Багатий поліфенолами екстракт листя Ocimum Gratissimum запобігає токсичному впливу циклофосфаміду на функцію нирок щурів Wistar

Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:oscar.xiao@wecistanche.com

Анотація

фон:Циклофосфамід (ЦФ) є одним із потужних і недорогих хіміотерапевтичних засобів, які використовуються в клінічних умовах проти різноманітних пухлин. Однак зв'язок з нефротоксичністю обмежує його терапевтичне використання. Листя Ocimum gratis simum є лікарською рослиною з численними фармакологічними та терапевтичними властивостями, такими як антиоксидантні, протизапальні та антиапоптотичні властивості.

Методи. Дане дослідження було розроблено для оцінки захисного ефекту Ocimum gratissimum (OG) проти дисфункції нирок, спричиненої ЦП, у щурів. Щурам попередньо вводили 400 мг/кг маси тіла екстракту листя Ocimum gratissimum (Ocimum G.) протягом 4 днів, а потім 50 мг/кг маси тіла CP вводили разом з дня 5 по 7 разом із Ocimum G. Маркери функції нирок оцінювали окислювальний стрес, споживання їжі та води, електроліти, альдостерон, інфляцію лейкоцитів, запалення та гістопатологічні зміни.

Результати:У групах, які отримували ХП, спостерігалося очевидне запалення нирок і пошкодження нирок. Однак введення екстракту листя Ocimum G. запобігало окислювальному стресу, пошкодженням нирок, послаблювало запалення, збільшувало вироблення альдостерону та зменшувало втрату іонів натрію та води у щурів. Концентрації креатиніну в плазмі, сечовини та альбуміну в сечі нормалізувалися після введення екстракту Ocimum G. у щурів, які отримували CP. Ocimum G. також знижував концентрацію в плазмі інтерлейкіну-(IL)-6, C-реактивного білка та активності мієлопероксидази та малонового діальдегіду у щурів, які отримували СР.

Висновок: Ocimum G. запобігає пошкодженню нирок і покращує функцію нирок шляхом пригнічення запалення та індукованої окислювачем токсичності ЦП. Ефективність Ocimum G. пов’язана з наявністю в рослині різних фітохімічних речовин.

Ключові слова:Антиоксидант, креатинін, циклофосфамід, лист Ocimum gratissimum, нирки, натрій.

Фон

Циклофосфамід (CP) є протипухлинною сполукою, яка пов'язана з азотистим іпритом. Він використовується в клінічних умовах для лікування широкого спектру онкологічних захворювань та в імуносупресивній терапії після трансплантації органів, лікуванні аутоімунних розладів, таких як ревматоїдний артрит, гранулематоз Вегенера та нефритичний синдром у дітей [1]. Незважаючи на широкий спектр клінічного застосування препарату, CP, як відомо, викликає численні дозозалежні ушкодження органів, які, отже, стримують його терапевтичне використання в клінічних умовах. Оскільки було відомо, що він є корисним для лікування нефротичного синдрому у дітей [1], навпаки, у деяких попередніх дослідженнях повідомлялося, що він викликає пошкодження сечового міхура [2, 3] і спричиняє токсичний вплив на нирки при неправильному застосуванні через використання CP. передозування [4–6]. Активний метаболіт CP, 4-гідроксициклофосфамід, частково таутомеризується в альдосфосфамід, який, у свою чергу, розщеплюється фосфатазою в кровообігу та живих клітинах, що призводить до утворення двох цитотоксичних метаболітів, фосфорамідного іприту та акролеїну [6]. Раніше повідомлялося, що терапевтична дія фосфорамідної гірчиці відповідає за протипухлинні ефекти [6], тоді як акролеїн відповідає за цитотоксичні ефекти ЦП, такі як геморагічний цистит під час введення препарату [2, 7]. Токсичний метаболіт CP пошкоджує живі тканини, пригнічуючи ендогенну антиоксидантну систему тканин через утворення реактивних вільних радикалів кисню, які є мутагенними для живих клітин. Повідомлялося, що введення високих доз CP посилює перекисне окислення ліпідів і спричиняє зниження ендогенних ферментативних і неферментативних антиоксидантів [7, 8]. У попередніх дослідженнях було описано корисне використання антиоксидантів разом із хіміотерапією для запобігання побічній дії препарату на тканини організму [7, 9, 10]. Антиоксиданти, такі як колавірон, виявилися ефективними в профілактиці кардіотоксичності ХП у щурів [11]. Таким чином, поєднання вантиоксидантний засібразом із хіміотерапевтичними препаратами може бути потенційним терапевтичним підходом для запобігання або зупинки цитотоксичного розвитку ХП. Оцимум гратиссімум (Ocimum G.) — родина губоцвітих (Lamiaceae) до трав'янистих видів рослин. Він відомий як гвоздика або африканський базилік у багатьох тропічних країнах (Азія, Індія, Бразилія та Західна Африка тощо). Значно поширений у Нігерії [12]. Багато штатів цієї країни (Нігерія) використовували Ocimum G. як соус і овочевий суп. Було виявлено, що листя та квіти Ocimum G. містять поліфеноли та інші біоактивні сполуки [13, 14]. Рослини Ocimum gratissimum використовуються для лікування різних захворювань, таких як діарея, виразковий коліт, лихоманка та катар [14–17]. Рослина має багато фармакологічних переваг завдяки своїм протизапальним, антиоксидантним, антибактеріальним, протидіабетичним та протималярійним властивостям [14, 18–20]. Антимікробну активність екстракту Ocimum G. було перевірено in vitro проти різних збудників хвороб людини, таких як Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Escherichia, Vibro spp, Enterobacter spp, Enterococcus faecalis тощо. Протигрибкова активність ефірної олії Ocimum G ., було помічено in vitro [19, 21, 22], а Ocimum G. використовувався як засіб від комарів [23]. Нещодавнє дослідження на тваринах засвідчило важливість захисного ефекту екстрактів Ocimum G. у запобіганні порушенням артеріального тиску проти токсичності хлориду кобальту [24], а також пом’якшення серцевих аномалій, пов’язаних із фіброзом печінки, шляхом зниження рівня інтерлейкіну-6 сигнального шляху [25] або шляхом індукції антиоксидантних ефектів [26]. Водний екстракт листя Ocimum G. продемонстрував антиоксидантну дію проти серцево-ниркової травми, викликаної хлоридом кобальту [24], і запобігав виразці шлунка, зменшуючи секрецію шлункової кислоти та виразку [27]. Крім того, урсолова кислота з екстрактів Ocimum G. продемонструвала протисерповидну активність [28] і протиракову [29, 30]. Крім того, було показано, що ефірні олії Ocimum G. виявляють залежні від ендотелію судинорелаксуючі властивості у щурів [31]. Дослідження in vivo та in vitro показали, що евгенол, лікарський компонент Ocimum G., знижує рівень глюкози в крові шляхом інгібування альфа-глюкозидази [32]. Крім того, клінічне дослідження встановило фармакологічну адекватність Ocimum G. для демонстрації подібної активності, як хлоргексидин, проти нальоту та гінгівіту [33]. Враховуючи всі ці особливості Ocimum G., ми припустили, що Ocimum G. може бути можливим терапевтичним засобом, якщо його використовувати разом із CP для запобігання або припинення побічних ефектів CP. Таким чином, це дослідження було розроблено для вивчення сприятливого впливу багатого на поліфеноли екстракту листя Ocimum gratissimum на нефротоксичність, спричинену ЦП, у самців щурів Wistar.

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Матеріали та методи

Циклофосфамід (200 мг/10 мл) для ін’єкцій було придбано в лабораторії Celon (Гайдарабад, Індія); кетаміну гідрохлорид (50 мг/10 мл) для ін’єкцій було придбано у Popular Pharmaceuticals Ltd. (Газіпур, Бангладеш); Набори для аналізу біохімічних параметрів були отримані від Randox Laboratories Limited (Крумлін, Великобританія) тощо. Були придбані 1-дифеніл-2-пікрилгідразил (DPPH), метанол, карбонат натрію, тролокс і реагент Фоліна-Чокальтеу від Merck & Co., Kenilworth, NJ, США. Використовувані інструменти включають газовий хромато-мас-спектрометр (GCMS-QP2010 SE, Shimadzu Corporation, Кіото, Японія) та ультрафіолетовий видимий спектрофотометр (Beckman, DU 7400, США), апарат Сокслета, роторний випарник, мікроскоп (Olympus CH; Olympus). , Токіо, Японія); фотоапарат (Leica DM 750).

Приготування поліфенольного екстракту листя Ocimum gratissimum

Листя Ocimum gratissimum були зібрані в саду в Усі, штат Екіті, Нігерія. Отримано відповідні інституційні дозволи на збір Ocimum gratissimum. Це дослідження відповідає міжнародним, національним та/або інституційним рекомендаціям щодо використання різних частин рослини. Зразки рослини підтвердив пан Омоле, куратор гербарію кафедри ботаніки Університету Обафемі Аволово, Іль-Іфе, де ваучерний зразок (1945) був депонований в гербарії університету. Багатий поліфенолами екстракт був отриманий з листя Ocimum G. (900г) відповідно до наших попередніх методів екстракції рослини [14]. Метанол використовували для отримання кінцевого продукту екстракції, багатого на поліфеноли екстракту листя Ocimum gratissimum (PREOG) під зниженим тиском при 40 градусах за допомогою роторного випарника. Отриманий концентрат екстракту ліофілізували за допомогою ліофілізатора. Залишок (8{{40}},85 г) зберігали в чашках Петрі з щільно закритою кришкою та зберігали при -20 градусах, поки він не знадобився для дослідження. Отриманий екстракт OG розчиняли у воді (0,2 мл/введення) і давали щурам відповідно до розробленої дози. Газохромато-мас-спектрометричний аналіз (ГХ-МС) OG екстрактів. Хімічний склад отриманого екстракту перевіряли за допомогою газової хромато-мас-спектрометрії (ГХ-МС). Чавес та ін. [34] метод був прийнятий з невеликими змінами. Для визначення сполук використовували капілярну колонку з плавленого кремнезему (товщина плівки 30×0,25 HP-5Ms, 0,25 мкм), що містить гелій як газ-носій (швидкість потоку 1/мл). Температуру духовки було встановлено на 40 градусів і підтримувалося протягом 5 хвилин, а потім поступово підвищувалося на 3 градуси/хв до 270 градусів. 60:1 було встановлено як співвідношення розподілу. Для з’єднувальних частин і джерел іонів була встановлена ​​температура 180 градусів, а для мас-спектрометра – температура межі розділу 240 градусів. Для величини енергії іонізації використовувалося 70 еВ, тоді як режим електронного удару (EI) був обраний для отримання стабільних і відтворюваних мас-спектрів, а діапазон значень 50–650 м/z використовувався для аналізу зразків. Час затримки MS перед скануванням становив 5 хв. Отримані сполуки наведено в таблиці 2. Визначення загального фенольного вмісту. Загальний фенольний вміст (TPC) екстрактів оцінювали за допомогою методики Фоліна-Чокальтеу, як описано Gulcin et al. [35], з деякими змінами. Коротко, 100 мкл (0,5 мг/мл) багатих поліфенолами екстрактів Ocimum G. помістили в окремі прості пробірки. Приблизно 500 мкл (1 відсоток об’єму) фенолового реагенту Фоліна–Чіокальтеу додавали до кожної пробірки, що містить екстракт Ocimum G., і пробіркам залишали на 5 хвилин. а потім вихровий. Після витримування протягом 5 хвилин приблизно 400 мкл (20 відсотків маси) карбонату натрію додавали до аліквот, які потім інкубували в темряві при кімнатній температурі протягом 90 хвилин. Для розвитку кольору. Поглинання кожної суміші оцінювали за допомогою ультрафіолетового видимого спектрофотометра (Beckman, DU 7400, США) при 765 нм. Розчин карбонату натрію без додавання фенольного реактиву Фоліна–Чокальтеу використовували як холосту пробу. Для калібрувальної кривої використовували стандарти галової кислоти. TPC зразків визначали за допомогою лінійної регресії стандартів галової кислоти. Результати були представлені як еквівалент галової кислоти (GAE) на грам сухої маси екстракту Ocimum gratissimum (мг GAE/г). Процедуру проводили в трьох повторах (n=3). Аналіз поглинання вільних радикалів DPPH Активність екстракту по поглинанню вільних радикалів визначали згідно з методом, описаним RakMai et al. [36], з невеликими змінами. Додавали приблизно 2 мл розчину DPPH–метанол (180 мкмоль/л) і змішували з екстрактом при 0,1 мг/мл. Аліквоти інкубували в темряві при 25 градусах. Поглинання зразка визначали за допомогою спектрофотометра при 517 нм у різні часові інтервали від 0 до 60 хв. Аліквоти екстрактів без додавання розчину ДФПГ–метанол використовували як порожні проби. Тролокс, синтетичний аналогвітамінE, використовували як позитивний контроль. Наведене нижче рівняння було використано для оцінки поглинаючих властивостей екстрактів. Процедуру проводили в трьох повторах (n=3). Де зразок – це екстракт плюс DPPH, бланк – лише екстракт, контроль – це абсорбція контрольного розчину (що містить лише DPPH). Догляд за тваринами Для дослідження використовували двадцять вісім (28) самців щурів Wistar вагою 120-180 г. Tey було придбано з тваринницького холдингу Коледжу медичних наук Університету Обафемі Аволово, Іле-Іфе. Усіх щурів утримували в звичайних клітках протягом 1 тижня, щоб акліматизуватись до умов навколишнього середовища при 28-32 градусі, і їм дозволили мати вільний доступ до дієти та чистої питної води. Експеримент був схвалений Комітетом з етики досліджень охорони здоров’я (HREC) Університету Обафемі Аволово, і дослідження було описано відповідно до рекомендацій ARRIVE (тварини в дослідженні: звіт про експеримент in vivo) [37].

Цистанш проти втоми

Гістопатологічні дослідження

Тканини нарізали мікротомом на зрізи завтовшки {{0}} мкм, фіксували на предметних стеклах і фарбували PAS. Скела спостерігали під світловим мікроскопом (Olympus CH; Olympus, Токіо, Японія), а мікрофотографії були зроблені камерою Leica DM 750 зі збільшенням ×400. Зріз ниркової тканини оцінював сертифікований патологоанатом, який не знав протоколу експерименту. Пошкодження клубочків оцінювали від 0 до 4 ступенів шляхом оцінки мезангіальної проліферації, товщини базальної мембрани та фібриноїдних змін. Пошкодження канальців оцінювали від 0 до 4 ступенів шляхом оцінки вакуольної дегенерації, десквамації, дегенерації канальців, проксимального тубулярного некрозу та формування зліпка. Тубулоінтерстиціальні запальні інфільтрати оцінювали між 0 і 2 ступенями шляхом оцінки різноманітності запальних клітин у середовищі та наявності інфільтратів в епітелії канальців (табл. 1) [44]. Загальна оцінка пошкодження нирок 0–2 означала відсутність/слабку нефротоксичність, 3–6 помірну нефротоксичність і 7–10 важку нефротоксичність [44].

Результати

Аналіз методом газової хромато-мас-спектрометрії, вміст фенолів і здатність екстракту листя Ocimum gratissimum поглинати DPPH виявили деякі біоактивні сполуки екстракту листя Ocimum gratissimum (табл. 2). Вміст поліфенолів в екстракті визначали за допомогою методу Фоліна–Чокальтеу (табл. 2). Загальний вміст фенолів (TPC) (80.36±0.50 мг GAE/100 г), отриманий в екстракті Ocimum G., показав, що екстракт Ocimum gratissimum багатий вмістом фенолів. Здатність екстракту поглинати DPPH також оцінювали шляхом розрахунку значення IC50, яке стосується кількості екстракту, який здатний поглинати 50 відсотків вільних радикалів, що містяться в реакційній суміші. Значення IC50 (22,12±0,43 мг/мл) екстракту було високим, і це означало високуантиоксидантдіяльність листя Ocimum gratissimum. Таким чином, була показана функція високого фенольного вмісту рослини в її здатності поглинати активність вільних радикалів (табл. 2).

Вплив PREOG і циклофосфаміду на кліренс креатиніну

Значне зниження ниркового кліренсу креатиніну спостерігалося в групі, яка отримувала тільки КП, порівняно з контролем (р<0.05). however,="" the="" preog-treated="" groups="" revealed="" a="" significant="" increase="" in="" the="" creatinine="" clearance="" when="" compared="" with="" cp="" alone="" treated="" group=""><0.05)>

Обговорення

У поточному дослідженні є ознаки підвищених рівнів параметрів окислювального стресу, таких як перекисне окислення ліпідів, перекис водню (H2O2) і оксид азоту (NO), що свідчить про те, що мембранні ліпіди та білок нирок щурів, які отримували Постраждали лише КП. Крім того, активність антиоксидантних ферментів, таких як супероксиддисмутаза і каталаза, і рівень неферментативного антиоксиданту, відновленого глутатіону, були знижені в групі, яка отримувала лише CP. Зменшення антиоксидантів у ниркових клітинах щурів, які отримували лише CP, було ознакою дисбалансу окисно-відновного гомеостазу. Раніше було показано, що CP викликає окисне пошкодження, запалення та клітинний некроз або апоптоз після активації та стимулювання активних форм кисню (АФК) через його метаболіт, акролеїн [7, 11, 14], що згодом викликає дезактивацію та зменшенняантиоксидантний захистпотужності уражених організмів [10, 11, 45]. У цьому дослідженні надвиробництво АФК переважає над ендогеннимантиоксидантну здатність, викликає окислювальний стрес і згодом пошкоджує ниркові клітини щурів, які отримували CP, що було відображено підвищенням рівня маркерів окислювального стресу та зниженням рівняантиоксидантні параметри. Крім того, гістологічний огляд цих щурів показав пошкодження клубочків і тубулярний некроз ниркових клітин. Крім того, окисно-відновний дисбаланс викликає гіперпродукцію прозапальних цитокінів [3, 14]. Виявлено, що надмірне виробництво АФК викликає перекисне окислення ліпідів і мобілізацію прозапальних цитокінів і одночасно викликає запальне пошкодження ниркових клітин. Оцінка IL-6 у цьому дослідженні була значно підвищена у щурів, які отримували СР, що вказує на напад окислювального стресу та запалення ниркових клітин. Встановлено, що підвищення IL-6 запускає та/або стимулює печінку ініціювати відповідь гострої фази, що призводить до збільшення виробництва циркулюючого С-реактивного білка (СРБ) та інших біоактивних медіаторів [46]. CRP був значно підвищений у щурів, які отримували CP, і підвищений рівень цього біомаркера був показником ранньої системи захисту від інфекцій, інформації та пошкодження тканин [47, 48]. Підвищення рівня CRP у цьому дослідженні додатково підтвердило наявність запалення у щурів, які отримували лише CP. Було виявлено, що ЦП викликає зниження ендогенних антиоксидантів у нирках, наприклад надмірне використання GSH нирками через накопичення продуктів метаболіту циклофосфаміду в клітинах ниркових канальців [9]. У результаті цього процесу нирки щурів, які отримували лише CP, могли підвищити імунну відповідь проти своїх клітин, що згодом призвело до запалення, про що свідчить підвищення рівня CRP у плазмі. За згодою, ЦП має потенціал індукувати запалення та, ймовірно, імунологічне пошкодження в нирках щурів, які отримували ЦП.

Висновок

На завершення результати цих досліджень показали, що багатий на поліфеноли екстракт Ocimum gratissimum запобігає несприятливій побічній дії CP на функцію нирок через зниження окислювального стресу, запобігає надмірному виробленню прозапальних цитокінів і інфляції лейкоцитів, а також покращує антиоксидантну ферментативну дію. активність ниркової тканини. Крім того, було підтверджено, що CP індукує зниження секреції альдостерону та сприяє надмірній втраті натрію та води через сечу у щурів. Проте екстракт Ocimum G. покращував функцію нирок, збільшував вироблення альдостерону та запобігав надмірній втраті натрію та води у щурів, які отримували СР. Наявність поліфенолу та антиоксидантів у листі Ocimum gratissimum робить його ідеальним кандидатом для лікування та/або профілактики нефротоксичної дії циклофосфаміду.

Список літератури

1. Чабнер Б.А., Райанд Д.П., Пакс-Арес Л., Гарсіс-Карбонеро, Каларесі П. Протипухлинні засоби. У: Harnam JG, Libmirde LE, редактори. Гудман і Гілман є фармакологічною основою терапії. 10-е вид. Нью-Йорк: McGraw Hill; 2001. стор. 1389–459.

2. Чабнер Б. А. та ін. Протипухлинні засоби. У: Brunton LL, Lazo JS, Parker KL, редактори. Гудман і Гілман є фармакологічною основою терапії. 11-е вид. Нью-Йорк: McGraw Hill; 2006. стор. 1322–8. 1694 рік.
3. Ge B, Yang D, Wu X, Zhu J, Wei W, Yang B. Цитозахисні ефекти ліпосоми гліцирретинової кислоти проти циститу, викликаного циклофосфамідом, шляхом інгібування запального стресу. Int Immunopharmacol. 2018;54:139–44.
4. Сінаноглу О, Єнер А.Н., Екічі С., Міді А., Аксунгар Ф.Б. Захисні ефекти спіруліни в індукованій циклофосфамідом нефротоксичності та уротоксичності у щурів. Основи перекладу наук. 2012 рік.
5. Caglayan C, Temel Y, Kandemir FM, Yildirim S, Kucukler S. Naringin захищає від індукованої циклофосфамідом гепатотоксичності та нефротоксичності шляхом модуляції окисного стресу, запалення, апоптозу, аутофагії та пошкодження ДНК. Environ Sci Pollut Res Int. 2018; 25 (21): 20968–84.
6. Zhang J, Tian Q, Yung S, Chuen S, Zhou S, Duan W та ін. Метаболізм і транспорт оксазафосфоринів і клінічні наслідки. Drug Metab Rev. 2005; 37: 611–703.
7. Famurewa AC, Edeogu CO, Ofor FI, Besong EE, Akunna GG, Maduagwuna EK. Пониження регуляції окисно-відновного дисбалансу та передачі сигналів iNOS/NF-ĸB/caspase-3 за допомогою добавок цинку запобігає уротоксичності індукованого циклофосфамідом геморагічного циститу у щурів. Life Sci. 2021;266:118913.
8. Oyagbemi AA, Omobowale TO, Saba AB, Olowu ER, Dada RO, Akinrinde AS. Галова кислота пом'якшує нейротоксичність, спричинену циклофосфамідом, у щурів Вістар за рахунок активності поглинання вільних радикалів і покращення системи антиоксидантного захисту. J Дієта Suppl. 2016;13:402-19.
9. Абрахам П, Ісаак Б. Вплив перорального глутаміну на індуковану циклофосфамідом нефротоксичність у щурів. Hum Exp Toxicol. 2010;30(7):616–23.
10. Шериф І.О. Нейропротекторний механізмкверцетинпроти уротоксичності, спричиненої циклофосфамами: вплив на маркери окисного стресу та запалення. J Cell Biochem. 2018; 119 (9): 7441–8. 11. Omole JG та ін. Захисний ефект колавірону на індуковану циклофосфамідом серцеву токсичність у щурів. J Evid Based Integr Med. 2018;23:1
11. Ефраїм К.Д., Джекс Т.В., Содіпо О.А. Гістопатологічні дослідження токсичності екстракту листя Ocimum gratissimum на деяких органах кроликів. Afr J Biomed Res. 2003;6:21–5.
12. Акінмоладун А.С., Ібукун Е.О., Еммануель А., Обуотор Е.М., Фаромбі Е.О. Фітохімічний склад та антиоксидантна активність екстракту з листя Ocimum gratissimum. Sci Res Essays. 2007; 2: 163-6.
13. Alabi QK, Akomolafe RO, Omole JG, Adefsayo MA, Ogundipe OL, Aturamu A та ін. Багатий поліфенолами екстракт листя Ocimum gratissimum полегшує коліт шляхом послаблення пошкодження слизової оболонки товстої кишки та регулювання продукування прозапальних цитокінів і окисного стресу у щурів. Біомед Фармакотер. 2018;103:812–22.
14. Офа В.Н., Чіквенду У.А. Протидіарейні ефекти екстракту листя Ocimum gratissimum у експериментальних тварин. J Етнофармакол. 1999;68:327-30.