Маркери якості Cistanches Herba на основі співвідношення спектру антиоксидантів і ефекту

Анотація

Мета: Створення методу дослідження маркерів якості (Q-маркерів) зCistanches Herba(CH) на основізв'язок спектр дії антиоксидантів, створюючи основу для вивчення його фармакологічних речовин і контролю якості. Методи. Рідинна хроматографія надвисокої ефективності (UPLC) була використана для встановлення профілів відбитків пальців для 10 партій CH. Модель окислювального пошкодження клітин була створена з використанням H2O2, а антиоксидантна здатність CH була визначена на основі напівмаксимальної інгібуючої концентрації активних форм кисню, а також рівнів супероксиддисмутази та каталази як фармакологічних індикаторів. Співвідношення спектр-ефект було побудовано за допомогою аналізу головних компонентів, кореляційного аналізу Пірсона та регресійного аналізу часткових найменших квадратів. Активні компоненти були піддані фармакологічній перевірці. Результати: Профілі відбитків пальців для CH були встановлені за допомогою UPLC, ідентифікуючи 17 спільних піків. На основі кореляційного аналізу спектр-ефект було відібрано дев'ять компонентів. Результати фармакологічної перевірки показали, що геніпозидова кислота, 8-епілоганова кислота,ехінакозид, актеозид,ізоактеозид, ітубулозід Авиявляли антиоксидантну активність залежно від концентрації. Висновок: у цьому дослідженні досліджувалися Q-маркери для ХГ на основі співвідношення спектр-ефект, надаючи довідкову інформацію для основи його фармакологічної субстанції та покращення стандарту якості.

Ключові слова:Cistanches Herba; Q-маркер;зв'язок спектр-ефект; антиоксидант

ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 30% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 12% АКТЕОЗИДУ ДЛЯ ФУНКЦІЇ НИРОК

Цистанхеце висушене м’ясисте стебло з лускатим листям Cistanche deserticola YCMa або Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, рослини, що належить до роду Cistanche сімейства Orobanchiaceae. Вперше він був зареєстрований у «Shen Nong's Materia Medica» і зазначений як найвищий сорт [1]. Він теплий за своєю природою, солодкий і солоний на смак; повертається до меридіанів нирок і товстого кишечника; він живить нирковий ян, відновлює есенцію та кров, зволожує кишечник і проносне, а також є важливим ліками для тонізування нирок і відновлює есенцію [2-3]. Нирки зберігають есенцію, а есенція і кров походять з одного джерела. Якщо є дефіцит есенції та крові, це вплине на загальну життєдіяльність людського організму; кістковий мозок, який виробляє есенцію, зберігається в кістках, а мозок — це море кісткового мозку. Якщо ниркової есенції недостатньо, кістки втратять своє живлення, а мозок буде дефіцитним, що призведе до дегенеративних змін кісток, таких як пухка структура, втрата зубів, втрата пам’яті, деменція та зниження імунної функції [4-6]. Cistanche deserticola містить глікозиди фенілетанолу, іридоїди, лігнани та інші структурні компоненти, включаючи ехінацеазид, вербаскозид, ізорбаскозид, геніпінову кислоту та 8-епістріанову кислоту. , тубулін А тощо [7]. Поточний контроль якості Cistanche deserticola у виданні «Фармакопея Китайської Народної Республіки» 2020 року передбачає лише вміст ехінацеазиду та вербаскозиду, що не може повністю відображати характеристики багатокомпонентної та багатоцільової дії традиційної китайської медицини. , що не сприяє контролю та оцінці його якості.

З метою підвищення рівня контролю якості традиційної китайської медицини та оптимізації оцінки якості традиційної китайської медицини академік Лю Чансяо запропонував нову концепцію маркера якості (Q-маркера) традиційної китайської медицини [8]. Серед них «ефективність» є ключовим елементом у «П’яти принципах» Q-маркера [9], а також є ядром оцінки якості традиційної китайської медицини.

З огляду на поточний статус досліджень поганої кореляції між стандартами якості та ефективністю ліків, вивчення Q-маркерів традиційної китайської медицини та встановлення більш наукових і обґрунтованих стандартів якості має велике значення для покращення якості традиційної китайської медицини. Співвідношення спектр-ефект полягає в тому, щоб зв’язати хроматографічні піки відбитків пальців традиційної китайської медицини з конкретними фармакодинамічними даними, щоб знайти ефективні речовини традиційної китайської медицини, таким чином відображаючи притаманну якість традиційної китайської медицини [10]. Встановлення математичної моделі спектральної ефективності може прояснити QMarker традиційної китайської медицини з точки зору «цілісного погляду», забезпечуючи більше посилань для подальшого контролю якості традиційної китайської медицини, формулювання стандартів якості та перевірки активних інгредієнтів. У цьому дослідженні використовуються відбитки пальців у поєднанні зі швидкістю напівгальмування активних форм кисню (ROS IC50), вмістом супероксиддисмутази (SOD) і каталази (CAT) для вивчення зв’язку спектр-ефект традиційної китайської медицини та аналізу головних компонентів. (PCA) ), кореляційний аналіз Пірсона (PCC) і регресійний аналіз часткових найменших квадратів (PLS) для комплексного аналізу Q-маркера Cistanche deserticola, щоб забезпечити основу для контролю його якості.

1 матеріал

1.1 Зразок

Cistanche deserticolaбув зібраний у повіті Юйтянь, Сіньцзян та на базі посадки Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) у Внутрішній Монголії. Дослідник Чжан Тіцзюнь з Тяньцзіньського фармацевтичного науково-дослідного інституту виявив його як Cistanche tubulosa (Schenk) Wight і Cistanche deserticola.

YC Ma, детальна інформація наведена в таблиці 1.

1.2 Тестовий препарат

Ехінацеазид (номер партії: 111670-201907, чистота: 91,8%) і вербаскозид (номер партії: 111530-201914, чистота: 95,2%) були придбані в Китайському інституті контролю за харчовими продуктами та ліками; ізорескозид (номер партії: 61303-13 -7), салідрозид (номер партії: 10338-51-9), 8-епістрихноєва кислота (номер партії: 82509-41-9), геніпінова кислота (номер партії: Z24A10X95926) , туберозин B (номер партії: 112516-04-08), 2-ацетилевгенол глікозид (номер партії: 94492-24-7) були придбані у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., чистота більше або дорівнює 98%; Глікозид A Cistanche (номер партії: MUST -20062806, чистота: 98,51%) і васкулін A (номер партії: MUST19110102, чистота: 98,57%) були придбані у Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; хроматографічно чистий ацетонітрил і мурашину кислоту придбали у компанії Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Очищена вода (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Вітамін Е (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

Диметилсульфоксид (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, США); CellTiter 96® AQueous набір для виявлення проліферації клітин в одному розчині (G3580, Promega Company, США); Набір для виявлення CAT (S0051), набір для виявлення активності SOD S0101M) і набір для виявлення АФК (S0033S) були придбані у Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Інструменти

Надвисокоефективний рідинний хроматограф Waters H-class-PDA (компанія Waters, США); Ваги електронні Sartorius BT25S (компанія Sartorius, Німеччина); високошвидкісна настільна центрифуга H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Зчитувач мікропланшетів (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Біологічний мікроскоп WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 клітини

Клітини нирок ембріона людини Клітини HEK 293 використовувалися в цьому експерименті і були придбані в банку клітин Китайської академії наук.

2 методи

2.1 Створення карти відбитків пальців

2.1.1 Приготування досліджуваного розчину: зважте 2 г лікарського матеріалу Cistanche deserticola, додайте 10-кратну кількість води, нагрійте та кип’ятіть 3 рази, 1 годину кожного разу, центрифугуйте при 1.0 ×105 об·хв-1 протягом 15 хв (радіус центрифугування становить 300 мм), об’єднайте надосадову рідину та сконцентруйте, щоб отримати вихідний розчин з масовою концентрацією 100 мг·мл-1, розведіть його в 10 разів, і фільтрують його через мікропористу фільтруючу мембрану 0,22 мкм, щоб отримати його.

2.1.2 Приготування змішаного розчину порівняння

Візьміть 8-епістрихнову кислоту, салідрозид, ехінацеазид, глікозид цистанхи А, геніпінову кислоту, вербаскозид, антоціанозид А, ізорбаскозид і 2'-ацетилевгенол. Глікозид і ангіозид B еталонну речовину вимірювали у відповідних кількостях і точно зважували. Додайте 50% розчин метанолу для розчинення та приготуйте змішаний розчин контрольної речовини з масовою концентрацією 20 мкг·мл–1.

2.1.3 Умови хроматографії

колонка ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм); рухомою фазою є ацетонітрил (A) ~ 0.1% розчин мурашиної кислоти (B), програма градієнтного елюювання (0 ~ 6 хв, 5% ~ 8% A ; 6 ~ 10 хв, 8% ~ 15% A 10~13 хв, 15%~19%A, 13~20 хв, 19%~25%A); довжина хвилі детектування 237 нм; швидкість потоку 0,4 мл·хв –1; температура колонки 40 градусів; об'єм ін'єкції 3 мкл.

2.1.4 Вибір опорного піку

На хроматограмі ультраефективної рідинної хроматографії (UPLC) Cistanche deserticola пік з найбільшим співвідношенням площі піку, помірним часом утримування та хорошим розділенням був обраний як контрольний пік спектру відбитків пальців.

2.1.5 Методичний огляд

Тест на точність: Візьміть зразок Т1 і приготуйте тестовий розчин відповідно до методу, описаного в 2.1.1. Введіть зразок 6 разів безперервно та запишіть відбиток пальця. Результати показують, що відносна площа піку RSD кожного піку становить 0.10%~4.61%, а відносний час утримування RSD It становить 0.08%~1.32%, що вказує на те, що прилад має хороші показники. точність.

Випробування повторюваності: Візьміть зразок Т1 і приготуйте 6 зразків тестового розчину паралельно відповідно до методу, описаного в 2.1.1, і вводьте зразок безперервно. Результати показують, що відносна площа піку RSD кожного хроматографічного піку становить 1,35%~4,80%, а відносний час утримання RSD становить 0,10%~1,80%, що відповідає вимогам відбитків пальців і показує, що повторюваність інструменту добре.

Тест на стабільність: Візьміть зразок T1 і приготуйте тестовий розчин відповідно до методу, описаного в 2.1.1, введіть зразки для тестування через 0, 2, 4, 8 і 12 годин і запишіть відбиток пальця. Розраховане RSD відносної площі піку кожного хроматографічного піку становить 0,53%~4,82%, а RSD відносного часу утримання становить 0,09%~2,17%, що відповідає вимогам відбитка пальця та вказує на те, що досліджуваний продукт стабільний протягом 12 годин.

2.2 Дослідження антиоксидантної дії Cistanche deserticola

2.2.1 Приготування маточного розчину Cistanche deserticola

Матковий розчин за п. 2.1.1 відбирають, фільтрують і стерилізують, а перед використанням розбавляють культуральним середовищем до необхідної концентрації.

2.2.2 Cistanche deserticola та позитивний контроль

Вплив VE на життєздатність клітин HEK 293 був встановлений як звичайна група (клітинна суспензія), група введення Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 мкг·мл–1), група VE (20, 40, 60). , 80, 100 мкмоль·л–1), встановіть 6 дублікатів лунок для кожної концентрації, культивуйте протягом 24 годин, додайте 20 мкл одноразового реагенту CellTiter 96® AQueous до кожної лунки для визначення життєздатності клітин, продовжуйте культивувати протягом 2 годин, і використовуйте пристрій для зчитування мікропланшетів, щоб виявити життєздатність клітин при 490 нм. Значення абсорбції (ОП) кожної лунки використовували для розрахунку рівня виживання клітин згідно з формулою (1). Рівень виживання (%)=(ОП експериментальна група/ОП порожня група) × 100% (1)

2.2.3 Cistanche deserticola на індукцію H2O2

Вплив ROS на клітини HEK 293. Клітини поділяли на звичайну групу (суспензія клітин) і групу введення Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 мкг·мл–1 Cistanche deserticola та 60 мкм·л–1 H2O2) і культивували 24 години. Дотримуйтеся кроків набору для виявлення АФК для наступних операцій, безпосередньо спостерігайте за фарбуванням клітин через мікроскоп і використовуйте пристрій для зчитування мікропланшетів, щоб визначити інтенсивність флуоресценції кожної групи. Для налаштування параметрів використовувалася довжина хвилі збудження 488 нм і довжина хвилі випромінювання 525 нм. Експеримент повторювали тричі.

2.2.4 Cistanche deserticola пара

Вплив H2O2 на SOD в клітинах HEK 293. Клітини були розділені на нормальні групи (суспензія клітин), модельну групу (60 мкм·л–1 H2O2), групу VE (60 мкм·л–1 VE та 60 мкм·л–1 H2O2), групу введення Cistanche deserticola (100 мкг·мл–1 Cistanche deserticola та 60 мкм·л–1 H2O2), зберіть клітини після 24 год культивування, додайте розчин для підготовки зразків SOD для лізису клітин і центрифугуйте при 4 градусах і 12000 об·хв{{22} } min (радіус центрифугування становить 300 мм), візьміть супернатант як зразок для тестування та виконайте кроки набору для виявлення SOD для наступних операцій. Експеримент повторювали тричі.

2.2.5 Cistanche deserticola на індукцію H2O2

Вплив CAT на клітини HEK 293 обробляли відповідно до методу в 2.2.4 і групували в групи. Після обробки додайте розчин для лізису, відцентрифугуйте при 4 градусах і 12000 об/хв -1 протягом 10 хвилин (радіус відцентрового ураження становить 300 мм), візьміть супернатант і дотримуйтеся кроків, наведених у наборі для виявлення CAT для наступних операцій . Експеримент повторювали тричі.

2.2.6 Статистичний аналіз

Для статистичного аналізу використовувалося програмне забезпечення SPSS 26.0. Кожна група даних була представлена ​​(±±(). Односторонній аналіз дисперсії проводився на даних, які відповідали нормальному розподілу. Якщо дисперсії були рівними, використовувався метод найменшої значущої різниці. Якщо дисперсії були нерівномірно, для побудови графіків використовувався метод Dunnett T3, а P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Кореляційний аналіз спектру ефекту антиоксиданту Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Площі піків загальних піків 10 партій Cistanche deserticola, які мають встановлені відбитки пальців, були нормалізовані за значенням Z і створені в матрицю даних порядку 10×17, яку було імпортовано в програмне забезпечення SPSS 26.0 для PCA.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 використовувався для проведення двофакторного аналізу для вивчення співвідношення спектральної ефективності між відбитками пальців Cistanche deserticola та антиоксидантами. Перевірку значущості проводили за допомогою двостороннього тесту (T), з P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Імпортуйте експериментальні результати стандартизованої площі піку Cistanche deserticola та антиоксиданту в програмне забезпечення SIMCA-P 14.1, встановіть площу піку як змінну X і встановіть фармакодинамічний індекс як змінну Y для виконання PLS.

2.4 Перевірка антиоксидантної активності Q-маркера Cistanche deserticola

2.4.1 Приготування маточного розчину діючих речовин. Точно зважте відповідну кількість геніпінової кислоти, 8-епістрихнової кислоти, ехінацеазиду, вербаскозиду, ізоребаскозиду та антоціанозиду А та додайте ДМСО, щоб розчинити їх у 10 ммоль·л-1 розчину порівняння.

2.4.2 Вплив активних інгредієнтів на цитотоксичність HEK 293.

Після інкубації клітин HEK 293 протягом 24 годин додайте до кожної лунки різні концентрації розчинів активних інгредієнтів згідно з 2.4.1 (0.781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 мкмоль·л–1 ) 100 мкл, безперервна стимуляція

Після інкубації клітин протягом 24 годин додавали реагент CellTiter 96® AQueous з одноразовим розчином для визначення життєздатності клітин.

2.4.3 Антиоксидантна руйнівна дія активних інгредієнтів на клітини HEK 293, індуковані H2O2-.

Комірки згруповані таким чином: нормальна група, модельна група та група VE згруповані відповідно до 2.2.4. Експериментальна група (0.781, 1.563, склад активності 3.125 мкм·л–1 і 60 мкм·л–1 H2O2), культивували протягом 24 год. Визначте внутрішньоклітинні рівні АФК, вміст ферментів СОД та КАТ відповідно до методів 2.2.3, 2.2.4 та 2.2.5 відповідно.

Служба підтримки Wecistanche

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop