Прогностичне значення експресії білка 8, пов’язаного з мієлоїдом нирок, у пацієнтів із захворюваннями нирок, пов’язаними з ожирінням або діабетом 2 типу

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Такасіге Кувабара¹, Кійоші Морі1,^2*, Масато Касахара^1,3, Хідекі Йокой¹, Хіротака Імамакі¹,Акіра Іші¹, Кенічі Кога¹, Акіра Сугавара⁴, Шіндзі Ясуно³, Кендзі Уесіма³, Такаші Морікава⁵,Йошіо Коніші⁵, Масахіто Іманісі⁵, Акіра Нісіяма⁶, Казува Накао^1,2, Масасі Мукояма¹

¹Департамент медицини та клінічних наук, Вища медична школа Кіотського університету, Кіото, Японія,

²Центр медичних інновацій, Вища медична школа Кіотського університету, Кіото, Японія,

³Відділ дослідження EBM, Інститут розвитку клінічної та трансляційної науки, Лікарня Кіотського університету, Кіото, Японія,

⁴Відділення нефрології, лікарня Червоного Хреста Осаки, Осака, Японія,

5 Відділення нефрології та гіпертензії, Загальна лікарня міста Осака, Осака, Японія,

6 Кафедра фармакології, Медична школа університету Кагава, Кагава, Японія

Анотація

Передумови та мета: ми повідомили, що toll-подібний рецептор 4 (TLR4) і один із його ендогенних лігандів, мієлоїдний білок 8 (MRP8 або S100A8), відіграють важливу роль у прогресуванні діабетичної нефропатії у мишей. Метою цього дослідження було оцінити значимістьниркаЕкспресія MRP8 у пацієнтів зожиріння- або асоційований з діабетом 2 типухвороби нирок. Методи: у хворих на цукровий діабет, ожиріння або контрольну групу рівні експресії мРНК і білка MRP8 у зразках біопсії нирок визначали за допомогою RT-PCR у реальному часі та імуногістохімії (n=28 і 65 відповідно), а також їх зв’язки з початковим рівнем та проаналізовано прогностичні параметри. Вплив MRP8 на експресію прозапальних генів досліджували за допомогою макрофагів. Результати:ниркаРівні експресії гена MRP8 і білка були підвищені в групах із ожирінням або діабетом порівняно з контрольною групою. Згідно з однофакторним лінійним регресійним аналізом, кількість позитивних клітин клубочкової MRP8-і тубулоінтерстиціальна MRP8-позитивна площа на початковому рівні відповідно корелювали не лише з різними відомими факторами ризику діабетичної нефропатії (наприклад, серед усіх суб’єктів). систолічний артеріальний тиск, протеїнурія та креатинін сироватки), а також із ступенем гломерулосклерозу та тубулоінтерстиціального фіброзу. Незалежні фактори, що передбачають рівень білка в сечі через рік, досліджували за допомогою багатофакторного аналізу, і вони включали кількість позитивних клітин у клубочках MRP8- (b=0.59, P, 0.001), протеїнурію (b=0.37, P=0.002) і систолічний артеріальний тиск (b=0.21, P=0.04) на початковому рівні, після коригування відомого ризику фактори. Експресію білка MRP8 спостерігали в CD68-позитивних макрофагах і атрофічних канальцях. У культивованих мишачих макрофагах індукована білком MRP8 експресія прозапальних цитокінів також викликала автоіндукцію MRP8 залежно від TLR4-.

Висновки: Експресія MRP8 у клубочках, очевидно, пов’язана з прогресуванням протеїнурії у пацієнтів із ожирінням або діабетом 2 типу, можливо, через індукцію запальних змін у макрофагах через передачу сигналу TLR4.

Дія цистанхи: лікування захворювань нирок

вступ

Хронічне запалення відіграє важливу роль у патогенезі діабету абоожиріннята його серцево-судинні ускладнення [1]. Вважається, що рецептори вродженого імунітету та ендогенні ліганди беруть участь у процесі хронічного запалення. Мієлоїдний білок 8 (MRP8, також відомий як S100A8 або кальгранулін А) спочатку був ідентифікований як цитоплазматичний білок, що зв’язує кальцій, у нейтрофілах і моноцитах [2] і став широко визнаним як потужний ендогенний ліганд для toll-подібного рецептора 4 (TLR4). ) при різних захворюваннях, включаючи септичний шок, судинні та аутоімунні захворювання [3,4,5]. Нещодавно ми припустили, що сигналізація MRP8/TLR4 відіграє важливу роль у прогресуванні діабетичної нефропатії, спричиненому гіперліпідемією [6]. Гломерулярні макрофаги та клітини збиральних проток є основними джерелами MRP8 у мишачих моделях діабетичної нефропатії [6] та фіброзу нирок [7] відповідно. Рівні MRP8 у плазмі крові, який зазвичай утворює гетеродимерний комплекс із партнером по зв’язуванню MRP14 у крові, підвищуються у пацієнтів із ожирінням [8,9]. Однак не було повідомлень про дослідження ниркової експресії MRP8 у пацієнтів з ожирінням аботипу2 цукровий діабеті його зв'язок з нирковим прогнозом.

Метою цього дослідження було визначити рівні експресії мРНК і білка MRP8 униркаяпонських пацієнтів з діабетичною нефропатією (DN),ожиріннягломерулопатія (ORG), нефротичний синдром мінімальних змін (MCNS) або незначна аномалія клубочків (MGA), які були діагностовані за допомогою біопсії нирки, і для оцінки того, чи може експресія MRP8 у нирках передбачити ниркові результати.

Цистанхея може покращити роботу нирок

Матеріали та методи

Декларація етики

Дослідження на людях проводилося відповідно до принципів, викладених у Гельсінкській декларації, і було схвалено етичними комітетами з досліджень людини Вищої медичної школи Кіотського університету та Загальної лікарні міста Осака відповідно. Усі учасники дали письмову інформовану згоду. Протокол дослідження на тваринах був схвалений Комітетом досліджень тварин Вищої медичної школи Кіотського університету (номер дозволу: Med Kyo 13318). Усі операції на тваринах проводилися під анестезією пентобарбіталом натрію, і було зроблено все можливе, щоб мінімізувати страждання.

Навчальні предмети

Пацієнти з протеїнурієюожирінняабо діабет 2 типу, які пройшли біопсію нирки, були зараховані до цього дослідження. Пацієнти з інфекційними захворюваннями, раком, захворюваннями печінки або захворюванням колагену були виключені. Протеїнурія визначалася як білок у сечі понад 0,5 г/г креатиніну або альбумін у сечі понад 300 мг/г креатиніну принаймні у двох послідовних вимірюваннях.ожиріннявизначався як індекс маси тіла (ІМТ), що перевищує 25.0 (кг/м²). Цукровий діабет 2 типу був діагностований відповідно до критеріїв Всесвітньої організації охорони здоров'я. Біохімічні вимірювання при надходженні для біопсії нирки використовувалися як базові характеристики для поперечного аналізу. Розрахункова швидкість клубочкової фільтрації (eGFR) була розрахована за допомогою спрощеного прогнозного рівняння, запропонованого Японським товариством нефрології: eGFR (мл/хв/1,73 м²)=1946 [вік (роки)]20.287 6 [сироватковий креатинін (мг пердл)]21.094 60.739 (для жінок), що є перевіреною місцевою модифікацією MDRD [ 10]. Концентрацію креатиніну в сироватці крові вимірювали ферментативним методом.

Для імуногістохімії було проаналізовано 65 японських пацієнтів, які пройшли біопсію нирок у Департаменті медицини та клінічних наук лікарні Кіотського університету між 2000 і 2011 роками. Підтверджені біопсією діагнози всіх пацієнтів протягом цього періоду наведені в таблиці S1 у файлі S1. Суб’єкти, досліджені в цій роботі, включали DN (n=19), ORG (n=10) та суб’єктів контрольної групи без ожиріння та діабету, яким було поставлено діагноз MGA (n=19) або MCNS (n=17). Деякі випадки в цих категоріях були виключені, оскільки наявні залишкові зразки містили менше 10 клубочків. Визначення ДН складалося з (1) тривалості понад 5 років після початку діабету, (2) наявності мікро- або макроальбумінурії, (3) сумісних з ДН гістопатологічних змін, таких як потовщення базальної мембрани клубочків, розширення мезангіалу, вузлуватість склероз (вузлики Кіммельстіля-Вілсона) та/або гіаліноз артеріол, і (4) виключення інших причин ниркових розладів [11]. ORG морфологічно визначався як фокальний сегментарний гломерулосклероз та/або гломеруломегалія у суб’єктів із обомаожиріннята протеїнурія, визначення яких були описані вище [12,13].

Для аналізу експресії мРНК були виключені зразки низької якості, у яких рівні 18S рибосомної РНК (рРНК) були нижчими за межу чутливості виявлення за допомогою RT-PCR у реальному часі. Зараховані суб’єкти складалися з 22 пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу, які пройшли біопсію нирки в загальній лікарні міста Осака між 2000 і 2010 роками, та 6 контрольних суб’єктів без діабету, у яких було підтверджено біопсією MGA.

Таблиці 1 і 2 підсумовують базові клінічні характеристики пацієнтів, які були обстежені за допомогою імуногістохімічного аналізу або аналізу експресії генів відповідно. Для світлової мікроскопії зразки тканин обробляли відповідно до стандартних процедур. Зрізи фарбували гематоксиліном-еозином, періодною кислотою-Шиффом, періодною кислотою, метенамін-сріблом або трихромом Массона (рис. S1). Співвідношення кількості клубочків із глобальним склерозом серед загальної кількості клубочків і відносної площі тубулоінтерстиціального фіброзу оцінювали незалежно два патологоанатоми, які не знають діагнозу та клінічних даних.

Дія цистанхи: лікування захворювань нирок

Визначення результатів для нирок

Наступні два прогностичні показники досліджувалися за допомогою аналізу лінійної регресії та логістичної регресії відповідно: (1) ступінь протеїнурії, виміряний через рік після біопсії, та (2) ниркова подія, визначена як щорічне підвищення креатиніну сироватки на 0,50 відсотка від початкового рівня або початку хронічного діалізу.

Імуногістохімія

Імуногістохімію MRP8 і CD68 проводили за допомогоюнирказрізи (товщиною 4 мм), фіксовані 4-процентним буферним параформальдегідом. Після отримання антигену цитратним буфером зрізи нирок інкубували з 10% козячої сироватки, а потім інкубували мишачі антитіла проти людини MRP8 (1:100; BMA biomedicals, Augst, Швейцарія)[14] або мишачі антитіла проти людини CD68 (1:50). DAKO, Елі, Великобританія), відповідно. Первинні антитіла візуалізували за допомогою вторинного антитіла, кон’югованого з пероксидазою хрону, і 3,3-діамінобензидину тетрагідрохлориду (Dako USA, Carpinteria, CA). Ядра контрастно фарбували гематоксиліном. MRP8-позитивні клітини підраховували в більш ніж 10 клубочках, і MRP8-позитивну площу в тубулоінтерстиції вимірювали кількісно, ​​щоб отримати середнє значення для кожного суб’єкта за допомогою програмного забезпечення MetaMorph 7.5 (Molecular Devices, Даунінгтаун, Пенсильванія, США). ). Колокалізацію CD68- і MRP8-позитивних клітин оцінювали за допомогою серійних зрізів. Не було ані сигналу MRP8, ані CD68 у негативних контролях, пофарбованих без першого антитіла (рис. S2). Завдяки попередній інкубації анти-MRP8 антитіла з 20 молярним надлишком рекомбінантного людського білка MRP8 (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США) при 4°C протягом ночі, фарбування було помітно зменшено, якщо не повністю, що ще більше підтвердило специфічність антитіла (рис. S3) .

Цистанхея для лікування нирок

Оцінка експресії мРНК

Замороженінирказрізи розділяли на тканини клубочків і неклубочків за допомогою лазерної мікродисекції (LM200; Olympus, Токіо, Японія), як описано раніше [15]. Тотальну РНК екстрагували за допомогою міні-набору RNeasy (Qiagen, Токіо, Японія). Рівні експресії мРНК визначали методом ПЛР у реальному часі TaqMan (Applied Biosystems, Фостер Сіті, Каліфорнія, США) [16,17]. Рівні експресії всіх генів були нормалізовані рівнями 18S рРНК (внутрішнього контролю). Дивіться таблицю S2 у файлі S1 для послідовностей праймерів і зондів. Еукаріотична 18S рРНК була виявлена ​​за допомогою попередньо розроблених реагентів для аналізу TaqMan (Applied Biosystems).

Таблиця 1. Базові клінічні характеристики пацієнтів під час біопсії нирки, у яких імуногістохімічним методом аналізували експресію білка MRP8.

MGA: незначна аномалія клубочків, MCNS: нефротичний синдром мінімальних змін, ORG:ожиріннягломерулопатія, DN: діабетична нефропатія, ІМТ: індекс маси тіла, BUN: азот сечовини крові, CRP: С-реактивний білок. Дані є засобами 6 SD. *Загальні відмінності між групами MGA, MCNS, ORG і DN порівнювали за допомогою ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

MRP8 лікування макрофагів

Макрофаги, отримані з кісткового мозку, були отримані від мишей дикого типу або нокауту TLR4 (KO) [18] на генетичному фоні C57BL/6J (Oriental BioService, Кіото, Японія), як описано раніше [6]. Коротко кажучи, після лізису еритроцитів клітини кісткового мозку ресуспендували в середовищі, що містило 20 відсотків фетальної телячої сироватки та 50 нг/мл рекомбінантного колонієстимулюючого фактора людських макрофагів (Peprotech, Rocky Hill, NJ, США), і культивували при 37uC в атмосфері 5 відсотків CO2. На 7-й день макрофаги інкубували з рекомбінантним мишачим MRP8 (Abnova, Тайбей, Тайвань) або носієм протягом 4 годин. Поліміксин B (25 мг/мл, NacalaiTesque, Кіото, Японія) додавали до кожної лунки, щоб мінімізувати забруднення ендотоксином, як описано раніше [3,19]. Ноендотоксин було виявлено при будь-якій концентрації MRP8, протестованого надалі після інкубації з 25 мг/мл поліміксину B за допомогою набору ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Загальну РНК із клітин екстрагували за допомогою RNeasy MiniKit, а рівні експресії мРНК інтерлейкіну-1 бета (IL-1b), фактора некрозу пухлини-альфа (TNFa) і MRP8 визначали за допомогою TaqMan у реальному часі ОТ-ПЛР. Рівні експресії всіх генів були нормалізовані рівнями GAPDH гризунів (внутрішній контроль, попередньо розроблені реагенти для аналізу TaqMan). Послідовності праймерів і зондів для ПЛР у реальному часі наведено в таблиці S2 у файлі S1.

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення 6 SD або означає 695-відсотковий довірчий інтервал (ДІ), якщо це доречно. Для порівняння між чотирма групами використовувався односторонній або двосторонній дисперсійний аналіз із пост-хок аналізом Бонферроні, а категоричні змінні порівнювалися за допомогою критерію x2. Непарний t-критерій Стьюдента застосовувався для порівняння між двома групами. Коефіцієнти кореляції Спірмена були оцінені для визначення асоціацій між двома змінними. Щоб дослідити вплив базових коваріат, що визначають ступінь клубочкової або тубулоінтерстиціальної експресії MRP8 або рівні білка в сечі через рік після біопсії, було проведено однофакторний та багатофакторний аналіз лінійної регресії. Логістичний регресійний аналіз використовувався для аналізу пояснювальних змінних, що передбачають виникнення ниркових подій. Усі дані аналізували за допомогою програмного забезпечення StatView 5.0 (SAS InstituteInc., Кері, Північна Кароліна, США). Значення P 0.05 вважалися статистично значущими.

Дія цистанхи: лікування захворювань нирок

Результати

Ми порівняли рівні експресії білка MRP8 униркасеред DN, ORG та контрольних груп без ожиріння та недіабету (MGA та CNS). Імуногістохімічний аналіз показав, що як кількість позитивних клітин клубочкового MRP8- (рис. 1A), так і тубулоінтерстиціальна MRP8-позитивна область (рис. 1B) у DN були значно більшими, ніж у інших групах, включаючи MGA, MCNS, та ORG (P<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Таблиця 2. Вихідні клінічні характеристики пацієнтів під час біопсії нирки, у яких аналізували експресію мРНК MRP8 за допомогою ЗТ-ПЛР у реальному часі.

Асоціації міжниркаСигнали MRP8 і початкові клінічні параметри під час біопсії нирки аналізували поперечно (табл. 3). За допомогою однофакторного аналізу експресія гломерулярного та/або тубулоінтерстиціального білка MRP8 значно корелювала з віком, систолічним і діастолічним артеріальним тиском, білком у сечі, рівнями креатиніну в сироватці крові, холестерину BUN і HDL, eGFR і ступенем глобального гломерулосклерозу та тубулоінтерстиціального фіброзу. Ці параметри були додатково досліджені за допомогою багатофакторного аналізу після виключення діастолічного артеріального тиску, eGFR та BUN через колінеарність. Відсоток тубулоінтерстиціального фіброзу незалежно корелював із сигналами гломерулярного MRP8 (b=0.62, скоригований P=0.02) і тубулоінтерстиціальними сигналами MRP8 (b=0.85, скоригований P ,0,001) відповідно. Крім того, тубулоінтерстиціальні сигнали MRP8 також незалежно корелювали з вихідною протеїнурією (b=0.20, скоригований P=0.01). Аналіз розсіяних графіків між сигналами MRP8 у клубочках або тубулоінтерстиції та клінічними параметрами показав, що MCNSgroup відмінний від інших груп характер розподілу, особливо щодо рівня білка в сечі та рівня холестерину ЛПНЩ у сироватці (рис. S5A–D, S6A–D). Виключення групи MCNS покращило кореляцію між сигналами MRP8 та рівнями білка в сечі або холестерину ЛПНЩ у сироватці (рис. S5E–F, S6E–F). Таким чином, ми провели субаналіз, виключивши пацієнтів з MCNS, і виявили, що білок у сечі був незалежним фактором, корельованим із сигналами гломерулярного MRP8 за допомогою багатофакторного аналізу (таблиця 4; b=0.36, скоригований P=0.03 ).

Далі ми провели лінійний регресійний або логістичний регресійний аналіз, щоб визначити пояснювальні фактори, що передбачають ниркові результати, якими були ступінь протеїнурії через рік і ниркова подія протягом року. Оскільки був хороший зв’язок між клубочковими та тубулоінтерстиціальними сигналами MRP8 (рис. S7; R=0.67,P, 0.001), ці параметри були альтернативно зареєстровані в подальшому аналізі . Ми оцінили зв’язок між початковими параметрами та білком у сечі через 1 рік після біопсії нирки за допомогою множинного регресійного аналізу. Як показано в таблиці 5, клубочковий сигнал MRP8 (b=0.59, скоригований P, 0,001) був прогностичним фактором для ступеня протеїнурії через рік, а також базовий систолічний артеріальний тиск (b {{13} }.21, скоригований P=0.04) і вихідна протеїнурія (b=0.37, скоригований P=0.002) були. Ці параметри не залежали від інших відомих факторів ризику діабетичної нефропатії, включаючи ниркову дисфункцію (сироватковий креатинін) і ступінь глобального склерозу та тубулоінтерстиціального фіброзу [11, 21–24]. З іншого боку, тубулоінтерстиціальний сигнал MRP8 (b=0.34, скоригований P=0.09) не був незалежним фактором прогнозування рівня білка в сечі через рік. Порушення функції нирок виникли у 7 пацієнтів (6 у випадках ДН і 1 у випадках ORG) протягом року після біопсії нирки. Згідно з однофакторним аналізом, не лише ступінь гломерулосклерозу та тубулоінтерстиціального фіброзу, а також гломерулярні та тубулоінтерстиціальні сигнали MRP8, але також артеріальний тиск, ниркова дисфункція та рівні білка в сечі на початковому рівні були значущими прогностичними факторами для виникнення ниркових подій. Однак за допомогою багатофакторного аналізу їх коваріати були компенсовані одна одною (таблиця S3 у файлі S1), ймовірно, через високу кореляцію між цими параметрами.

Нарешті, ми перевірили ефективність MRP8 як ендогенного ліганду для TLR4 за допомогою культивованих макрофагів. У макрофагах кісткового мозку мишей дикого типу білок MRP8 індукував регуляцію прозапальних цитокінових генів, таких як IL-1b і TNFa, а також ініціював автоіндукцію MRP8 залежно від дози між 1{{ 15}}–1000 нг/мл. Ці ефекти MRP8 були придушені приблизно на дві третини в макрофагах, отриманих від мишей TLR4 KO (P, 0,01) (рис. 3).

Малюнок 1. Імуногістохімічний аналіз і аналіз мРНК для MRP8 внирказразки біопсії. Кількісна оцінка клубочкової MRP{{0}}позитивної кількості клітин (A) і тубулоінтерстиціальної MRP8-позитивної області (B). Експресія мРНК MRP8 у клубочкових і неклубочкових фракціях (C). Відкриті стовпчики: контрольні групи без ожиріння та діабету, MGA або MCNS, закриті стовпчики: ORG або DN (A–C). Репрезентативні зображення груп MGA, MCNS, ORG і DN (D–G). MGA: незначна аномалія клубочків, MCNS: нефротичний синдром мінімальних змін, ORG: гломерулопатія, пов’язана з ожирінням, DN: діабетична нефропатія. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001

Обговорення

Це дослідження продемонструвало, що MRP8 рясно експресується в клубочках і тубулоінтерстиції пацієнтів з ДНК порівняно з ORG і контрольною групою без ожиріння та діабету (MGA і MCNS). Крім того, у суб’єктів ORG рівні експресії MRP8 були, як правило, вищими, ніж у суб’єктів MGA або MCNS. У базовому поперечному дослідженні, включно з усіма суб’єктами, за допомогою однофакторного лінійного регресійного аналізу, клубочкова MRP8-позитивна кількість клітин і тубулоінтерстиціальна MRP8-позитивна площа відповідно корелювали не лише з різними відомими факторами ризику діабетична нефропатія (така як систолічний артеріальний тиск, протеїнурія та креатинін сироватки), але також із ступенем гломерулосклерозу та тубулоінтерстиціального фіброзу. За даними багатофакторного аналізу, позитивна площа тубулоінтерстиціального MRP8-значно корелювала з протеїнурією та тубулоінтерстиціальним фіброзом. Кількість позитивних клітин у клубочках MRP8- значно корелювала з тубулоінтерстиціальним фіброзом у первинному аналізі та з протеїнурією у субаналізі, за винятком групи MCNS. Імуногістохімія показала, що MRP8 експресується, принаймні частково, CD68(+)-експресуючими макрофагами та атрофічними канальцями. Ці висновки підвищують ймовірність тогониркаСигнали MRP8 у клубочках або тубулоінтерстиції можуть служити новими маркерами діабетичної нефропатії.

Рисунок 2. Локалізація експресії білків CD68 і MRP8 у серійних зрізах випадків діабетичної нефропатії. Експресія CD68(A, B) і експресія MRP8 (C, D) у парних ниркових зразках (A і C або B і D). Стрілки вказують на спільну локалізацію сигналів CD68 і MRP8.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

У прогностичному дослідженні багатофакторний аналіз показав, що рівні білка в сечі через рік після біопсії нирки були незалежно пов’язані з позитивною кількістю клітин у клубочках MRP8-, білком у сечі та систолічним артеріальним тиском на початку. Слід зазначити, що експресія клубочкової MRP8 показала найсильнішу кореляцію з білком у сечі через рік (b= 0.87), навіть сильніше, ніж базовий рівень білка в сечі (b=0.78), згідно з однофакторним аналізом. Частково це пояснюється тим, що експресія MRP8 у клубочках не є значно підвищеною при «доброякісних» формах протеїнурії, таких як ті, що спостерігаються у пацієнтів з MCNS, у яких рівні протеїнурії надзвичайно високі при діагностиці за допомогою біопсії нирок, але зазвичай зникають протягом року після початку імуносупресивної терапії. Ці результати свідчать про те, що експресія MRP8 у клубочках може мати унікальну прогностичну природу як маркер захворювання, який не можна замінити базовою протеїнурією або рутинним патологічним аналізом, що оцінює глобальний гломерулосклероз і тубулоінтерстиціальний фіброз. Більше того, ми припускаємо, що клубочкова експресія MRP8 не є простим маркером або спостерігачем, а активним гравцем у пошкодженні клубочків, як обговорюється нижче.

Коефіцієнт детермінації (R2), розрахований із пояснювальними параметрами, зареєстрованими в множинному регресійному аналізі, становив 0.52* і 0.74# відповідно. y, роки; АТ, артеріальний тиск; гКр, г креатиніну; Т-хол, загальний холестерин; HDL-Chol, холестерин ЛПВЩ; LDL-chol, холестерин ЛПНЩ; ГС, гломерулосклероз; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Таблиця 4. Піданаліз зв’язку між базовими клінічними параметрами та сигналами MRP8 після виключення групи MCNS.

Таблиця 5. Множинний регресійний аналіз для визначення факторів, що прогнозують рівень білка в сечі через 1 рік після біопсії нирки

Рисунок 3. Вплив MRP8 на макрофаги кісткового мозку. Макрофаги кісткового мозку (BMDM) стимулювали рекомбінантним MRP8 миші протягом 4 годин. Смуги похибок вказують на 95-відсотковий ДІ, і статистичний аналіз проводився з логарифмічним перетворенням значень. Двосторонній дисперсійний аналіз виявив значні впливи генотипів, концентрацій MRP8 та їх взаємодії для експресії всіх 3 генів (P, 0.001 для всіх порівнянь). n=4. WT, дикого типу; нокаут, нокаут; IL-1b, інтерлейкін 1 бета; TNFa, фактор некрозу пухлини-альфа. *P,0,01 серед різних концентрацій, #P,0,01 серед генотипів.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

Під час іншої спроби лонгітюдного дослідження логістичний регресійний аналіз не зміг виявити жодних незалежних предикторів виникнення ниркової події протягом року. Ми припускаємо, що це частково тому, що тубулоінтерстиціальна експресія MRP8 і тубулоінтерстиціальний фіброз були двома потужними предикторами ниркової події в однофакторному аналізі, але їх значення були скасовані один одним в багатофакторному аналізі. Ці два параметри продемонстрували сильну кореляцію (R=0.68, P, 0.001) (рис. S8), що свідчить про те, що ці два параметри можуть бути еквівалентними прогнозуванню ниркових подій. Дійсно, інтерстиціальна експресія MRP8 показала досить подібну картину до інтерстиціального фіброзу, оціненого трихромним фарбуванням за Массоном. Кількість інтерстиціального MRP8 значною мірою залежить від позитивних сигналів в атрофічних канальцях, а не від сигналів у макрофагах, ознаки яких відрізняються від гломерулярного MRP8 точковим розподілом. Крім того, невеликий розмір вибірки, короткий період спостереження та небагато суб’єктів, у яких розвинулися порушення функції нирок, могли знизити ефективність виявлення. Оскільки експресія MRP8 у клітинах тубулоінтерстиціального епітелію відіграє причинну роль у прогресуванні тубулоінтерстиціального запалення в мишачій моделі фіброзу нирок [7], необхідний подальший аналіз для з’ясування ролі тубулоінтерстиціального MRP8 у ДН.

Згідно з нашим попереднім дослідженням [6], мРНК MRP8 була активована переважно в клубочковій фракції суб’єктів ДН людини порівняно з контрольними суб’єктами з MGA. З іншого боку, експресія білка MRP8 спостерігалася не тільки в клубочку, а й в тубулоінтерстиції. У зв’язку з цим слід зазначити, що існували два чіткі моделі фарбування MRP8 у тубулоінтерстиції ДН. Один був інтенсивним і вогнищевим фарбуванням у сильно атрофічних канальцях. Іншим було помірне фарбування, розподілене вздовж щіткової межі проксимальних канальців, яке також було виявлено в ORG і MCNS. Останні сигнали, ймовірно, представляють білок MRP8, отриманий з крові та реабсорбований проксимальними канальцями, що не повинно супроводжуватися підвищеною експресією мРНК MRP8. Стосовно білків, відмінних від MRP8, ми та інші нещодавно повідомили про подібні явища виявлення імунореактивного білка в проксимальних канальцях, спричинені реабсорбцією, але не нирковим синтезом [25,26]. З іншого боку, оскільки в тесті на поглинання антитіл залишалося невелике фарбування MRP8, особливо в клубочкових ексудативних ураженнях і сильно рубцевих, фіброзних ураженнях навколо атрофічних канальців, наявність неспецифічних сигналів не можна повністю спростувати (рис. S3).

Сигнали гломерулярного MRP8 в основному демонстрували точкові візерунки у суб’єктів ДН (рис. 1, рис. S4). Оскільки як CD68, так і MRP8 були виявлені мишачими моноклональними антитілами, локалізацію цих молекул оцінювали серійними зрізами, а не подвійним імунним фарбуванням. Патерни фарбування MRP8 були сумісні з такими при інших запальних захворюваннях нирок, включаючи IgAnephritis [27], мембранопроліферативний гломерулонефрит [14] і гломерулонефрит, пов’язаний з ANCA [20], при якому макрофаги вважалися основним джерелом MRP8, як ми повідомляли в модель гризуна [6]. Крім того, нейтрофіли можна розглядати як ще одне джерело MRP8, що впливає на судинні ускладнення [28]. В даний час ми досліджуємо молекулярний механізм, чому MRP8 переважно посилюється в клітинах мієлоїдної лінії, що інфільтрують клубочки. Дослідження in vitro показало, що MRP8 індукує експресію запальних цитокінів, а також посилює експресію самого MRP8 у макрофагах залежно від TLR4-. Крім того, MRP8-позитивні клітини були відсутні в нодулярних склерозуючих ураженнях, що свідчить про те, що клубочковий MRP8 може відображати триваюче пошкодження клубочків [20]. Важливо відзначити, що найбільш масштабне дослідження на людях показало, що експресія гена MRP8 в мононуклеарних клітинах крові пацієнтів з цукровим діабетом 1 типу значно підвищена у пацієнтів з діабетичними ускладненнями, включаючи нефропатію [29].

Оскільки пригнічення ренін-ангіотензинової системи (РАС) є важливим чинником, що визначає наслідки для нирок, ми досліджували вплив блокади РАС наниркаВираз MRP8. Ми не виявили суттєвої різниці в експресії мРНК MRP8 нирки між пацієнтами з ДН, які отримували блокаду RAS або без неї (рис. S9), ймовірно, через те, що у пацієнтів, які отримували блокаду RAS, була тенденція до більш тяжкої гіпертензії та протеїнурії, ніж у випадках без блокади RAS.

У людей і мишей із ожирінням підвищення рівня комплексу MRP8/14 у плазмі може відображати певний ступіньожирінняі походять з адипоцитів, а також лейкоцитів [8,9]. Наші випадки ORG мали помірне фарбування MRP8 у проксимальних канальцях, що свідчить про підвищення рівня MRP8 у плазмі. Навпаки, не було значної кореляції між тубулоінтерстиціальною експресією MRP8 та індексом маси тіла (рис. S6G). Таким чином, локальна експресія MRP8 вниркаможе служити кращим маркером для пошкодження нирок, а не дляожиріння[8,9].

Цистанхея для поліпшення ниркової дисфункції

Наше дослідження має кілька обмежень. Вибірка кожної досліджуваної групи була невеликою. Неідентичні суб'єкти були зареєстровані в мРНК та імуногістохімічному аналізі. Оскільки ми проаналізували лише пацієнтів, які пройшли біопсію нирки, склад досліджуваних тут пацієнтів може не відображати загальних пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу або загальним хронічнимниркапредмети захворювання. Незважаючи на те, що в наших даних вік не був збережений як незалежний фактор, пов’язаний із сигналами MRP8 (табл. 3), відомо, що старіння пов’язане з хронічним запаленням [30]. Не можна повністю нехтувати впливом віку. Хоча більшість сигналів MRP8 було втрачено під час тесту на поглинання антитіл, залишилися деякі позитивні сигнали, які могли бути спричинені неспецифічним зв’язуванням першого антитіла. Як обговорювалося вище, дослідження ниркової експресії MRP8 за допомогою біопсії нирок допомагає нам зрозуміти патофізіологію та прогноз хронічних захворювань нирок, особливо пов’язаних ізожирінняі діабет, але має недолік для рутинного та багаторазового використання в амбулаторних клініках

Підводячи підсумок, це дослідження припускає, що експресія MRP8 униркавідображає поточний патологічний стан, а також прогнозує ниркові наслідки у пацієнтів зожирінняабоцукровий діабет 2 типу. Можуть бути виправдані подальші масштабні дослідження рівня MRP8 у сечі серед пацієнтів із ожирінням або діабетом

Допоміжна інформація

Рисунок S1. Репрезентативні фотографії, на яких показано зрізи біопсії нирки пацієнта з ДН, пофарбовані (A) періодною кислотою Шиффа, (B) періодною кислотою метенамін срібла або (C) трихромом Массона. Співвідношення кількості клубочків із глобальним склерозом (стрілки) серед загальної кількості клубочків і відносної площі тубулоінтерстиціального фіброзу становило 33% і 65% відповідно у цього пацієнта. (TIFF)

Рисунок S2 Імуногістохімія для білків MRP8 і CD68 у пацієнтів з ДН. Фотографії в правій колонці показують експерименти з негативним контролем без 1-го антитіла. (TIF)

Рисунок S3 Тест на поглинання антитіл для фарбування MRP8. PBS: фосфатно-буферний фізіологічний розчин, rhMRP8: рекомбінантний MRP8 людини. (TIF)

Рисунок S4 Репрезентативні фотографії експресії MRP8 у групах MGA, MCNS, ORG і DN. (TIF)

Рисунок S5 Кореляція між кількістю позитивних клітин MRP8-клубочка та клінічними параметрами. Використовувалися логарифмічно перетворені значення сигналів MRP8. Кореляції аналізували з використанням усіх 4 груп (A–D, G) або 3 груп, за винятком групи MCNS (E, F). Незамкнені кола: незначна аномалія клубочків (MGA), закриті кола: нефротичний синдром мінімальних змін (MCNS), незамкнені трикутники:ожиріння-пов'язана гломерулопатія (ORG), замкнуті трикутники: діабетична нефропатія (DN).(TIF)

Рисунок S6 Кореляція між тубулоінтерстиціальною MRP8-позитивною зоною та клінічними параметрами. Використовувалися логарифмічно перетворені значення сигналів MRP8. Ці кореляції аналізували з використанням усіх 4 груп (A–D, G) або 3 груп, за винятком групи MCNS (E, F). (TIF)

Рисунок S7 Кореляція між клубочковою та тубулоінтерстиціальною експресією MRP8. Були використані логарифмічно перетворені значення сигналів MRP8. (TIF)

Рисунок S8 Кореляція між тубулоінтерстиціальною MRP8-позитивною зоною та тубулоінтерстиціальним фіброзом. Було використано логарифмічно перетворені значення сигналів MRP8. (TIF)

Рисунок S9 Ниркова експресія мРНК MRP8 у пацієнтів з ДН з ренін-ангіотензиновою блокадою або без неї. НС: незначна. n=15 (Так), 6 (Ні). Серед 22 випадків ДН в одного пацієнта не було інформації про ліки. (TIF)

Файл S1 Допоміжні таблиці.

Таблиця S1, Патологічні діагнози всіх випадків, які пройшли біопсію нирки у Департаменті медицини та клінічних наук лікарні Кіотського університету між 2000 і 2011 роками. Таблиця S2, Послідовності праймерів і зондів для RT-PCR у реальному часі TaqMan. Таблиця S3, Логістичний регресійний аналіз для виникнення ниркової події протягом року. (DOC) Подяка Ми вдячні С. Танака за статистичні поради, Ю. Огава, Н. Ігараші та К. Кімура за технічну допомогу та А. Ямамото та С.Огіно за допомогу секретарю. Внески автора Задумано та розроблено експерименти: TK KM MK HY MI AN KNMM. Виконав досліди: TK HI AI KK TM YK MI AN. Проаналізовано дані: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Надані реактиви/матеріали/інструменти аналізу: TK KM. Написав роботу: ТК КМММ.

Дія цистанхи: лікування захворювань нирок

Список літератури

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) Діабет 2 типу як запальне захворювання. Nat Rev Immunol 11: 98–107.

2. Одінк К., Черлетті Н., Брюгген Дж., Клерк Р.Г., Тарксей Л. та ін. (1987) Два білки, що зв'язують кальцій, в інфільтруючих макрофагах ревматоїдного артриту. Nature 330: 80–82.

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C та ін. (2007) Mrp8 і Mrp14 є ендогенними активаторами Toll-подібного рецептора 4, що сприяють летальному, спричиненому ендотоксином шоку. Nat Med 13: 1042–1049.

4. Кроче К, Гао Х, Ван І, Мурока Т, Сакума М та ін. (2009) Мієлоїдний білок-8/14 має вирішальне значення для біологічної відповіді на пошкодження судин. Circulation 120: 427–436.

5. Лозер К., Фогль Т., Воскорт М., Люкен А., Купас В. та ін. (2010) Ліганди Toll-подібного рецептора 4 Mrp8 і Mrp14 мають вирішальне значення для розвитку аутореактивних CD8 плюс Т-клітин. Nat Med 16: 713–717.

6. Кувабара Т, Морі К, Мукояма М, Касахара М, Йокой Х та ін. (2012) Загострення діабетичної нефропатії через гіперліпідемію опосередковується Toll-подібним рецептором 4 у мишей. Diabetologia 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) Епітеліальні клітини ниркової збірної протоки регулюють запалення при тубулоінтерстиціальному пошкодженні у мишей. J Clin Invest 121: 3425–3441.

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T та ін. (2012) Високий циркулюючий рівень комплексу S100A8/A9 (кальпротектин) у японських самців з абдомінальним ожирінням і дисрегуляцією експресії S100A8 і S100A9 в жировій тканині мишей із ожирінням. Biochem Biophys Res Commun 419: 782–789.

9. Мортенсен О.Г., Нільсен А.Р., Ерікструп К., Пломгаард П., Фішер К.П. та ін. (2009) Кальпротектин — новий маркерожиріння. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K та ін. (2009) Переглянуті рівняння для оцінки ШКФ на основі креатиніну сироватки в Японії. Я ДжниркаDis53: 982–992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) Діабетична нефропатія: діагностика, профілактика та лікування. Лікування діабету 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)ожиріння-пов'язана гломерулопатія: епідемія, що розвивається.ниркаInt 59: 1498–1509.

13. Прага М, Моралес Е (2006)ожиріння, протеїнурія та прогресування ниркової недостатності. Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486.

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M та ін. (2005) Експресія мієлоїдного білка 8 на макрофагах є корисним прогностичним маркером ниркової дисфункції у дітей з MPGN типу 1. Am JниркаDis 45: 510–518.

15. Нісіяма А, Коніші Ю, Охаші Н, Морікава Т, Урушіхара М та ін. (2011) Ангіотензиноген сечі відображає активність внутрішньониркової ренін-ангіотензинової системи у пацієнтів з IgA-нефропатією. Nephrol Dial Transplant 26: 170–177.

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K та ін. (2012) Рецептор натрійуретичного пептиду гуанілілциклаза-А захищає подоцити від пошкодження клубочків, викликаного альдостероном. J Am Soc Nephrol 23: 1198–1209.

17. Йокой Х, Мукояма М, Морі К, Касахара М, Суганамі Т та ін. (2008) Надмірна експресія фактора росту сполучної тканини в подоцитах погіршує діабетичну нефропатію у мишей.ниркаInt 73: 446–455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T та ін. (1999) Передовий край: миші з дефіцитом Toll-подібного рецептора 4 (TLR4) погано реагують на ліпополісахариди: докази того, що TLR4 є продуктом гена Lps. J Immunol162: 3749–3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X та ін. (2007) Роль шляху Toll-подібного рецептора 4/NF-kappaB у запальних змінах, викликаних насиченими жирними кислотами, у взаємодії між адипоцитами та макрофагами. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84–91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N та ін. (2013) Експресія S100A8/S100A9 лейкоцитів і сироватки відображає активність захворювання при васкуліті та гломерулонефриті, асоційованому з ANCA.ниркаInt 83: 1150–1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) Основними факторами ризику нефропатії при цукровому діабеті 2 типу є рівень холестерину в плазмі, середній артеріальний тиск і гіперглікемія. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR, et al. (2000) Зв’язок систолічного артеріального тиску з макро- та мікросудинними ускладненнями діабету 2 типу (UKPDS 36): проспективне обсерваційне дослідження. BMJ 321: 412–419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Нефропатія цукрового діабету -2 типу. J Assoc Nephrol 9: 2157–2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Клінічні та гістологічні кореляції зниження функції нирок у хворих на діабет з протеїнурією. Діабет 43: 1046–1051.

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A та ін. (2012) Ліверангіотензиноген є основним джерелом ниркового ангіотензину II. J Am Soc Nephrol 23: 1181–1189.

26. Кувабара Т, Морі К, Мукояма М, Касахара М, Йокой Х та ін. (2009) Рівні ліпокаліну, асоційованого з нейтрофільною желатиназою в сечі, відображають пошкодження клубочків, проксимальних канальців і дистальних нефронів.ниркаInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y та ін. (2009) Накопичення макрофагів, що експресують мієлоїдний білок 8, пов’язане з прогресуванням склеротичних змін у дітей з нефропатією IgA. Tohoku J Exp Med 218: 49–55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S та ін. (2013) Гіперглікемія сприяє мієлопоезу та погіршує вирішення атеросклерозу. Cell Metab 17: 695–708.

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X та ін. (2013) Експресія запальних генів підвищується в периферичній крові пацієнтів з діабетом 1 типу. Догляд за діабетом.

30. Лонго В. Д., Фінч К. Е. (2003) Еволюційна медицина: від систем карликової моделі до здорових довгожителів? Наука 299: 1342–1346.

Посилання: Кувабара Т, Морі К, Касахара М, Йокой Х, Імамакі Х та ін. (2014) Прогностичне значенняниркаЕкспресія мієлоїдного протеїну 8 у пацієнтів зожиріння- або хвороби нирок, пов'язані з діабетом 2 типу. PLoS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Редактор: Утпал Сен, Луїсвільський університет, Сполучені Штати Америки

Одержано 11.09.2013 р.; Прийнято 14 січня 2014 р.; Опубліковано 18 лютого 2014 р

Авторське право: 2014 Kuwabara та ін. Це стаття відкритого доступу, яка розповсюджується відповідно до ліцензії Creative Commons Attribution License, яка дозволяє необмежене використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії за умови вказівки оригінального автора та джерела.

Фінансування: Ця робота була частково підтримана грантом на дослідження діабетичної нефропатії та нефросклерозу від Міністерства охорони здоров’я, праці та соціального забезпечення Японії (до KM), дослідницькими грантами від японського Міністерства освіти, культури, спорту, науки і технології (до TK, KM і MM), від Японського фонду прикладної ензимології (до TK) і від Фонду дослідження паління (до MM). Спонсори не брали участі в плануванні дослідження, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

* Електронна адреса: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp