Кількісна оцінка запальних інфільтратів у біопсіях трансплантованої нирки з використанням мультиплексної ампліфікації тирамідного сигналу та глибокого навчання
Mar 25, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Мейке Гермсен1Валерій Волк2Ян Гінріх Бразен2та ін
Анотація
Затримка функції трансплантата (DGF) є сильним фактором ризику розвитку інтерстиціального фіброзу та тубулярної атрофії (IFTA) при трансплантації нирки. Кількісна оцінка запальних інфільтратів у біоптатах нирок пацієнтів із DGF може виявити прогностичні маркери розвитку IFTA. У цьому дослідженні ми об’єднали мультиплексну ампліфікацію сигналу тираміду (mTSA) і згорткові нейронні мережі (CNN) для оцінки запального мікрооточення в біоптатах нирки пацієнтів із DGF (n=22), взятих через 6 тижнів після трансплантації. Пацієнти були стратифіковані для розробки IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">
Cistanche deserticola запобігає захворюванням нирок, натисніть тут, щоб отримати зразок
вступ
Відстрочена функція трансплантата (DGF) після трансплантації нирки є багатофакторною і в основному пов’язана з характеристиками донора та часом ішемії. DGF зазвичай описується як потреба в діалізі протягом 7 днів після трансплантації та є сильним фактором ризику хронічного пошкодження ниркового трансплантата [1–3]. Класичним компонентом хронічного ураження нирок є наявність інтерстиціального фіброзу та тубулярної атрофії (IFTA). Однак не всі пацієнти з DGF прогресують до розвитку IFTA, а складний зв’язок між DGF та IFTA все ще недостатньо вивчений. По-перше, це пов’язано з часом між потенційно причинними подіями та функціональним погіршенням, а по-друге, через змінні та складні ефекти потенційних індукторів, таких як відторгнення та побічні ефекти ліків [1, 4]. Загальна присутність запалення та специфічних макрофагів була описана в численних дослідженнях як предиктор втрати трансплантата [5–8]. Однак патологічні процеси, що лежать в основі, не повністю вивчені, і високі рівні запалення не завжди призводять до тривалої втрати трансплантата. В результаті подразників зовнішнього середовища макрофаги набувають спеціалізованих функцій і поляризуються в різні фенотипи. Численні дослідження показують, що специфічні підтипи макрофагів (альтернативно активовані макрофаги) беруть участь у ремоделюванні тканин шляхом індукції відновлення тканин або фіброзу. Відомо, що поляризація фенотипу тканинного ремоделювання (іноді профіброзного) залежить від широкого діапазону подразників навколишнього середовища, серед інших, що забезпечуються субтипами Т-хелперних лімфоцитів [9–11]. Оцінка популяції клітин Т-хелперів у трансплантаті під час DGF виявила переважаючий субтип Т-хелперів 1, але кореляції з результатом трансплантату або прогресуванням до IFTA досі не досліджувалися [12]. Комплексна оцінка запального мікрооточення, спеціально зосереджена на макрофагах і субгрупах Т-хелперних клітин у ретельно відібраних когортах пацієнтів, може дати розуміння того, чому деякі, але не всі пацієнти з DGF прогресують до розвитку IFTA.
Проте всебічному дослідженню запальних інфільтратів перешкоджає кілька (технічних) обмежень. Традиційні методи імуногістохімії (ІГХ) та імунофлюоресценції підтримують візуалізацію лише обмеженої кількості клітинних маркерів в одному зрізі тканини. Послідовне розрізання невеликих цінних фрагментів тканини, таких як біопсія нирки, небажане, і інтерпретація взаємозв’язків між клітинами в різних зрізах є складною. Крім того, кількісна оцінка запальних інфільтратів шляхом візуальної оцінки супроводжується значним рівнем варіабельності між спостерігачами [13]. Традиційні методи обробки зображень, такі як порогове значення пікселів, вододіл і сегментація на основі морфології, покладаються на попередні знання про всі морфологічні представлення клітин та інтенсивність забарвлення тканин у всьому наборі даних [14–16]. Таким чином, цим методам часто не вистачає стійкості до біологічних і технічних варіацій зображень, і вони погано переносяться на нові або зовнішні набори даних. Зростання цифрової патології прискорило розробку альтернативних методів оцінки зображень цілих слайдів (WSI) [17, 18]. Доведено, що моделі глибокого навчання, зокрема згорткові нейронні мережі (CNN), здатні сегментувати та виявляти відповідні біологічні структури в гістопатологічних препаратах [19–23]. Ці методи мають потенціал для переходу від суб’єктивної візуальної оцінки та традиційної обробки зображень до точного, об’єктивного та відтворюваного виявлення клітин.
Метою цього дослідження є розробка методу для об’єктивної кількісної оцінки множинних маркерів запальних клітин, що дозволяє уникнути потреби в розширених серійних зрізах на слайдах. Для цього ми поєднуємо мультиплексну IHC, мультиспектральну візуалізацію та моделі глибокого навчання. Щоб продемонструвати застосовність цих методів, ми вивчаємо кореляцію запального мікрооточення, кількісно визначеного за допомогою моделей глибокого навчання, з розробкою IFTA у контрольних біопсіях трансплантата пацієнтів із DGF.
екстракт цистанхеї для лікування захворювань нирок
Матеріали та методи
Щоб оцінити запальне мікрооточення в біоптатах нирки пацієнтів із DGF, ми провели мультиплексну ІГХ на контрольних біоптатах, взятих через 6 тижнів після трансплантації. Пацієнти були стратифіковані для розробки IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">
Зразки тканин
Ми використали біопсію для спостереження від реципієнтів трансплантованої нирки в Ганноверській медичній школі (Ганновер, Німеччина), отриману в контексті програми проспективної біопсії для спостереження. Критеріями включення були: наявність DGF (визначається як<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">
Оцінка IFTA
Ступінь інтерстиціального фіброзу (ci) і тубулярної атрофії (ct) (IFTA) через 6 тижнів і 6 місяців, виражений за допомогою системи оцінки ураження Банфа [24], був отриманий зі звіту про патологію. Щоб більш детально оцінити взаємозв’язок між ранніми запальними інфільтратами та розвитком IFTA, усі слайди, пофарбовані PAS, були оцифровані для повторного дослідження за допомогою цифрового сканера Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, Угорщина) з 20 × об’єктив із роздільною здатністю 0,24 мкм/ піксель. PAS WSI для обох часових точок (6 тижнів і 6 місяців) оцінювали ступінь IFTA (відсоток площі поверхні з 10-відсотковими інтервалами) трьома нирковими патологами. Середні бали IFTA патологів використовували як остаточну оцінку для розрахунку зміни IFTA між 6 тижнями та 6 місяцями після трансплантації. Пацієнти були стратифіковані за абсолютним підвищенням балу IFTA на 10 відсотків або більше (n=13) і відсутністю або<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">
Крім того, показники ураження Банфа порівнювали між точками часу за допомогою критерію знакових рангів Вілкоксона. Це виявило значні відмінності між біопсіями через 6 тижнів і 6 місяців для категорій Банфа ti (p=0.017), ci (p=0.004) і ct (p=0.011) .
Мультиплексне фарбування TSA
Ми виконали мультиплексну IHC з використанням mTSA для візуалізації кількох клітинних маркерів у 6-тижневих біопсіях. Після інкубації з первинним і вторинним антитілом тканину обробляли флуоресцентно міченим тирамідом. Пероксидаза хрону з вторинного антитіла каталізує утворення активних тирамідних радикалів. Радикали тираміду ковалентно зв'язуються із залишками тирозину на антигені. Це постійне зв’язування дозволило індуковане теплом видалення первинно-вторинного комплексу антитіл, зберігаючи флуоресцентний відкладення тираміду [25]. Це уможливило подальшу послідовну інкубацію з іншими антитілами того ж виду проти цільових антигенів.
mTSA проводили на двох послідовних слайдах з 6-тижневих контрольних біопсій. Ми розробили дві панелі mTSA для оцінки запального інфільтрату та перитубулярних капілярів у наших групах пацієнтів. Існувала панель I антитіл до CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 і CD34. Панель II була використана для дослідження Т-хелперів і поляризації макрофагів за допомогою анти-CD4, Tbet, GATA3, CD68 і CD163 антитіл. Специфікації антитіл, розведення та порядок фарбування наведено в Додатковій таблиці 1. Усі слайди депарафінізували в ксилолі, зневоднювали в 95-відсотковому етанолі, промивали у водопровідній воді та кип’ятили для отримання епітопу в 10-кратному розведеному трисбораті-EDTA (TBE 10x). , 0658, VWR Life Sciences, США) буфер. Після охолодження слайди промивали 3-відсотковим розчином пероксидази водню для блокування ендогенної пероксидази та промивали трис-буферним сольовим буфером з 0,05-відсотковим Tween 20 (822184, Merck KGaA, Німеччина) (TBS-T). Блокування білка проводили за допомогою TBS-T з 1 відсотком бичачого сироваткового альбуміну (BSA) (mTSA, етап 1). Первинні антитіла інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі або протягом ночі при чотирьох градусах Цельсія (ступінь 2 mTSA). Після промивання в TBS-T слайди інкубували з HRP-кон’югованим вторинним антитілом (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Нідерланди) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі (mTSA етап 3). Далі було проведено TSA з використанням флуорофорів Opal TSA з набору Opal 7-color Manual IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, США) (mTSA крок 4) (флуорофори та відповідні їм антитіла перераховані в Додатковій таблиці 1). Комплекс антитіло-TSA видаляли за допомогою циклу кип’ятіння в буфері TBE (стадія 5 mTSA). Кроки 1–5 mTSA повторювали, доки предметні скла не пофарбували всіма антитілами з відповідної панелі. Предметні скла покривали fluoromount-G з DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, США).
herba cistanche
Мультиплексна перевірка TSA
Повторні цикли кип'ятіння можуть вплинути на афінність цільового епітопу. Деякі антитіла фарбуються слабше після багаторазового кип’ятіння тканини, іншим антитілам потрібно більше циклів кип’ятіння, щоб досягти оптимальної інтенсивності фарбування, а на інші це не впливає взагалі. Ми оцінили цей ефект для всіх антитіл, використовуючи хромогенну IHC на контрольній тканині мигдалин FFPE. Для кожного тестованого антитіла (n=9) було вирізано шість зрізів (товщиною 4 мкм). Усі слайди депарафінували в ксилолі, зневоднювали в 95-відсотковому етанолі, промивали у водопровідній воді та кип’ятили для отримання епітопу в 10-кратному розведеному TBE (перший цикл кип’ятіння). Після охолодження одне предметне скло на тестоване антитіло зберігали у фосфатно-сольовому буфері (PBS). Залишилися гірки ще раз проварити. Цей цикл повторювався п'ять разів. Згодом усі слайди промивали 3-відсотковим розчином пероксидази водню з подальшим споліскуванням у PBS. Первинні антитіла (додаткова таблиця 1) інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Після інкубації предметні скла промивали PBS. Скела, пофарбовані антитілами до CD68, Tibet і GATA3, вимагали додаткової інкубації з блокуванням після появи антитіл (PAB) протягом 15 хвилин (блокування VWRKDPVB, Immunologic, Нідерланди). Після інкубації слайди промивали PBS та інкубували з HRP-кон’югованим вторинним антитілом (відповідно до PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Нідерланди, для інших див. Додаткову таблицю 1 вторинних антитіл). Візуалізацію проводили за допомогою 3,3′-діамінобензидину (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Нідерланди). Результати візуалізовано на Додатковій рис. 1. На основі цих результатів ми визначили оптимальний порядок антитіл для експериментів з mTSA, як зазначено в Додатковій таблиці 1.
Якщо цікаві епітопи локалізовані разом, відкладення тираміду можуть заважати один одному. Для перевірки цього стеричного інгібування ми використали предметні скла контрольної тканини мигдаликів і пофарбували їх нашими панелями mTSA. Експресію антитіл у mTSA порівнювали з експресією на скельцях з одноразовим фарбуванням, які пройшли таку ж кількість циклів кип’ятіння. Ми не спостерігали відмінностей у моделях фарбування між слайдами, пофарбованими одинарним і мультиплексним фарбуванням (приклади включені з панелі I, Додаткові рис. 2 і 3). Усі первинні антитіла в mTSA використовували в тому самому розведенні, яке використовували для хромогенної IHC. Інтенсивність флуоресцентного сигналу оптимізували шляхом регулювання розведень розчину TSA.
Мультиплексне зображення TSA
Мультиспектральне зображення було виконано за допомогою Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, США) з об’єктивом 20x, з роздільною здатністю 0,49 мкм на піксель і з використанням DAPI, FITC, CY3, Texas Red і Спектральні куби Cy5. Система Vectra дозволяє вручну вибирати області для мультиспектрального збору, які згодом розбиваються системою на тайли (рис. 1.1). Спектри автофлуоресценції та всіх флуорофорів Opal TSA були попередньо записані в спектральну «бібліотеку» за допомогою програмного забезпечення Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, США). Спектральна бібліотека уможливила розкладання мультиплексної плитки на кілька окремих плиток, що представляють внесок кожного флуорофора («розмішування»). Це призвело до монохромних багатоканальних плиток, кожен канал відповідав одному флуороферу і, отже, антитілу (рис. 1.2).
Перехід до ІГХ штучного світлого поля
На основі збережених координат плитки були зшиті для створення багатоканального WSI за допомогою спеціального сценарію python (рис. 1.3). Канали, що представляють сигнал DAPI (IDAPI), і канали, що представляють одне з антитіл (IIHC), були перетворені на штучне фарбування гематоксиліном і DAB відповідно (рис. 1.4 і 1.5). На основі відомого хроматичного гематоксиліну та координат DAB Cx, Cy після перетворення насиченості тону (HSD) вектори плям були отримані в попередніх дослідженнях [26, 27]. Ці вектори фарбування були використані для розрахунку червоно-зелено-синіх значень для ІГХ штучного світлого поля (рис. 1.5), як:
з CR, st поглинання світла барвника st в червоній частині спектра. Значення для B і G були розраховані подібним чином.
Аналіз зображення
Регіони інтересу (ROI)
Області інтересу (ROI) були анотовані для кожного випадку в когорті за допомогою програмного забезпечення автоматизованої платформи аналізу слайдів (ASAP; версія 1.9, доступне як програмне забезпечення з відкритим кодом на GitHub). Ці ROI складалися з кортикального тубулоінтерстицію, таким чином виключаючи капсулу, клубочки та артерії. Оскільки запалення субкапсулярних ділянок нирки вважається неспецифічним при патології трансплантації, біопсії в цьому дослідженні в основному аналізували, за винятком субкапсулярної області (визначається як 400 мкм нижче капсули). По-друге, ми повторили аналізи, включаючи субкапсулярну область. Візуальні приклади ROI включені в Додатковий рис. 4.
Виявлення лімфоцитів CNN I
ІГХ-зображення штучного світлого поля, що представляють фарбування CD3, CD4, CD8 і CD20, аналізували за допомогою існуючої CNN з архітектурою U-Net [22, 28]. Ця мережа була спеціально розроблена для виявлення маркерів цитоплазматичних лімфоцитів у IHC. Продуктивність CNN можна виразити в точності, запам’ятовуванні та оцінці F1-, де:
CNN досягла точності {{0}}.76, відкликання 0.79 та F1-оцінки 0.78 у тестовому наборі який використовувався в оригінальній статті, що включає традиційний IHC WSI. Виявлення окремих позитивних клітин вимагає встановлення порогового значення вихідного сигналу CNN з подальшою постобробкою. Оскільки фарбування CD3 на панелі mTSA було сильнішим порівняно з CD4, CD8 і CD20, для останніх трьох використовувався нижчий поріг виявлення об’єкта (0,4) і вихідний поріг виявлення об’єкта для CD3 (0,7). Для оцінки ефективності CNN на IHC WSI зі штучним яскравим полем у цьому дослідженні чотири IHC WSI зі штучним яскравим полем (CD8 і CD20 від двох пацієнтів) використовувалися як тестовий набір у цьому дослідженні. Точкові анотації (n=1115) були створені за допомогою програмного забезпечення ASAP. Після застосування мережі було розраховано точність, запам’ятовування та оцінку F1- для оцінки ефективності CNN. Виявлення вважалися справді позитивними, якщо вони були знайдені в межах 4 мкм (середній діаметр лімфоцитів) від наземної анотації істинності. Коли було знайдено два виявлення в діапазоні 4 мкм, лише виявлення, яке було найближче до анотації, вважалося справді позитивним. Згодом виявлення лімфоцитів CNN I було використано для аналізу всіх штучних IHC WSI в світлому полі, що представляють маркери цитоплазматичних лімфоцитів (CD3, CD4, CD8 і CD20).
Виявлення лімфоцитів CNN II
Аналіз IHC WSI штучного світлого поля з шаблонами ядерного фарбування (як представлено T-bet і GATA3), канали, що представляють DAPI і CD4, були обрані для об’єднання в один WSI (4). Вектори фарбування, отримані в попередніх дослідженнях, були використані для штучного забарвлення сигналу DAPI в синій (гематоксилін) і сигналу CD4 в коричневий (DAB), що призвело до штучного IHC WSI у світлому полі (5).
необхідне навчання, перевірка та тестування нового CNN. Для цього з контрольної тканини FFPE нирок, мигдаликів і червоподібного відростка було вирізано дев’ять слайдів. Ці предметні скла були пофарбовані IHC за допомогою анти-Tibet (клон 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, США) та анти-GATA3 (клон L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Нідерланди) антитіла. Слайди були оцифровані за допомогою цифрового сканера слайдів Pannoramic 250 Flash II з роздільною здатністю 0,12 мкм/піксель. Два спостерігачі створили 5726 точкових анотацій у різних регіонах за допомогою програмного забезпечення ASAP. Анотації з п’яти слайдів були використані для навчання архітектури U-Net CNN з використанням фрагментів розміром 256 × 256 пікселів із розміром пікселя 0,49 мкм/піксель. Два WSI були використані для перевірки CNN і для визначення порогу виявлення об'єкта (0,4). Ефективність CNN на традиційному IHC WSI оцінювалась за допомогою тестового набору з двох IHC WSI. Ефективність CNN на IHC WSI зі штучним яскравим полем оцінювалася на вторинному тестовому наборі, що складається з чотирьох IHC WSI зі штучним яскравим полем (Tibet і GATA3 від двох пацієнтів) з анотаціями 1082 точки. Точність, запам’ятовування та оцінка F1-були розраховані для оцінки ефективності обох наборів тестів. Виявлення вважалися справді позитивними, якщо вони були знайдені в межах 4 мкм від наземної анотації істинності. Коли було знайдено два виявлення в діапазоні 4 мкм, лише виявлення, яке було найближче до анотації, вважалося справді позитивним. Згодом виявлення лімфоцитів CNN II було використано для аналізу всіх штучних IHC WSI в світлому полі, що представляють ядерні (лімфоцити) маркери (Tibet і GATA3).
Виявлення макрофагів CNN
На відміну від виявлення лімфоцитів, ідентифікація окремих макрофагів не є однозначною. Особливо в кластерних сценах можна очікувати значного рівня мінливості спостерігача. Таким чином, для навчання виділеної третьої CNN для виявлення макрофагів CD68 plus і CD163 plus було використано набагато більшу кількість випадків і людських анотацій. Були зібрані слайди, пофарбовані IHC (n=111) з нативної та трансплантованої ниркової тканини. IHC-фарбування проводили з використанням анти-CD68 (клон PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Данія або клон KP1, M0876, Dako, Данія) або анти-CD163 (клон MRQ -26 або 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, Великобританія) антитіло. Слайди IHC були оцифровані за допомогою панорамного цифрового сканера слайдів Flash II 250 або сканера слайдів Aperio AT2 (Leica Biosystems, Вецлар, Німеччина) з роздільною здатністю 0.24 або 0. .25 мкм/піксель відповідно. Чотири спостерігачі створили 37 709 точкових анотацій для кількох досліджуваних ділянок у WSI, використовуючи протокол для анотації макрофагів, який було узгоджено після початкових пілотних експериментів. Анотації зі 101 слайда були використані для навчання архітектури YoloV2 CNN [29]. Yolo спеціально підходить для завдань, спрямованих на виявлення. Мережа, що складається з семи згорткових шарів, була навчена на ділянках розміром 256 × 256 пікселів, виділених з роздільною здатністю 0,98 мкм/піксель з обмежувальними рамками 21 мкм (на основі середнього розміру макрофагів). Десять WSI були використані для перевірки CNN і для визначення порогу виявлення об'єкта (0,45) і параметрів немаксимального придушення (0,05). Ефективність CNN на традиційному IHC WSI оцінювалася за допомогою тестового набору з десяти IHC WSI. Ефективність CNN на IHC WSI зі штучним яскравим полем оцінювалася на вторинному тестовому наборі, що складається з чотирьох IHC WSI зі штучним яскравим полем (CD68 і CD163 від двох пацієнтів) з анотаціями 1033 точки. Точність, запам'ятовування та оцінки F1 були розраховані для оцінки продуктивності в обох наборах тестів. Виявлення вважалися справді позитивними, якщо вони були знайдені в межах 21 мкм (середній діаметр макрофага) від наземної анотації істинності. Коли в діапазоні 21 мкм було знайдено більше виявлень, справді позитивним вважалося лише виявлення, яке було найближче до анотації. Згодом виявлення макрофагів CNN було використано для аналізу всіх штучних світлопольових IHC WSI, що представляють маркери макрофагів (CD68 і CD163).
tubolosa cistanche тестостерон
Подвійний позитив
Позитивність клітин для двох маркерів (подвійна позитивність) оцінювали шляхом визначення кількості пікселів між виявленнями клітин у різних каналах. Якщо відстань між двома виявленнями лімфоцитів була<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">
Кількість клітин розраховували в межах досліджуваної ділянки, а щільність клітин базувалася на кількості клітин і площі анотованої досліджуваної ділянки.
Просторові відносини
Автоматизоване виявлення клітинок у WSI дозволяє досліджувати просторові відносини між клітинками. Середня найкоротша відстань була визначена (у регіонах, за винятком субкапсулярної області) для клітин CD68 plus і CD3 plus, CD3 плюс CD8 plus і CD20 plus в WSI панелі I для обох груп пацієнтів, а також між клітинами CD163 plus і CD4 плюс , CD4 плюс Tbet плюс і CD4 плюс GATA3 плюс в WSI для обох груп пацієнтів.
Перитубулярна протяжність капілярів
Щоб оцінити протяжність перитубулярних капілярів, незмішані WSI, що представляють канал CD34, були проаналізовані на Фіджі (ImageJ версія 2.0.0, США, макроси та плагіни: «Open and Duplicate», «ASAP ROI Reader") [30]. Позитивні пікселі були визначені за допомогою автоматичного порогового значення та згодом виражені у відсотках від загальної кількості пікселів у ROI.
Статистичний аналіз
Щільність наступних клітинних популяцій була розрахована в біопсії через 6 тижнів: Т-лімфоцити (CD3 плюс), цитотоксичні Т-лімфоцити (CD3 плюс CD8 плюс), В-лімфоцити (CD20 плюс), макрофаги (CD68 плюс, панелі I та II), поляризовані макрофаги (CD68 плюс CD163 плюс, CD163 плюс), лімфоцити Т-хелпери 1 (CD4 плюс Tbet плюс) і лімфоцити Т-хелпери 2 (CD4 плюс GATA3 плюс). Коефіцієнти кореляції Спірмена були розраховані для оцінки наявності кореляції між щільністю лімфоцитів Т-хелперів 1 і Т-хелперів 2 (CD4 плюс Tbet плюс, CD4 плюс GATA3 плюс) і щільністю поляризованих макрофагів (або CD68 плюс CD163 плюс, або CD163 плюс). Ми спостерігали сигнал CD68 (флуорофор 540 нм) у штучних CD4 (флуорофор 520 нм) IHC панелі I. Тому ми додатково повідомляємо щільність клітин для CD3 плюс CD8- клітин. Щоб оцінити відмінності між групами пацієнтів з різними результатами IFTA, ми повідомляємо про середнє, мінімальне та максимальне значення щільності клітин для кожної групи. Значні відмінності в щільності клітин і розмірі перитубулярних капілярів (визначених як відсоток CD34-позитивних пікселів) між групами оцінювали за допомогою U-критерію Манна-Уітні для незалежних зразків. За допомогою t-тесту для незалежних зразків оцінювали, чи пацієнти з різними результатами IFTA показують суттєво відмінні співвідношення CD3 + CD8−/CD3 + CD8 + клітини. Відмінності між групами пацієнтів у просторових співвідношеннях клітин CD68 plus і CD163 plus з іншими імунними клітинами оцінювали на значущість за допомогою U-тесту Манна-Уїтні для незалежних зразків.
Результати
Виявлення IHC-позитивних клітин на основі CNN
Щоб застосувати існуючі CNN, які спочатку були розроблені для світлопольної мікроскопії, флуоресцентні зображення mTSA були перетворені на зображення штучного світлого поля. Приклади областей, забарвлених mTSA, з відповідними зображеннями IHC у штучному світлому полі наведено на рис. 2. Приклад IHC WSI у штучному світлому полі продемонстровано на додатковому малюнку 4. WSI з різною роздільною здатністю можна відкривати та переглядати в режимі перегляду цифрових слайдів. програмне забезпечення, таке як ASAP і Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Як показано на рис. 2, IHC WSI у штучному світлому полі був придатним для автоматизованого аналізу CNN, які спочатку були розроблені для традиційного IHC WSI.
Три CNN були використані для кількісної оцінки запальних клітин у 6-тижневих біопсіях трансплантата, пофарбованих mTSA: для виявлення лімфоцитів за допомогою цитоплазматичного (CNN I) та ядерного (CNN II) IHC фарбування та для виявлення макрофагів. Таблиця 2 показує продуктивність CNN (показники точності, запам’ятовування та F1-) для наборів утримуваних зображень IHC WSI, пофарбованих DAB, і IHC WSI зі штучним яскравим полем. Продуктивність CNN, як правило, була такою ж або кращою, ніж базова CNN, описана раніше (з F1-оцінкою 0.78), яка, як було показано, має продуктивність, порівнянну з досвідченими ручними спостерігачами [22] . У той час як виявлення лімфоцитів CNN II продемонструвало дещо знижену продуктивність на віртуальних зображеннях світлого поля порівняно з реальними зображеннями DAB (на яких було навчено CNN), протилежне спостерігалося для CNN для виявлення макрофагів.
Приклад успішної автоматичної оцінки подвійної позитивності наведено на рис. 3.
Співвідношення різних типів клітин
Найсильніший зв’язок спостерігався між CD4 плюс GATA3 плюс щільністю клітин і CD163 плюс щільністю клітин (коефіцієнт Спірмена 0.75, p < 0.001)="" у="" біопсія="" через="" 6="" тижнів="" (додаткова="" рис.="" 5a).="" ця="" кореляція="" була="" слабшою="" між="" cd4="" плюс="" tbet="" плюс="" клітинна="" щільність="" і="" cd163="" плюс="" клітинна="" щільність="" (коефіцієнт="" спірмена="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (додатковий="" рис.="" 5b)="" .="" при="" обмеженні="" клітинної="" популяції="" подвійно="" позитивними="" макрофагами="" (cd68="" плюс="" cd163="" плюс),="" коефіцієнт="" кореляції="" спірмена="" становив="" 0.65="" (p="">< 0,01)="" для="" клітин="" cd4="" плюс="" gata3="" плюс="" і="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" для="" cd4="" плюс="" tbet="" плюс="" клітини="" (додатковий="" рис.="" 5c,="" d).="" включення="" субкапсулярної="" області="" в="" аналізи="" не="" змінило="">
Порівняння запальних інфільтратів міжпацієнтів, які прогресують до IFTA, порівняно з не IFTA
Пацієнти, які прогресували до IFTA через 6 місяців, показали значно вищу щільність клітин CD163 плюс у біоптатах, взятих через 6 тижнів після трансплантації (медіана 505 клітин/мм2), порівняно з пацієнтами, які не прогресували до IFTA (медіана 370 клітин/мм2; p=0 .043) (табл. 3). Включення субкапсулярної області призвело до незначного зменшення цього ефекту (p=0.051). В обох панелях використовували CD68 і CD4. Предметні скла, пофарбовані панеллю mTSA I, показали більшу позитивність CD68, ніж предметні скла, пофарбовані панеллю mTSA II. Щільність клітин CD4 вища на панелі mTSA II порівняно з панеллю mTSA I (табл. 3).
Протяжність перитубулярних капілярів була подібною в 6-тижневих біопсіях пацієнтів із DGF з різними результатами IFTA (табл. 3), як за виключенням (p=0,74), так і за включенням (p=0,90) субкапсулярної області з/в аналіз.
Оцінка співвідношення CD3 + CD8−/CD3 + CD8 + клітини показала значно вищий коефіцієнт у пацієнтів з<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">
Середня найкоротша відстань від клітин CD68 plus до клітин CD3 plus, CD3 плюс CD8 plus і CD20 plus (панель I) і від клітин CD163 plus до CD4 plus, CD4 плюс Tbet plus і CD4 плюс GATA3 plus клітин (панель II) суттєво не відрізняються між групами пацієнтів. Результати візуалізовано на рис. 4.
екстракт цистанки: покращує роботу нирок і фізичну силу
Обговорення
У цьому дослідженні ми розробили метод точної та об’єктивної кількісної оцінки запальних клітинних інфільтратів у біопсіях трансплантата пацієнтів із трансплантатом нирки та DGF, який обходить велике серійне розрізання матеріалу біопсії нирки. Для цієї мети ми поєднали мультиплексну IHC, тирамідну ампліфікацію сигналу, мультиспектральне зображення та кількісне визначення за допомогою CNN. Ми були першими, хто перетворив мультиспектральні дані в одному штучному хромогенному зображенні на маркер клітини, полегшивши аналіз WSI та застосування CNN, розроблених для IHC у світлому полі. Ми розробили два нових CNN для виявлення лімфоцитів і макрофагів, пофарбованих у ядро, і продемонстрували можливість узагальнення CNN, розроблених на традиційному IHC WSI, на штучний IHC WSI в світлому полі. Застосовність нашого методу була продемонстрована за допомогою кількісних результатів, отриманих CNN для вивчення кореляцій запального мікрооточення в 6-тижневих біопсіях пацієнтів із DGF із розвитком IFTA через 6 місяців після трансплантації.
Ми використовували комерційно доступний ручний набір для фарбування для мультиплексної IHC для візуалізації імунних клітин і перитубулярних капілярів у контрольних біоптатах, отриманих через 6 тижнів після трансплантації. Процедура мультиплексного фарбування складалася з кількох етапів промивання, інкубації та кип’ятіння тканини та включає кілька розчинів реагентів. Тому широка валідація методів і контроль якості мають велике значення, і рекомендується використання специфічних антитіл, які забезпечують постійну інтенсивність фарбування. Незважаючи на виконані етапи перевірки, макрофагоподібні моделі фарбування були помічені в CD4-каналах предметних стекол з панелей mTSA I і II. Цикли фарбування CD4 і CD68 не проводилися послідовно, тому це явище не могло бути спричинене неповним видаленням антитіла CD68 (додаткова таблиця 1). Хоча були описані рідкісні випадки подвійної позитивності макрофагів із CD4 [31], більш правдоподібне пояснення полягає в близькості спектрів випромінювання флуорофорів, які використовувалися для візуалізації CD4 (520 нм) і CD68 (540 нм), обидва охоплені за допомогою куба фільтра FITC флуоресцентного мікроскопа. Це може спричинити «протікання» сильного сигналу CD68 у канал CD4. Велика частина цього сигналу була виключена з аналізу на панелі I, оскільки лише CD4 плюс клітини, які були подвійно позитивними з CD3, використовувалися для загального аналізу Т-хелперних клітин. Тим не менш, ми вирішили також опосередковано оцінити загальні Т-хелпери, використовуючи CD3 плюс CD8− як заміну. На панелі II CD4 використовувався виключно в поєднанні з Tibet і GATA3, що обмежувало ризик використання хибнопозитивних виявлень.
Нижчу позитивність CD68 спостерігали на панелі II порівняно з панеллю I. Ми припускаємо, що це є результатом стеричного інгібування відкладенням тираміду, що належить до CD163 («ефект парасольки») [32]. Ми спостерігали значно більше CD163-позитивних клітин у досліджуваній когорті, ніж у тканині мигдаликів, яка використовувалася для перевірки стеричного інгібування, можливо, пояснюючи, чому цей ефект не було виявлено під час перевірки.
Мультиплексну ІГХ поєднували з мультиспектральним зображенням для дослідження мікрооточення пухлини в кількох онкологічних дослідженнях, а нещодавно також для аналізу відторгнення алотрансплантата нирки [33–35]. Щоб виділити внесок усіх маркерів у слайди mTSA, зрізи знімають за допомогою системи Vectra або подібного флуоресцентного мікроскопа з мультиспектральним налаштуванням. Після запису оглядового зображення з низьким збільшенням система Vectra ділить тканину на фрагменти та автоматично сканує фрагменти багатоспектрально. Це призводить до плиток зображень із кількома спектрами, що вносять внесок. Оскільки спектри окремих флуорофорів відомі із попередньо записаної спектральної «бібліотеки», можна розкласти мультиплексні плитки на кілька окремих плиток, що представляють внесок кожного флуорофору («розмішування»). У більшості досліджень незмішані зображення згодом аналізуються за допомогою комерційного програмного забезпечення. У багатьох випадках ці програми не підтримують аналіз WSI, мають проблеми з аналізом кластерних клітин і часто нестійкі до артефактів і варіацій фарбування. Перетворення незмішаних плиток на штучні IHC WSI світлого поля дозволило нам застосувати існуючу CNN, спеціально розроблену для виявлення лімфоцитів у IHC [22] (називається CNN I для виявлення лімфоцитів). Ця мережа може виявляти окремі та кластерні лімфоцити з високою точністю, будучи стійкою до фонового фарбування (рис. 2, CD3). Крім того, ми навчили два нових CNN для виявлення клітин із структурою ядерного фарбування (Тибет, GATA3) (виявлення лімфоцитів CNN II) і для виявлення макрофагів. Відомо, що макрофаги важко виявити через їх розсіяне фарбування. Тому CNN для виявлення макрофагів було навчено з використанням анотацій чотирьох різних експертів. Перед створенням анотацій було заплановано кілька зустрічей, на яких обговорювали та оцінювали критерії анотування макрофагів. Це призвело до створення мережі, яка може виявляти макрофаги відтворюваним способом, будучи при цьому надійною для неспецифічного фарбування (табл. 2, рис. 2 і додаткова рис. 6). Наскільки нам відомо, це перший алгоритм для виявлення макрофагів у відсканованих гістопатологічних зрізах. Ми протестували продуктивність усіх трьох мереж на тестовому наборі, що складався з традиційного IHC WSI (подібного до тих, що використовувалися під час навчання), і на вторинному тестовому наборі, який складався зі штучного світлого поля IHC WSI, створеного з мультиспектрально записаних зображень. Усі CNN показують дуже хороші показники на первинних наборах тестів і подібні F1-оцінки на вторинних наборах тестів. Показники ефективності виявлення лімфоцитів CNN I були розраховані на нормальній тканині, артефактах і клітинних кластерах. Штучний ІГХ у світлому полі другого тестового набору не містив тканинних артефактів і менше клітинних кластерів. Це може пояснити загальну кращу продуктивність цієї мережі в другому тестовому наборі. Виявлення макрофагів CNN було навчено та перевірено на анотаціях від чотирьох різних анотаторів. Незважаючи на те, що критерії анотації обговорювалися особливо, спостерігалися варіації в стилі анотації. Тому чутливість CNN, ймовірно, знаходиться десь посередині крайніх стилів анотацій. Анотації для другого тестового набору були створені одним анотатором, який, здавалося б, відповідає чутливості CNN.
Використання описаних CNN дозволило нам дослідити запальний інфільтрат з безпрецедентною точністю в унікальній серії ретельно відібраних біопсій раннього спостереження пацієнтів з ФДГ після трансплантації.
На жаль, кілька зразків довелося виключити з аналізу, переважно через недостатню кількість залишкової тканини після діагностичного дослідження. Навіть за обмеженого розміру набору даних ми виявили значно вищу щільність клітин CD163 плюс у біоптатах пацієнтів із DGF, у яких прогресував розвиток IFTA, що відповідає потенційно профіброзній ролі цих клітин [11]. Хоча спостережувана тенденція узгоджується з опублікованими даними, ми не можемо підтвердити шкідливий вплив ранньої присутності CD68 плюс макрофагів, про який раніше повідомлялося для інших груп пацієнтів з трансплантацією нирки [7, 36, 37]. Ми виявили позитивну кореляцію між щільністю клітин CD4 плюс GATA3 плюс і CD163 плюс клітин, що може підтвердити внесок лімфоцитів Т-хелперів 2 у профіброзне мікросередовище. Хоча в цьому дослідженні не було виявлено нових прогностичних біомаркерів для розвитку IFTA у пацієнтів з DGF, ми успішно розробили методи для точної, відтворюваної та масштабованої оцінки запального інфільтрату в розрідженій тканині, такій як біопсія після трансплантації. Ці методи є цінними для майбутніх кількісних досліджень запалення в гістопатологічній тканині.
Щоб зняти втому надниркових залоз за допомогою цистанхи, натисніть тут, щоб отримати докладнішу інформацію
Доступність даних
Запити на співпрацю, пов’язані з використанням даних, представлених у цьому дослідженні, можна адресувати відповідному автору (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) або FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).
Подяки
Ми дякуємо Марку Горрісу та Кіку Веррійпу за їхні поради щодо фарбування та візуалізації mTSA, Мерійну ван Ерпу за розробку налаштованої функціональності ImageJ, а також Софі ван ден Брук, Міллі ван де Варенбург і Мартіну Оттену за генерацію базової правди для мережі виявлення макрофагів. Крім того, ми дякуємо Ірині Шеффнер за допомогу у зборі клінічних даних.
Авторські внескиMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH і JAWML
спроектував дослідження. Матеріали пацієнтів і клінічні дані були зібрані та надані JS, WG і FF. FF координував роботу MHH. JHB, EJS і JK оцінили слайд PAS для відсотка IFTA. MH виконав фарбування mTSA, валідацію панелей I і II, а також візуалізацію та розмішування панелі I. VV зображена та незмішана панель II. DJG розробив методи перетворення плиток mTSA на штучне світлове поле WSI. MH виконав перетворення. ZS-C розробив CNN для виявлення лімфоцитів і написав сценарії для кількісного визначення лімфоцитів. JL розробив CNN для виявлення макрофагів і написав сценарії для кількісного визначення макрофагів. MH виконав кількісне визначення клітин і капілярів. NSS розрахувала відстані клітини. MH, BS, LBH і JAWML проаналізували дані. MH зробив фігури та склав документ. Остаточна версія рукопису була переглянута та схвалена всіма авторами.
ФінансуванняЦя робота була підтримана ініціативою ERACoSysMed (проект SysMIFTA) в рамках Рамкової програми Європейського Союзу «Горизонт 2020», запропонованої ZonMw (грант № 9003035004), за співфінансування Міністерства досліджень і освіти Німеччини (BMBF), грант № . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) і FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML отримав гонорар за консультації від Philips (Нідерланди) та гранти від
ContextVision, Philips (Нідерланди) і Sectra (Швеція), окрім поданої роботи. JK отримав фінансову підтримку від Dutch Kidney Foundation (проект DEEPGRAFT, грант № 17OKG23).
Дотримання етичних норм
Конфлікт інтересівАвтори заявляють про відсутність конкуруючих інтересів.
Етичне схвалення та згода на участьЗбір і аналіз даних проводилися за інформованою згодою пацієнта та за схваленням ради з етики (№ 2765) Ганноверської медичної школи.
Примітка видавцяSpringer Nature залишається нейтральною щодо претензій на юрисдикцію в опублікованих картах та інституційних зв’язків.
Відкритий доступЦя стаття поширюється за ліцензією Creative Commons Attribution 4.0 International License, яка дозволяє використовувати, обмінюватися, адаптувати, розповсюджувати та відтворювати на будь-якому носії чи у будь-якому форматі за умови, що ви вказуєте автора(ів) оригіналу ) і джерело, надайте посилання на ліцензію Creative Commons і вкажіть, чи були внесені зміни. Зображення або інші сторонні матеріали в цій статті включені до ліцензії Creative Commons статті, якщо інше не зазначено в кредитній лінії до матеріалу. Якщо матеріал не включено до ліцензії Creative Commons статті, а ваше передбачуване використання не дозволено законодавчими нормами або перевищує дозволене використання, вам потрібно буде отримати дозвіл безпосередньо від власника авторських прав.
Список літератури
1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Затримка функції трансплантата в трансплантаті нирки. Am J Transplant. 2011; 11: 2279–96.
2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Фактори ризику тривалої втрати трансплантата у реципієнтів ниркового трансплантата з хронічною дисфункцією алотрансплантата. Exp Clin Transplant. 2010; 8: 277-82.
3. Ярлагадда С.Г., Кока С.Г., Форміка Р.Н., Поджіо Е.Д., Паріх К.Р. Зв'язок між відстроченою функцією трансплантата та алотрансплантатом і виживанням пацієнтів: систематичний огляд і мета-аналіз. Трансплантація нефролу. 2009; 24: 1039–47.
4. Schröppel B, Legendre C. Відстрочена функція трансплантата нирки: від механізму до трансляції. Kidney Int. 2014;86:251–8.
5. Менгель М., Рів Дж., Буннаг С., Ейнеке Г., Джхангрі Г.С., Сіс Б та ін. Оцінка загального запалення перевершує поточну оцінку запалення за Банфом у прогнозуванні результату та ступеня молекулярних порушень у ниркових алотрансплантатах. Am J Transplant. 2009; 9: 1859–67.
6. Косіо Ф.Г., Гранде Дж.П., Вадей Х., Ларсон Т.С., Гріффін М.Д., Стегалл
MD. Прогнозування подальшого зниження функції алотрансплантата нирки на основі ранніх контрольних біопсій. Am J Transplant. 2005; 5: 2464–72.
7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z та ін. Роль макрофагів у розвитку фіброзу алотрансплантата нирки людини в перший рік після трансплантації. Am J Transplant. 2014; 14: 2126–36.
8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M та ін. Альтернативно активовані макрофаги в патогенезі хронічного пошкодження алотрансплантата нирки. Дитячий Нефрол. 2015;30:1007– 17.
9. Бісвас С.К., Мантовані А. Пластичність макрофагів і взаємодія з субгрупами лімфоцитів: рак як парадигма. Nat Immunol. 2010; 11: 889–96.
10. Anders HJ, Ryu M. Ниркове мікрооточення та фенотипи макрофагів визначають прогресування або зникнення ниркового запалення та фіброзу. Kidney Int. 2011; 80: 915-25.
11. Ордіхані Ф., Потула В., Санчес-Тархуело Р., Джордан С., Очандо Дж. Макрофаги при трансплантації органів. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.
12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M та ін. Підмножини Т-хелперів 1, 2 і 17 у пацієнтів з трансплантатом нирки з уповільненою функцією трансплантата. Transpl Int. 2011; 24: 233-42.
13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Оцінка лімфоцитів, що інфільтрують пухлину: від візуальної оцінки до машинного навчання. Семінар Cancer Biol. 2018;52:151–7.
14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Метод на основі аналізу зображень для кількісної оцінки параметрів індексу хронічного пошкодження алотрансплантата. AMPS. 2006;114:440-8.
15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM та ін. Застосування вододілових алгоритмів до сегментації кластерних ядер. Цитометрія. 1997; 28: 289–97.
16. Лай Ю.К., Розін П.Л. Ефективний круговий порог. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992-1001.
17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Опитування щодо глибокого навчання аналізу медичних зображень. Med Image Anal. 2017;42:60-88.
18. Мадабхуші А, Лі Г. Аналіз зображення та машинне навчання в цифровій патології: проблеми та можливості. Med Image Anal. 2016;33:170–5.
19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Діагностична оцінка алгоритмів глибокого навчання для виявлення метастазів у лімфатичних вузлах у жінок з раком молочної залози. ДЖАМА. 2017;318:2199-210.
20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S та ін. Гістопатологічна оцінка ниркової тканини на основі глибокого навчання. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.
