Захисний ефект ресвератролу на ниркову недостатність, спричинену акриламідом
Feb 23, 2022
фон: Акриламід (ACR) має широкий спектр використання. Він має aпорушення функції нирокефект. Робота була спрямована на вивчення можливої захисної ролі ресвератролу (RVS) над ACR-опосередкованимпорушення функції нироку щурів. Було досліджено запропоновані механізми, що лежать в основі такого захисту.Матеріали та методи:Тридцять дорослих щурів-альбіносів Sprague-Dawley розділили на три групи: контроль, ACR і RVS. Через 4 тижніниркавидаляли та готували до гістологічного, імуногістохімічного та біохімічного досліджень. Оцінювали активність тканинних окислювальних (малоновий діальдегід [MDA]) та антиоксидантних (глутатіон [GSH]) маркерів.Результати:Індукований акриламідом клубочковийнирковийураження у вигляді зморщування і викривлення клубочків зі зморщуванням їх базальних мембран і розширенням сечових проміжків. Дегенеративні зміни канальців помітно були присутні в проксимальних звивистих канальцях. Некротичні тубулярні клітини демонстрували цитоплазматичну вакуолізацію з десквамованими епітеліальними клітинами всередині канальцевого просвіту. ACR збільшує відкладення колагенових волокон у базальній мембрані клубочкових капілярів і індукує потовщення базальних мембраннирковийкорпускул інирковийтрубочки. Адміністрація RVS забезпечує високий захистнирка. Клубочки інирковийканальці були майже нормальними. Вміст колагенових волокон і періодична кислотна реакція Шиффа базальної мембранинирковийканальці були на 70 відсотків і на 19 відсотків нижче, пов’язані з групою ACR. Рівні креатиніну та сечовини знизилися на 51 і 47 відсотків. RVS викликав таку захисну роль завдяки своєму антиоксидантному ефекту, оскільки рівень MDA знизився на 45 відсотків, а рівень GSH збільшився на 83 відсотки порівняно з групою ACR. Висновки: акриламід викликає структурні та функціональні порушеннянирка.Це спонукаєниркапошкодження через окислювальний стрес і апоптоз. З використанням РВС нормальнониркаархітектура збереглася з незначними конструктивними змінами. Додаткова, функціональнаниркатест став нормальним. RVS здійснює свій захисний ефект завдяки своїм антиапоптичним та антиоксидантним властивостям. (Folia Morphol 2021; 80, 4: 985–993).
ВСТУПАкриламід (ACR) є добре відомим забруднювачем навколишнього середовища, який справляє ряд системних токсичних ефектів на людей як після професійного, так і харчового впливу [2, 22]. Він має різноманітні шкідливі властивості: канцерогенність, генотоксичність, нейротоксичність, репродуктивну токсичність [5, 7]. ACR та його аналоги широко використовуються в різних хімічних та екологічних сферах і одержуються шляхом нагрівання біологічного матеріалу рослинного походження [25]. Утворення ACR відбувається під час обробки їжі внаслідок впливу на вуглеводи температури вище 200 градусів [12]. Високі рівні ACR були виявлені, зокрема, у харчових продуктах, які зазвичай споживаються; картопляні чіпси та хліб [31].
Акриламід всмоктується з шлунково-кишкового тракту і широко розсіюється в рідинах організму та зберігається в печінці танирка[28]. Відомо, що ACR викликає структурні та функціональні зміни в багатьох органах. Theнирковийтубулярні клітини зазнають дегенеративних вакуолярних змін, запальної клітинної інфільтрації та перигломерулярного набряку [28]. Крім того, введення ACR щурам підвищує рівні сечовини, креатиніну, сечової кислоти танирковийпрозапальний цитокін [1]. Метаболізм ACR викликає вивільнення вільних радикалів (ROS), що ініціює окислювальний стрес, що призводить до дисбалансу в розвитку та деградації ROS [19]. Він також викликає перекисне окислення ліпідів і пошкодження ДНК [1].
Вплив багатьох антиоксидантів і протизапальних сполук, таких як оливкова олія, вітамін Е та 5-аміносаліцилова кислота, вивчався для запобігання та лікування індукованого ACRпорушення функції нирок[9, 19]. Ресвератрол (RVS) є фітоалексином, що міститься принаймні в72 види рослин, багато з яких вживаються людиною в їжу, зокрема шовковиця, арахіс, виноград [8]. RVS має протизапальну, антитромбоцитарну, антиоксидантну та антиканцерогенну дію, а також здатність зменшуватиураження нироквикликані хімічними сполуками [8, 10]. Однак незрозуміло, чи може RVS захистити від ACR-індукованогопорушення функції нирокчи ні. Тому ми вивчали окислювальну та апоптотичну пошкоджувальну дію ACR наниркаі досліджував захисну роль RVS над такимипорушення функції нироку щурів.
Ключові слова:ресвератрол, акриламід, нирки, нирки, ниркова недостатність
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
ТвариниУ наше дослідження було включено 30 дорослих щурів-альбіносів Sprague-Dawley вагою 170–200 г. Тварин утримували у просторих сітчастих клітках у спеціальному приміщенні з прямим денним світлом та природною вентиляцією. Щури мали вільний доступ до стандартної їжі для щурів і води. Усіх тварин лікували відповідно до стандартних інструкцій щодо догляду та використання лабораторних тварин. Дослідження було дозволено Комітетом з етики медичного факультету Каїрського університету, Єгипет.Дотримувані процедури відповідали етичним стандартам відповідальної організації та Гельсінкській декларації 1975 року, переглянутій у 1983 році.
Експериментальний дизайнЩурів розподілили на три групи (по 10 у кожній групі): контроль (давали дистильовану воду в дозі 1 мл), групу ACR і групу RVS (супутнє ACR плюс RVS).
ХімікаліїАкриламід отримували в контейнері з порошком фірми Biostain (Великобританія) масою 500 г. Його розчиняли в дистильованій воді в концентрації 10 г/л. Його вводили в дозі 1 мл дистильованої води, що містить 40 мг/кг/добу перорально через шлунковий зонд [9]. Ресвератрол (чистота > 99 відсотків) був придбаний у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Миссурі, США). Його розчиняли в диметилсульфоксиді і розводили в 0,9% фізіологічному розчині. Його вводили в добовій дозі 20 мг/кг/добу перорально через шлунковий зонд [18]. До кінця експерименту (через 4 тижні) кожну тварину зважували і брали зразок крові з хвостової вени за допомогою тонкої гепаринізованої капілярної трубки. Theниркаекстрагували, промивали сольовим розчином і залишали сушитися на папері.
Світлове мікроскопічне дослідженнянирказразки фіксували в 10% формаліні, зневоднювали в етиловому спирті, очищали в ксилолі і заливали в парафіновий віск. Зрізи товщиною 5 мкм вирізали та монтували на предметне скло. Інші зрізи були встановлені на позитивно заряджених предметних стеклах для імуногістохімії. Зрізи піддавали наступному: — гематоксиліну та еозину (H&E) і зрізи, пофарбовані трихромом за Массоном, готували відповідно до Suvarna et al. [24]; — гістохімічна оцінка: фарбування періодичною кислотою Шиффа (PAS): зрізи, пофарбовані PAS, готували відповідно до Suvarna et al. [24]; імуногістохімічний аналіз Bcl-2-асоційованого X білка (BAX) [20]. Готували парафінові зрізи. Потім до зрізів додавали відповідну кількість сироватки на 30 хв. Ендогенну пероксидазу інактивували метанольним розчином, що містить H2O2 (1:50) протягом 10 хвилин і промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином (PBS). Зрізи тканини блокували 1,5% сироваткою протягом 30 хв. Зрізи інкубували з первинним антитілом Bax (протеїн BAX людини, DakoCytomation, Данія), а потім вторинним антитілом (універсальне біотинільоване посилання з комерційного набору LSAB: DakoCytomation, Данія). Згодом зразки інкубували з ферментами АВ протягом 30 хвилин і промивали в PBS. Позитивні сигнали виявляли за допомогою пероксидазних хромогенних субстратів. Негативний контроль містив PBS замість вторинного антитіла.
Аналіз зображення та морфометричні вимірюванняЗа допомогою комп’ютерної системи аналізатора зображень Leica LAS V3.8 (Швейцарія) було оцінено наступні параметри: діаметринирковийклубочків і проксимальних звивистих канальців, ширнирковийпростору, а також висоту вистилання проксимального канальцевого епітелію. Крім того, кількість структурно змінених клубочків оцінювали у відсотках від загальної кількості клубочків. Також оцінювали вміст колагенових волокон. У гістологічних зрізах, забарвлених PAS, додатково визначали оптичну щільність базальної мембрани проксимальних звивистих канальців і пристінкових шарів капсул Боумена. У зоні імуногістохімічного фарбування BCL2 також вимірювали відсоток імунної реакції.
Біохімічне дослідженняЗразки крові, взяті у щурів перед умертвінням, використовували для біохімічної оцінки на кафедрі біохімії та молекулярної біології медичного факультету Каїрського університету, Єгипет.
Рівні сечовини і креатиніну в сироватці кровібули оцінені звичайним колориметричним методом з використанням наборів для аналізу Quanti Chrom TM (DIUR-500 і DICT-500), заснованих на вдосконалених методах Юнга та Яффе відповідно [32]. Середні значення цих біохімічних параметрів були розраховані та піддані статистичному аналізу.
Тканинний рівень малонового діальдегіду (MDA) і відновленого глутатіону (GSH).Theнирковийтканину гомогенізували в 5–10 мл холодного буфера (50 мМ фосфату калію, pH 7,5, 1 мМ EDTA) на грам тканини, потім центрифугували при 100,000 g протягом 15 хвилин при 4 градусах. Супернатант видаляли для аналізу та зберігали на льоду. Аналіз малонового діальдегіду проводили з тестом на тіобарбітурову кислоту (ТБК) у надосадовій рідині згідно з методом, запропонованим Buege та Aust [4].MDA реагує з TBA, утворюючи сполуку червоного кольору, яка поглинає при 535 нм. Вимірювання GSH ґрунтувалося на відновленні 5,5-дитіобісу (2-нітробензойної кислоти) (DTNB) відновленим GSH з утворенням жовтої сполуки [6].
Статистичний аналізСередні значення віднниркавагу, гістоморфометричні вимірювання та біохімічні рівні аналізували за допомогою SPSS версії 22. Статистичну оцінку проводили за допомогою дисперсійного аналізу з подальшим попарним порівнянням Бонферроні.
РЕЗУЛЬТАТИ
Світлова мікроскопічна оцінкаОбстеження контрольної групи показало непорушену архітектурунирковийкора. Theнирковийкора утворена знирковийтільця, а також проксимальні та дистальні звивисті канальці (рис. 1A). Експертиза внирковийкори групи ACR виявлені виражені структурні зміни. Theнирковийклубочки показали помірне або виражене зменшення, викривлення, сегментацію та вакуолізацію з розширенням сечових проміжків. Theнирковийканальці були розширені з помітним зменшенням висоти їх епітелію та розширенням їхнього просвіту. У клітинах, що вистилають їх, у багатьох звивистих канальцях спостерігалося цитоплазматичне вакуолізація, клітинна фрагментація та внутрішньопросвітне утворення зліпків. Інтерстицій демонстрував застійні кровоносні судини з потовщенням інтими та масивну клітинну інфільтрацію (рис. 1B–D). При обстеженні групи RVS виявлено майже нормальний вигляд більшості клубочків і канальців. Була виявлена мінімальна інтерстиціальна запальна клітинна інфільтрація (рис. 1E).
Вміст колагенових волоконУ контрольній групі вміст волокон був мінімальним. Вміст збільшився навколо пристінкових шарів капсул Боумена та базальних мембраннирковийканальців у групах ACR (9-fold) і RVS (2-fold) у зв’язку з контрольною групою. Вміст у групі RVS був на 70 відсотків нижчим порівняно з групою ACR (рис. 2A–C, таблиця 1).
Гістохімія ниркиУ контрольній групі базальні мембранинирковийканальців і пристінкових шарів капсул Боумена продемонстрували слабку PAS-реакцію. Додавши, апікальні межі кисті проксимально звивисті
канальці (PCT) були інтактними та частково закривали просвіт канальців (рис. 3A). Базальні мембранинирковийканальців і пристінкових шарів капсул Боумена групи ACR показали інтенсивну реакцію PAS (на 42 відсотки вище, ніж у контрольній групі). Крім того, апікальні межі щітки PCT були послаблені (рис. 3B). З використанням RVS реакція PAS стала порівнянною з контрольною групою та була на 19 відсотків нижчою, ніж у групі ACR (рис. 3C, таблиця 1).
Імуногістохімічне фарбування BAXBAX показав слабку реакцію в контрольній групі (рис. 4A). Відсоток площі імунопозитивних клітин BAX зріс у 45-рази в групі ACR і в контрольній групі (рис. 4B, C, таблиця 1). З використанням RVS відсоток площі імунопозитивних клітин зменшився на 56 відсотків порівняно з групою ACR; однак відсоток площі в групі RVS був у 14-раз більше, ніж у контрольній групі (рис. 4D, таблиця 1).
Біохімічні та окислювально-антиоксидантні маркериРівні сироваткового креатиніну та сечовини зросли в групі ACR у 275-рази, 1.9-рази порівняно з контрольною групою. При одночасному застосуванні RVS рівні креатиніну та сечовини знизилися на 51 відсоток, на 47 відсотків у зв’язку з ACR. Тим не менш, рівні креатиніну та сечовини в групі RVS були на 83 відсотки, що на 55 відсотків вище, ніж у контрольній групі (таблиця 1).
Значення окислювального маркера (MDA) у групі ACR зросли в 14-раз, а антиоксидантного маркера (GSH) знизилися в 13-раз порівняно з контрольною групою. З використанням RVS рівень MDA знизився на 45 відсотків, тоді як рівень GSH збільшився на 83 відсотки порівняно з групою ACR. Проте рівень обох маркерів був далеко від контрольної групи (табл. 1).
Морфометричні гломерулярні та ПХТ зміниВідсоток уражених клубочків у групі ACR зріс у 8.8-разів порівняно з контрольною групою. З використанням RVS відсоток уражених клубочків зменшився на 71 відсоток, що дорівнюєгрупа ACR; однак відсоток у групі RVS був у 1.6-раз більше, ніж у контрольній групі (Таблиця 2).
У групі ACR діаметр клубочків зменшився на 58 відсотків із збільшенням ширини сечового простору в 2 рази, що відповідає контрольній групі. З використанням RVS діаметр клубочків збільшився в 126-раз зі зменшенням ширини сечового простору на 57 відсотків, що прирівнювалося до групи ACR. Діаметр клубочків і ширина сечового простору в RVS і контрольній групах були однаковими (табл. 2). У групі ACR діаметр PCT збільшився на 31 відсоток, тоді як висота їх підкладки epiвміст телію знизився на 62 відсотки порівняно з контрольною групою. З використанням RVS діаметр PCT зменшився на 18 відсотків, тоді як висота їх вистилаючого епітелію збільшилася в 14-рази порівняно з групою ACR. Обидва параметри були порівнянними в RVS і контрольній групах (табл. 2).
ДИСКУСІЯІндукований акриламідом клубочковийнирковийураження у вигляді зморщування і викривлення клубочків зі зморщуванням їх базальних мембран і розширенням сечових проміжків. Крім того, дегенеративні зміни канальців були помітно присутні в PCT. Некротичні тубулярні клітини демонстрували цитоплазматичну вакуолізацію з десквамованими епітеліальними клітинами всередині канальцевого просвіту. Крім того, ACR індукував масивну запальну клітинну інфільтрацію з перевантаженням клубочкових кровоносних судин. Індукований акриламідом фіброз, який було встановлено 9-кратним збільшенням відкладення колагенових волокон у базальній мембрані клубочкових капілярів. Такі колагенові волокна можуть бути результатом дії епідермального фактора росту, який стимулює проліферацію фібробластів і синтез колагену [14].Базальні мембранинирковийкорпускул інирковийканальців групи ACR показали інтенсивну реакцію PAS (на 42 відсотки вище, ніж у контрольній групі). Потовщення базальної мембрани канальців є загальною ознакою атрофії та може бути пов’язане з гіалінозом [14]. Потовщення також є можливою причиною зниження активного транспорту в PCT, що викликає мікроальбумінурію [14].
Щіткова межа PCT у групі ACR була перервана. Втрата щіткової кайми є найбільш ранньою морфологічною ознакою порушення функції проксимальних канальців [17, 27]. Крім того, втрата щіткової кайми впливає на реабсорбційну здатність ПХТ із втратою глюкози, солей і великої кількості води з сечею [17, 27]. Це в основному пояснює спостережувані серологічні зміни (підвищені рівні сечовини та креатиніну в сироватці крові). Діаметр PCT збільшився на 31 відсоток у групі ACR, що в основному є компенсаторним механізмом для збереженняфункції нирок [15].
Окислювальний стрес є основним патогенним механізмом, через який індукується ACRураження нирок. Окислювальний стрес – це зсув балансу між оксидантами та антиоксидантами на користь оксидантів [3]. Багато дослідників довели роль ACR в окислювальному стресінирка[23]. Значення окислювального маркера (MDA) у групі ACR зросли в 14-раз, а антиоксидантного маркера (GSH) знизилися в 13-раз. Окислювальний стрес створює вільний радикал кисню (АФК), який реагує з численними біомолекулами в клітині, що зрештою призводить до окисного пошкодження [16]. АФК очищаються декількома клітинними захисними механізмами, що включають неферментативні (GSH). Білки пероксидази GSH перетворюють перекис водню на воду та ліпідипероксидів до відповідних спиртів [30]. Тривале застосування ACR знижувало активність GSH. Це наслідок у збільшеному виробництві O2– і H2O2, що призводить до виробництва OH– [11]. Багато дослідників вважали, що рівень MDA є достатнім доказом оксидативного стресу [13], а більш високе значення MDA виявило збільшення перекисного окислення ліпідів.
Апоптоз також є іншим патогенним механізмом, за допомогою якого індукується ACRнирковийприхильність [23]. Реакція BAX зросла в 4.5-рази в групі ACR. BAX виявляє проапоптотичну активність [29]. Ресвератол, як один із флавоноїдів, забезпечує високий захистниркаяк клубочки інирковийканальці були майже нормальними. Порівняно з групою ACR вміст колагенових волокон і реакція PASнирковийканальців зменшився на 70, 19 відсотка. Крім того, рівні креатиніну та сечовини знизилися на 51,47 відсотка. Багато дослідників зафіксували екзогенний антиоксидантний захисний ефект РВС наднирка[21]. RVS викликав таку захисну роль завдяки своєму антиоксидантному ефекту, оскільки рівень MDA знизився на 45 відсотків, а рівень GSH збільшився на 83 відсотки порівняно з групою ACR. RVS запобігає виробленню супероксиду незв’язаною ендотеліальною синтазою оксиду азоту та підвищує експресію різноманітних антиоксидантних ферментів [30]. Антиоксидантна активність багатьох флавоноїдів зумовлена прямим поглинанням вільних від кисню радикалів або збуджених форм кисню, а також інгібуванням окислювальних ферментів, що продукують АФК [26]. Іншим захисним механізмом RVS є його антиапоптотичний ефект. З використанням RVS відсоток площі імунопозитивних клітин BAX зменшився на 56 відсотків порівняно з групою ACR.
ВИСНОВКИНа закінчення, ACR викликає структурні та функціональні розладинирка. Це спонукаєураження нирокчерез окислювальний стрес і апоптоз. З використанням РВС нормниркаархітектура збереглася з незначними конструктивними змінами. RVS забезпечує захист завдяки своїм антиапоптичним і антиоксидантним властивостям.