Маркери якості Cistanches Herba на основі співвідношення спектру антиоксидантів і ефекту

Анотація: Мета: Створення методу дослідження маркерів якості (Q-маркерів) вCistanches Herba(CH) на основізв'язок спектр дії антиоксидантів, створюючи основу для вивчення його фармакологічних речовин і контролю якості. Методи. Рідинна хроматографія надвисокої ефективності (UPLC) була використана для встановлення профілів відбитків пальців для 10 партій CH. Модель окисного пошкодження клітини була створена з використанням H2O2, а антиоксидантна здатність CH була визначена на основі напівмаксимальної інгібуючої концентрації активних форм кисню, а також рівнівсупероксиддисмутазаікаталазаякфармакологічні показники. Співвідношення спектр-ефект було побудовано за допомогою аналізу головних компонентів, кореляційного аналізу Пірсона та регресійного аналізу часткових найменших квадратів. Theактивні компонентибули підданіфармакологічна валідація. 

Результати:Профілі відбитків пальців для CH були встановлені за допомогою UPLC, ідентифікуючи 17 спільних піків. На основі кореляційного аналізу спектр-ефект було відібрано дев'ять компонентів. Результати фармакологічної перевірки показали, що геніпозидова кислота, 8-епілоганова кислота,ехінакозид,актеозид, ізоактеозид, ітубулозід Авиявляли антиоксидантну активність залежно від концентрації.

Висновок: у цьому дослідженні досліджувалися Q-маркери для CH на основі співвідношення спектр-ефект, надаючи довідкову інформацію для основи його фармакологічної субстанції та покращення стандарту якості.

Ключові слова:Цистанш Трава; Q-маркер;зв'язок спектр-ефект; антиоксидантний

Cistanche deserticola — це висушене м’ясисте стебло з лускатим листям Cistanche deserticola YCMa або Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, рослини, що належить до сімейства Cistanche deserticola orbaceae. Він теплий за своєю природою, солодкий і солоний на смак; повертається до меридіанів нирок і товстого кишечника; він живить нирковий ян, відновлює есенцію та кров, зволожує кишечник і проносне, а також є важливим ліками для тонізування нирок і відновлює есенцію [2-3]. Нирки зберігають есенцію, а есенція і кров походять з одного джерела. Якщо є дефіцит есенції та крові, це вплине на загальну життєдіяльність людського організму; кістковий мозок, який виробляє есенцію, зберігається в кістках, а мозок — це море кісткового мозку. Якщо ниркової есенції недостатньо, кістки втратять своє живлення, а мозок буде дефіцитним, що призведе до дегенеративних змін кісток, таких як пухка структура, втрата зубів, втрата пам’яті, деменція та зниження імунної функції [4-6]. Cistanche deserticola містить фенілетаноїдні глікозиди, іридоїди, лігнани та інші структурні компоненти, включаючи ехінакозид, вербаскозид, вербаскозид, геніпінову кислоту та 8-епістріанову кислоту. , тубулін А тощо [7]. Поточний контроль якості Cistanche deserticola у виданні «Фармакопея Китайської Народної Республіки» 2020 року передбачає лише вміст ехінакозиду та вербаскозиду, що не може повністю відображати характеристики багатокомпонентної та багатоцільової дії традиційної китайської медицини. , що не сприяє контролю та оцінці його якості.

З метою підвищення рівня контролю якості традиційної китайської медицини та оптимізації оцінки якості традиційної китайської медицини академік Лю Чансяо запропонував нову концепцію маркера якості (Q-маркера) традиційної китайської медицини [8]. Серед них «ефективність» є ключовим елементом у «П’яти принципах» Q-маркера [9], а також є ядром оцінки якості традиційної китайської медицини.

З огляду на поточний статус досліджень поганої кореляції між стандартами якості та ефективністю ліків, вивчення Q-маркерів традиційної китайської медицини та встановлення більш наукових і обґрунтованих стандартів якості має велике значення для покращення якості традиційної китайської медицини. Співвідношення спектр-ефект пов’язує хроматографічні піки відбитків пальців традиційної китайської медицини з конкретними фармакодинамічними даними для пошуку ефективних речовин традиційної китайської медицини, таким чином відображаючи притаманну якість традиційної китайської медицини [10]. Встановлення математичної моделі спектральної ефективності може прояснити QMarker традиційної китайської медицини з точки зору «цілісного погляду», забезпечуючи більше посилань для подальшого контролю якості традиційної китайської медицини, формулювання стандартів якості та скринінгу активних інгредієнтів. У цьому дослідженні використовуються відбитки пальців у поєднанні зі швидкістю напівгальмування активних форм кисню (ROS IC50), вмістом супероксиддисмутази (SOD) і каталази (CAT) для вивчення зв’язку спектр-ефект традиційної китайської медицини та аналізу головних компонентів. (PCA) ), кореляційний аналіз Пірсона (PCC) і регресійний аналіз часткових найменших квадратів (PLS) для комплексного аналізу Q-маркера Cistanche deserticola, щоб забезпечити основу для контролю його якості.

1 матеріал

1.1 Зразок

Урожай Cistanche deserticola був зібраний в окрузі Юйтянь, Сіньцзян, і на посадочній базі належної сільськогосподарської практики (GAP) Cistanche deserticola у Внутрішній Монголії. Його ідентифікував дослідник Чжан Тіцзюнь з Тяньцзіньського фармацевтичного науково-дослідного інституту Co., Ltd. як Cistanche tubulosa (Schenk) Wight і Cistanche deserticola.

YC Ma, детальна інформація наведена в таблиці 1.

1.2 Тестовий препарат

Ехінацеазид (номер партії: 111670-201907, чистота: 91,8%) і вербаскозид (номер партії: 111530-201914, чистота: 95,2%) були придбані в Китайському інституті контролю за харчовими продуктами та ліками; ізорескозид (номер партії: 61303-13 -7), салідрозид (номер партії: 10338-51-9), 8-епістрихноєва кислота (номер партії: 82509-41-9), геніпінова кислота (номер партії: Z24A10X95926) , тубероза B (номер партії: 112516-04-08), 2-ацетилевгенол глікозид (номер партії: 94492-24-7) були придбані у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., чистота більше або дорівнює 98%; Глікозид A Cistanche (номер партії: MUST -20062806, чистота: 98,51%), флоридин A (номер партії: MUST19110102, чистота: 98,57%) були придбані у Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; хроматографічно чистий ацетонітрил і мурашину кислоту придбали у компанії Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Очищена вода (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Вітамін Е (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); диметилсульфоксид (DMSO, D2660-100ML, компанія Sigma, США); CellTiter 96® AQueous набір для виявлення проліферації клітин в одному розчині (G3580, компанія Promega, США); Виявлення CAT Набір (S0051), набір для виявлення активності SOD (S0101M) і набір для виявлення АФК (S0033S) були придбані у Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Інструменти

Надвисокоефективний рідинний хроматограф Waters H-class-PDA (компанія Waters, США); Ваги електронні Sartorius BT25S (компанія Sartorius, Німеччина); високошвидкісна настільна центрифуга H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Зчитувач мікропланшетів (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Біологічний мікроскоп WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 клітини

Клітини нирок людського ембріона Клітини НЕК 293 були використані в цьому експерименті та були придбані в банку клітин Китайської академії наук.

2 методи

2.1 Створення карти відбитків пальців

2.1.1 Приготування досліджуваного розчину: зважте 2 г лікарського матеріалу Cistanche deserticola, додайте 10-кратну кількість води, нагрійте та кип’ятіть 3 рази, 1 годину кожного разу, центрифугуйте при 1.0 ×105 об·хв-1 протягом 15 хв (радіус центрифугування становить 300 мм), об’єднайте надосадову рідину та сконцентруйте, щоб отримати вихідний розчин з масовою концентрацією 100 мг·мл-1, розведіть його в 10 разів, і фільтрують його через мікропористу фільтруючу мембрану 0,22 мкм, щоб отримати його.

2.1.2 Приготування змішаного розчину порівняння

Візьміть 8-епістрихнову кислоту, салідрозид, ехінацеазид, глікозид цистанхи А, геніпінову кислоту, вербаскозид, антоціанозид А, ізорбаскозид і 2'-ацетилевгенол. Еталонні речовини глікозиду та ангіозиду B вимірювали у відповідних кількостях і точно зважували. Додайте 50% розчин метанолу для розчинення та приготуйте змішаний розчин контрольної речовини з масовою концентрацією 20 мкг·мл–1.

2.1.3 Умови хроматографії

колонка ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм); рухома фаза - ацетонітрил (A) ~ 0.1% розчин мурашиної кислоти (B), програма градієнтного елюювання (0 ~ 6 хв, 5% ~ 8% A; 6 ~ 10 хв, 8% ~ 15% A 10~13 хв, 15%~19%A, 13~20 хв, 19%~25%A); довжина хвилі детектування 237 нм; швидкість потоку 0,4 мл·хв –1; температура колонки 40 градусів; об'єм ін'єкції 3 мкл.

2.1.4 Вибір опорного піку

На хроматограмі ультраефективної рідинної хроматографії (UPLC) Cistanche deserticola пік з найбільшим співвідношенням площі піку, помірним часом утримування та хорошим розділенням був обраний як еталонний пік спектру відбитків пальців. 2.1.5 Методологічне дослідження Тест на точність: Візьміть зразок Т1 і приготуйте тестовий розчин відповідно до методу, описаного в 2.1.1. Введіть зразок 6 разів безперервно та запишіть відбиток пальця. Результати показують, що відносна площа піку RSD кожного піку становить 0.10%~4.61%. , RSD відносного часу утримання становить 0,08%~1,32%, що вказує на хорошу точність приладу.

Випробування повторюваності: Візьміть зразок Т1 і приготуйте 6 зразків тестового розчину паралельно відповідно до методу, описаного в 2.1.1, і вводьте зразок безперервно. Результати показують, що відносна площа піку RSD кожного хроматографічного піку становить 1,35%~4,80%, а відносний час утримання RSD становить 0,10%~1,80%, що відповідає вимогам відбитків пальців і показує, що повторюваність інструменту добре.

Тест на стабільність: Візьміть зразок T1 і приготуйте тестовий розчин відповідно до методу, описаного в 2.1.1, введіть зразки для тестування через 0, 2, 4, 8 і 12 годин і запишіть відбиток пальця. Розраховане RSD відносної площі піку кожного хроматографічного піку становить 0,53%~4,82%, а RSD відносного часу утримання становить 0,09%~2,17%, що відповідає вимогам відбитка пальця та вказує на те, що досліджуваний продукт стабільний протягом 12 годин.

2.2 Дослідження антиоксидантної дії Cistanche deserticola

2.2.1 Приготування маточного розчину Cistanche deserticola:Матковий розчин за п. 2.1.1 відбирають, фільтрують і стерилізують, перед використанням розбавляють культуральним середовищем до необхідної концентрації.

2.2.2 Вплив Cistanche deserticola та позитивного контролю VE на життєздатність клітин HEK 293

Створіть звичайну групу (клітинна суспензія), групу введення Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 мкг·мл–1), групу VE (20, 40, 60, 80, 100 мкмоль·л–1), кожна Встановіть 6 дублікатів лунок при кожній концентрації та культурі протягом 24 годин. Додайте 20 мкл одноразового реагенту CellTiter 96® AQueous у кожну лунку, щоб визначити життєздатність клітин. Продовжуйте культивування протягом 2 годин. Використовуйте пристрій для зчитування мікропланшетів, щоб визначити значення абсорбції (OD) кожної лунки при 490 нм. Розрахувати виживаність клітин за формулою (1). Рівень виживання (%)=(ОП експериментальна група/ОП порожня група) × 100% (1)

2.2.3 Вплив Cistanche deserticola на АФК, індуковані H2O2 у клітинах HEK 293

Клітини розділяли на звичайну групу (суспензія клітин) і групу введення Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 мкг·мл–1 Cistanche deserticola та 60 мкм·л–1 H2O2) і культивували протягом 24 годин. Дотримуйтеся кроків набору для виявлення АФК для наступних операцій, безпосередньо спостерігайте за фарбуванням клітин через мікроскоп і використовуйте пристрій для зчитування мікропланшетів, щоб визначити інтенсивність флуоресценції кожної групи. Для налаштування параметрів використовувалася довжина хвилі збудження 488 нм і довжина хвилі випромінювання 525 нм. Експеримент повторювали тричі.

2.2.4 Вплив Cistanche deserticola на H2O2-індукований SOD клітин HEK 293

Розділіть клітини на звичайну групу (клітинна суспензія) і модельну групу

(60 мкм·л–1 H2O2), група VE (60 мкм·л–1 VE та 60 мкм·л–1 H2O2), група введення Cistanche deserticola (100 мкг·мл–1 Cistanche deserticola та 60 мкм·л–1 H2O2), зберіть клітини після 24 годин культивування, додайте розчин для підготовки зразків SOD для лізису клітин, центрифугуйте при 4 градусах, 12000 об/хв -1 протягом 5 хвилин (радіус центрифугування становить 300 мм), візьміть супернатант як зразок для перевірки, дотримуйтеся набору для виявлення SOD. Виконайте наведені нижче дії. Експеримент повторювали тричі.

2.2.5 Вплив Cistanche deserticola на CAT, індукований H2O2-, у клітинах HEK 293

Дотримуйтеся методу, описаного в 2.2.4, і введіть групу, додайте розчин для лізису, центрифугуйте при 4 градусах, 12000 об/хв -1 протягом 10 хвилин (радіус центрифуги становить 300 мм), візьміть супернатант і виконайте кроки Комплект виявлення CAT. Подальші операції. Експеримент повторювали тричі.

2.2.6 Статистичний аналіз

Для статистичного аналізу використовувалося програмне забезпечення SPSS 26.0. Кожна група даних була представлена ​​(±±(). Односторонній дисперсійний аналіз проводився на даних, які відповідали нормальному розподілу. Якщо дисперсії були рівними, використовувався метод найменшої значущої різниці. Якщо дисперсії були нерівномірними, для побудови графіків використовувався метод Dunnett T3, а P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Кореляційний аналіз спектру ефекту антиоксиданту Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Площі піків загальних піків 10 партій Cistanche deserticola, які мають встановлені відбитки пальців, були стандартизовані за значенням Z і створені в матрицю даних порядку 10 × 17, яку було імпортовано в програмне забезпечення SPSS 26.0 для PCA.

2.3.2 PCC Використовуйте SPSS 26.0 для проведення двовимірного аналізу для вивчення співвідношення спектральної ефективності між відбитками пальців Cistanche deserticola та антиоксидантами.

Тестування значущості використовує двосторонній тест (T) з P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Імпортуйте експериментальні результати стандартизованої площі піку Cistanche deserticola та антиоксиданту в програмне забезпечення SIMCA-P 14.1, встановіть площу піку як змінну X і встановіть фармакодинамічний індекс як змінну Y для виконання PLS.

2.4 Перевірка антиоксидантної активності Q-маркера Cistanche deserticola

2.4.1 Приготування діючої речовини маточного розчину

Точно зважте відповідну кількість геніпінової кислоти, 8-епістрихнієвої кислоти, ехінацеазиду, вербаскозиду, ізоребаскозиду та антоціанозиду А та додайте ДМСО, щоб розчинити їх у 10 ммоль·л–1 для контролю. розчин продукту.

2.4.2 Вплив активних інгредієнтів на цитотоксичність HEK 293

Після інкубації клітин HEK 293 протягом 24 годин додають 100 мкл розчинів активних інгредієнтів за пунктом 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 мкмоль·л–1) до кожної лунки додавали різні концентрації, і стимуляцію продовжували. Реагент CellTiter 96® AQueous з одноразовим розчином додавали до клітин через 24 години для визначення життєздатності клітин.

2.4.3 Антиоксидантна дія активних інгредієнтів на клітини НЕК 293, індуковані H2O2-

Клітини були згруповані таким чином: нормальна група, модельна група, група VE були згруповані, як у 2.2.4, експериментальна група (0.781, 1,563, 3,125 мкм·л–1 активного інгредієнта та 60 мкм·л–1 H2O2), культивували протягом 24 год. Визначити внутрішньоклітинні рівні АФК, вміст ферментів СОД і КАТ відповідно до методів 2.2.3, 2.2.4 і 2.2.5 відповідно.

Служба підтримки Wecistanche

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop