згоду під час заповнення анкети про клінічні симптоми та демографічні дані.

Забір крові: від кожного пацієнта було взято 3–5 мл венозної крові. Для збору зразків крові використовували пробірки з ЕДТА; потім плазму відокремлювали центрифугуванням перед зберіганням при 80 ◦C для подальшого аналізу.

5.2. Приготування зразка плазми iTRAQ proteomics

П'ять біологічних зразків з кожної групи були об'єднані в один зразок. Потім усі зразки плазми піддавали обертовому картриджу Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin для видалення 14 найпоширеніших білків із плазми відповідно до протоколу виробництва (Agilent, США). Після цього переварені білки мічили за допомогою реагентів 4-plex iTRAQ (Sciex, Канада) відповідно до протоколу виробництва з незначними модифікаціями. Коротше кажучи, 100 мкг білків були денатуровані, відновлені та алкіловані з використанням 8 М сечовини/100 мМ бікарбонату триетиламонію (TEAB), 50 мМ трис (2-карбоксиетил) фосфіну (TCEP) і метилметантіосульфонату (MMTS) відповідно. Потім зразки білків розщеплювали на пептиди за допомогою трипсину у співвідношенні 1:40 (трипсин до білка). Згодом зразки пептидів позначали 114, 115, 116 і 117 для здорового контролю, тяжкого, середнього та легкого відповідно. Усі 4 мічені зразки потім змішували та об’єднували в один зразок.

5.3. Фракціонування та знесолення пептидів

Об’єднаний зразок iTRAQ фракціонували в автономному режимі на основі катіонного обміну за допомогою спінової колонки Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific, США) відповідно до інструкцій виробника. Коротше кажучи, спінову колонку спочатку кондиціонували з використанням {{0}}.1% мурашиної кислоти з наступним завантаженням мічених пептидів у колонку. Дві стадії промивання проводили з використанням 0.1% мурашиної кислоти. Потім пептиди елюювали на 22 фракції шляхом зміни співвідношення 10% ацетонітрилу та концентрації форміату амонію з 15 мМ до 900 мМ. Згодом етап знесолення та очищення проводили полімерним сорбентом з оберненою фазою з використанням картриджа Oasis HLB (Waters, США). Коротше кажучи, картридж був кондиціонований і врівноважений ацетонітрилом і 0,1% мурашиною кислотою відповідно. Потім завантажували мічені пептиди та застосовували дві стадії промивання 0,1% мурашиною кислотою. Елюцію пептидів проводили з використанням 70% ацетонітрилу.

5.4. NanoLC-MS/MS

Кожну фракцію (загалом 22) завантажували на Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Дублін, Каліфорнія, США), поєднуючи з TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Канада) у трьох примірниках. Поділ пептидів на NanoLC проводили, як описано раніше [41]. MS1 і MS/MS для аналізу iTRAQ були встановлені таким чином: діапазон мас TOF 250–1500 з часом накопичення 0,25 с. Критерії IDA були для іонів більше 400 m/z із зарядовим станом 2–5. Поріг чисельності перевищує 200 cps. Скоригований CE під час перевірки параметра реагенту iTRAQ. Параметри джерела іонів були встановлені наступним чином: газ джерела іонів 1 (GS1), 25; Завісний газ (CUR), 25; IonSpray Voltage Floating (ISVF), 2250; Температура нагрівача інтерфейсу (HIT), 60.

5.5. iTRAQ кількісний протеомний аналіз

Необроблені дані MS iTRAQ були оброблені за допомогою програмного забезпечення ProteinPilot (версія 4.5, Sciex) для ідентифікації та кількісного визначення. Параметри були встановлені наступним чином: тип зразка, iTRAQ 4plex, Cys, алкілування, MMTS, травлення, трипсин, спеціальні фактори, денатурація сечовини, вид, Homo sapiens, база даних, база даних UniProt Proteome Humans (завантажено 29 жовтня 2019 р.); глобальний FDR було перевірено.

Зміну кратності та значення р розраховували на основі середнього значення інтенсивності пептиду та t-критерію Стьюдента відповідно. Дані iTRAQ MS були збережені в ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) з ідентифікатором PXD037400.

5.6. Біоінформатичний аналіз

Аналіз PCA проводили за допомогою функції «основний» у статистичному програмному забезпеченні R. VolcaNoseR [62] використовувався для створення графіків вулканів. Онлайн-інструмент STRING [63] використовувався для збагачення генів і аналізу шляху зі статистичними критеріями, встановленими на p < 0.05. Для аналізу шляхів була застосована база даних Кіотської енциклопедії генів і геномів (KEGG).

5.7. Вимірювання методом імуноферментного аналізу (ELISA).

Зразки готували, як описано раніше [64], використовуючи фактор некрозу пухлин (TNF-) і набір для аналізу ELISA (SEKH-0047, Solarbio life sciences). Коротко, 100 мкл зразків або стандартів додавали до кожної лунки, а потім інкубували при 37 ◦C протягом 1 години 30 хвилин. Після чотирьох разів промивання промивним буфером було додано кон’юговане з біотином антитіло для виявлення (100 мкл) перед інкубацією протягом 1 години при 37 ◦C. Проводили другий етап промивання (чотири рази) і додавали Streptavidin-HRP (100 мкл) перед інкубацією протягом 30 хвилин. Після промивання додавали розчин субстрату (TMB) (100 мкл) та інкубували протягом 15 хвилин у темряві перед додаванням стоп-розчину, і виміряли абсорбцію при 450 нм.

Фінансування

Ця стаття була підтримана грантом Міжнародного дослідницького центру короля Абдалли №. RC20/153/R і RC20/205/R і BioBank KAIMRC NGHA.

Етичне схвалення та згода на участь

Це дослідження було схвалено Інституційною ревізійною радою (IRB) Комітету з етики Міжнародного центру медичних досліджень імені короля Абдулли (KAIMRC) з IRB RC20/153/R та RC20/205/R. Письмова інформована згода була отримана від усіх учасників дослідження.

Внески авторів

BA: Задумав і розробив експерименти, проаналізував і інтерпретував дані. FAM, H⋅S, KA та HA: Провели експерименти. FA, HSA та MR: Проаналізовано та інтерпретовано дані. FA, MJ, AH та MB: надали реактиви, матеріали, інструменти аналізу або дані та написали статтю. TB: Задумав і розробив експерименти, проаналізував і інтерпретував дані.

Заява про наявність даних

Дані, пов’язані з цим дослідженням, були збережені в Дані iTRAQ MS були збережені в ProteomeXchange Consortium з ідентифікатором PXD037400.

Заява про інтереси

Автори заявляють, що у них немає відомих конкуруючих фінансових інтересів або особистих стосунків, які могли б вплинути на роботу, про яку йдеться в цій статті.

Подяки

Автори висловлюють свою вдячність проекту підтримки дослідників (RSP-2023/17) в Університеті короля Сауда, Ер-Ріяд, Саудівська Аравія.

Список літератури

[1] M. Almutlaq та ін., Класична та контррегуляторна ренін-ангіотензинова система: потенційні ключові ролі в патофізіології COVID-19, CJC Open 3 (8) (2021) 1060–1074.

[2] M. Ciccarelli та ін. Нецільова ліпідоміка виявляє специфічні ліпідні профілі у пацієнтів із COVID-19 різного ступеня тяжкості з регіону Кампанія (Італія), J. Pharm. Біомед. анальний 217 (2022), 114827.

[3] Q. Zhang та ін. Генетичні та імунологічні детермінанти критичної COVID{1}} пневмонії людини, Nature 603 (7902) (2022) 587–598.

[4] TF Aiello та ін. Інфекція варіантом Omicron SARS-CoV-2 пов’язана з менш тяжким захворюванням у госпіталізованих пацієнтів із COVID-19, J. Infect. 85 (5) (2022) e152–e154.

[5] CJH von Wintersdorff та ін. Інфекції SARS-CoV-2 Дельта-варіант демонструють чотириразове збільшення вірусного навантаження у верхніх дихальних шляхах порівняно з Альфа-версією або іншими варіантами, Sci. Доповідь 12 (1) (2022), 13922.

[6] JL Schultze, AC Aschenbrenner, COVID-19 and the human innate immune system, Cell 184 (7) (2021) 1671–1692.

[7] AD Lopez-Munoz та ін., Білок нуклеокапсиду SARS-CoV-2 клітинної поверхні модулює вроджений і адаптивний імунітет, Sci. Adv. 8 (31) (2022) eabp9770.

[8] MS Cardoso та ін. Фізичні взаємодії з бактеріями та найпростішими паразитами встановлюють рецептор-сміттяр SSC4D як рецептор розпізнавання образів широкого спектру, Front. Immunol. 12 (2021), 760770.

[9] X. Wei та ін. Дефіцит EDIL3 полегшує несприятливе серцеве ремоделювання шляхом поляризації макрофагів, опосередкованої позаклітинними пастками нейтрофілів (NET), Cardiovasc. рез. 118 (9) (2022) 2179–2195.

[10] X. Cao та ін., Спайковий білок SARS-CoV-2 активує макрофаги та сприяє індукції гострих запалень легенів у мишей, 2020 bioRxiv.

[11] TE Angel та ін. Протеоміка на основі мас-спектрометрії: існуючі можливості та майбутні напрямки, Chem. Соц. 41 (10) (2012) 3912–3928.

[12] T. Wang та ін., Протеомна та метаболомічна характеристика інфікованої SARS-CoV-2-макаки cynomolgus на ранній стадії, Front. Immunol. 13 (2022), 954121.

[13] X. Nie та ін., Багатоорганний протеомний ландшафт розтинів COVID-19, Cell 184 (3) (2021) 775–791 e14.

[14] DE Gordon та ін. Карта взаємодії білка SARS-CoV-2 розкриває цілі для перепрофілювання ліків, Nature 583 (7816) (2020) 459–468.

[15] julian.knight@well.ox.ac.uk, Консорціум CO-M.-oBACEa та CO-M.-oBA, Атлас крові COVID-19 визначає ознаки тяжкості та специфічності захворювання, Cell 185 (5) (2022) 916–938 e58.

[16] Y. Mohammed та ін., Поздовжній аналіз протеоміки плазми виявляє нові кандидати на біомаркери при гострому COVID-19, J. Proteome Res. 21 (4) (2022) 975–992.

[17] Т. М. Кейсі та ін., Аналіз відтворюваності протеомного покриття та кількісного визначення за допомогою ізобаричних міток маси (iTRAQ і TMT), J. Proteome Res. 16 (2) (2017) 384–392.

[18] Т. Шу та ін., Протеоміка плазми ідентифікує біомаркери та патогенез COVID-19, Імунітет 53 (5) (2020) 1108–1122 e5.

[19] GY Chen, G. Nunez, Стерильне запалення: відчуття та реакція на пошкодження, Nat. Rev. Immunol. 10 (12) (2010) 826–837.

[20] CT Esmon, J. Xu, F. Lupu, Вроджений імунітет і коагуляція, J. Thromb. Гемостаз 9 (Додаток 1) (2011) 182–188.

[21] Дж. Парк та ін., Поглиблений аналіз профілю протеомів крові виявив чіткі функціональні характеристики білків плазми між тяжкими та неважкими пацієнтами з COVID-19, Sci. Доповідь 10 (1) (2020), 22418.

[22] CB Messner та ін., Надвисокопродуктивна клінічна протеоміка розкриває класифікатори інфекції COVID-19, Cell Syst 11 (1) (2020) 11–24 e4.

[23] C. Huang та ін., Клінічні особливості пацієнтів, інфікованих новим коронавірусом 2019 року в Ухані, Китай, Lancet 395 (10223) (2020) 497–506.

[24] Д. М. Дель Валле та ін. Сигнатура запального цитокіну прогнозує тяжкість та виживання COVID-19, Nat. Мед. 26 (10) (2020) 1636–1643.

[25] FX Danlos та ін. Високі рівні TNF-альфа у пацієнтів із COVID-19, стійкими до тоцилізумабу, Eur. J. Cancer 149 (2021) 102–104.

[26] Х. Лі та ін. Протеомна та метаболомічна характеристика плазми хворих на COVID-19, які вижили через 6 місяців після виписки, Cell Death Dis. 13 (3) (2022) 235.

[27] Б. Шен та ін., Протеомна та метаболомічна характеристика сироватки пацієнтів із COVID-19, Cell 182 (1) (2020) 59–72 e15.

[28] Дж. Саріф та ін. Плазмовий градієнт розчинного рецептора активатора плазміногену типу урокінази пов’язаний з патогенним протеомом плазми та імунним транскриптомом і стратифікує результати при важкій формі COVID-19, Front. Immunol. 12 (2021), 738093.

[29] M. Villar та ін. Характеристика за допомогою кількісної сироваткової протеоміки імунозалежних прогностичних біомаркерів для симптомів COVID-19, Front. Immunol. 12 (2021), 730710.

[30] H. Wang, AE Sama, Протизапальна роль фетуїну-A при травмі та інфекції, Curr. мол. Мед. 12 (5) (2012) 625–633.

[31] В. Лі та ін., Печінковий білок, фетуїн-А, відіграє захисну роль у летальному системному запаленні, PLoS One 6 (2) (2011), e16945.

[32] M. Zhang, H. Wang, KJ Tracey, Регуляція активації макрофагів і запалення сперміном: нова глава в старій історії, Крит. Care Med. 28 (4 доповнення) (2000) N60–N66.

[33] H. Wang та ін., Фетуїн захищає плід від TNF, Lancet 350 (9081) (1997) 861–862.

[34] M. Ketteler та ін., Асоціація низьких концентрацій фетуїну-А (AHSG) у сироватці крові з серцево-судинною смертністю у пацієнтів на діалізі: перехресне дослідження, Lancet 361 (9360) (2003) 827–833.

[35] K. Caglar та ін. Концентрація фетуїну-а в сироватці крові та ендотеліальна дисфункція при хронічній хворобі нирок, Nephron Clin. Практ. 108 (3) (2008) c233–c240.

[36] NF El-Malkey, et al., Fetuin-A виявляє захисну дію проти експериментально індукованої кишкової ішемії/реперфузії, пригнічуючи аутофагічну загибель клітин, Exp. Biol. Мед. (Maywood) 246 (11) (2021) 1307–1317.

[37] IK Poon, et al., Кліренс апоптотичних клітин: основна біологія та терапевтичний потенціал, Nat. Rev. Immunol. 14 (3) (2014) 166–180.

[38] HP Jersmann, I. Dransfield, SP Hart, Fetuin/alpha2-HS glycoprotein посилює фагоцитоз апоптичних клітин і макропіноцитоз людськими макрофагами, Clin. Sci. (Лондонія) 105 (3) (2003) 273–278.

[39] JL Reynolds, et al., Багатофункціональна роль сироваткового протеїну fetuin-a в інгібуванні кальцифікації клітин гладких м’язів судин людини, J. Am. Соц. Нефрол. 16 (10) (2005) 2920–2930.

[40] S. Rudloff та ін., Fetuin-A є мішенню HIF, яка захищає цілісність тканин під час гіпоксичного стресу, Nat. Комун. 12 (1) (2021) 549.

[41] T. Barhoumi та ін., SARS-CoV-2 спайковий білок-індукований апоптоз, запальний і окислювальний стресові реакції в THP-1-подібних макрофагах: потенційна роль ангіотензинперетворюючого ферменту інгібітор (периндоприл), Фронт. Immunol. 12 (2021), 728896.

[42] C. de Roquetaillade та ін. Час і причини смерті пацієнтів із тяжкою формою COVID-19, Крит. Догляд 25 (1) (2021) 224.

[43] CS Zhu та ін. Ендогенна регуляція та фармакологічна модуляція вивільнення та дії HMGB1, викликаного сепсисом: оновлений огляд, Клітини 10 (9) (2021).

[44] H. Yang, H. Wang, U. Andersson, Націлювання на запалення, викликане HMGB1, Front. Immunol. 11 (2020) 484.

[45] N. Kamiya, HK Kim, Підвищення прозапального цитокіну HMGB1 у синовіальній рідині пацієнтів із хворобою Легга-Кальве-Пертеса та кореляція з IL-6, JBMR Plus 5 (2) (2021), e10429.

For more information:1950477648nn@gmail.com