Фітохімічний скринінг та естрогенна активність загальних глікозидів Cistanche Deserticola

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Анотація

Протягом десятиліть постійно докладалися зусилля для підвищення якості життя людини. Постменопаузальний синдром є серйозною проблемою для здоров'я жінки. Гормональна терапія в даний час є основою лікування цього захворювання. Однак ця терапія може призвести до зловживання естрогеном, що призведе до побічних реакцій і побічних ефектів. У результаті гормональна терапія виявилася неефективною для полегшення постменопаузального синдрому.Cistanche deserticolaце класична тонізуюча трава в традиційній китайській медицині. Виявляє значну естрогенну активність. Основними діючими речовинами цієї трави є глікозиди. У попередньому експерименті було ідентифіковано три важливі фактори, що впливають на загальний вихід глікозиду, вихід актеозиду та естрогенну активність, а саме концентрацію елюенту, рН та об’єм елюенту. У цьому експерименті було визначено оптимальний процес очищення з використанням методології центрального композиційного дизайну поверхні для отримання глікозидів з цієї трави. Концентрація елюенту (етанолу) 85 відсотків і об’єм 25 BV при pH 11 були визнані оптимальними. Двадцять одну активну сполуку було ідентифіковано за допомогою високоефективної рідинної хроматографії/квадрупольної часопролітної мас-спектрометрії. Це дослідження дає цінну інформацію для подальших поглиблених досліджень з оцінки естрогенної активності загальних глікозидівCistanche deserticola.

Ключові слова: центральна композиційна конструкція; загальні глікозиди Cistanche deserticola; LC/Q-TOF-MS; технологія очищення; тест на ріст матки.

вступ

Cistanche deserticolaце їстівна класична тонізуюча трава. Вперше він згадується в трав'яній класиці Шен Нонга і зарахований до вищого класу. Це тепла і солодка трава. Він має численні лікувальні властивості, такі як живлення печінки та нирок, зміцнення м’язів і кісток, покращення регуляції імунітету разом із антивіковою та протипухлинною діяльністю [1-4]. Деякі природні сполуки були виділені та ідентифіковані з екстрактів цієї трави, основними з яких є фенілетаноїдні глікозиди, лігнаноїди, іридоїди, полісахариди та алкалоїди [5-8].

Препарати, отримані з лікарських рослин, містять різні активні сполуки, які в першу чергу відповідають за їх терапевтичну дію. Ефективність одного і того ж препарату, отриманого з різних рослинних джерел, може відрізнятися через різницю в типі та кількості активних сполук, присутніх у ньому. Таким чином, важливо ідентифікувати та кількісно визначити всі активні сполуки, присутні в препаратах, отриманих з лікарських рослин. Те саме стосується C. deserticola. Методологія поверхні відгуку – це експериментальний метод дослідження взаємодії між різними факторами одночасно [9-10]. Його можна використовувати для оптимізації параметрів екстракції фітофармацевтичних препаратів та кількісної оцінки активних речовин у препаратах. Центральний композитний дизайн (CCD) є одним із експериментальних проектів, корисних у методології поверхні відгуку. Порівняно з ортогональними та рівномірними конструкціями, CCD має вищу точність і кращу передбачуваність [11].

Постменопаузальний синдром може істотно знизити якість життя жінки. Зазвичай для лікування цього стану використовується естроген. Однак тривале застосування естрогену може призвести до зловживання, викликаючи тим самим різні побічні реакції та побічні ефекти. Тому для лікування постменопаузального синдрому вкрай важливо вибрати альтернативну терапію, бажано рослинний препарат, що містить естроген як активний інгредієнт [12-13].

У попередньому експерименті структури різних природних сполук, отриманих із C. deserticola, були ідентифіковані за допомогою мас-спектрометрії (МС) [14]. Було підтверджено, що глікозиди є основними діючими сполуками, які мають значну естрогенну активність [14-15]. Щоб розробити безпечний та ефективний естрогенний активний інгредієнт у новому препараті, потрібне поглиблене дослідження TGCD після очищення. У цьому дослідженні CCD вперше було використано для оптимізації очищення загальних глікозидів C. deserticola (TGCD). Згодом для оцінки естрогенної активності того ж глікозиду використовували тест на ріст матки. Високоефективна рідинна хроматографія/квадрупольна часопролітна мас-спектрометрія (HPLC/Q-TOF-MS) була використана для якісного аналізу сполук TGCD після очищення. Цей процес був застосований для чіткої демонстрації присутності різних активних сполук з естрогенною активністю в TGCD. Це може одночасно стати основою для його клінічного використання при постменопаузальному синдромі замість естрогену.

Експериментальна процедура

Інструменти

Система ВЕРХ Agilent 1290 (Agilent Technologies, Пало-Альто, Каліфорнія, США), система квадрупольної часпрольотної РХ/МС (Q-TOF) серії Agilent 6530 (Agilent Technologies, Пало-Альто, Каліфорнія, США) і хімічна ВЕРХ{ {5}}Робочі станції D використовувалися як хроматографічні прилади для обробки даних. Для всього дослідження використовувалася надчиста вода Milli-Q. електронні аналітичні ваги AR1140 (Ohaus International Ltd.); рідер мікропланшетів 680 (Bio-Rad Corporation); та високошвидкісну центрифугу 64R (Beckman Coulter Allegra) використовували для підготовки проб.

Ліки та хімікати

C. deserticola був придбаний на ринку наркотиків і ідентифікований професором Чжан Деліаном (Харбінський університет торгівлі, Китай). Стандартний діетилстильбестрол (99 відсотків чистоти, партія № 60518) був придбаний у Dr. Ehrenstorfer (Німеччина). Інші стандартні актеозид (111530-200505) і ехінакозид (111670-200503) були отримані від Національного інституту контролю фармацевтичних і біологічних продуктів, Пекін, Китай. Чистота кожного стандарту становила > 98 відсотків. Ацетонітрил (ACN), метанол і мурашину кислоту (клас MS) були придбані у Thermo Scientific Pierce (Рокфорд, Іллінойс, США). Надчиста вода була отримана від Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Ханчжоу, Китай). Усі комерційно доступні реагенти мали аналітичну чистоту.

Приготування загальних глікозидів очисного розчину C. deserticola

Після занурення в 75-відсотковий етанол на 12 годин неочищений порошок C. deserticola (100 г) екстрагували 800 мл 75-відсоткового (об’ємного) етанолу при 80 градусах протягом 150 хвилин із зворотним холодильником. Потім його фільтрували через двоярусний фільтр і згодом екстрагували 800 мл 75% етанолу двічі протягом додаткових 150 хв. Згодом фільтрати об'єднували і концентрували у вакуумі при 45 градусах. Екстракт отримували видаленням розчинника. До екстракту додавали певну кількість дистильованої води для отримання концентрації 0,5 г/мл, яку використовували для скринінгу процесу очищення.

Для адсорбції з використанням макропористої смоли AB-8 pH розчину досліджуваного зразка було доведено до 11. Спочатку використовували 2 BV дистильованої води, щоб змити домішки. Потім елюент з концентрацією 25 BV 85% етанолу елюювали та збирали. Нарешті, зібраний очищений елюент зливали. До екстракту додавали певну кількість дистильованої води до концентрації 1,5 г/мл, яку використовували для внутрішньошлункового введення. Для позитивного контролю розчин діетилстильбестролу (20 мкг/мл) готували з порошком діетилстильбестролу.

Згідно зі ступенем очищення ({{0}}.6), певну кількість екстракту (еквівалент 1 г C. deserticola) переносили в мірну колбу на 10 мл, розчиняють у 50% (об’єм/об’єм) розчині метанолу в ультразвуковій ванні протягом 5 хвилин і розбавляють до 10 мл. Лікарський розчин отримували після фільтрування надосадової рідини через фільтрувальну мембрану 0,45 мкм. Актеозид і ехінакозид (1 мг кожен) змішували і повністю розчиняли в 10 мл 50% (об./об.) розчину метанолу. Нарешті, стандартний розчин фільтрували через фільтр Millipore 0,45 мкм перед аналізом.

Умови РХ-МС

Хроматографічне розділення проводили в системі HPLC (Agilent 129{{10}}), обладнаній четвертинною системою доставки розчинника, вакуумним дегазатором і фотодіодним детектором. Аналіз MS/MS проводили в системі Agilent-1290 HPLC/6530 Q-TOF-MS, обладнаній електророзпилювальним джерелом іонізації як у режимі позитивних, так і негативних іонів. Для розділення використовували колонку Waters Symmetry shield RP C18 (4,6 × 250 мм, 5 мкм) (Waters Corporation, Мілфорд, Массачусетс, США). Рухома фаза включала 0,2% водного розчину мурашиної кислоти (об./об.) (A) і ACN (B), і її прокачували зі швидкістю потоку 0,5 мл/хв. Об’єм ін’єкції кожного зразка становив 10 мкл. Програма градієнтного елюювання була наступною: 5-23% B протягом 0-35 хв, 23-25% B протягом 35-65 хв і 25-5% B протягом 65-70 хв. Температуру колонки підтримували на рівні 30 градусів. Хроматограми контролювали та записували при 330 нм. Тиск розпилювального газу встановлювали на рівні 30 psi, а напруга в капілярі становила 3,5 кВ. Витрата сухого газу становила 8 л/хв при температурі 30 град. Температуру оболонкового газу встановлювали на рівні 400 градусів при швидкості потоку 12 л/хв. Енергія зіткнення була встановлена ​​на рівні 10–20 еВ для сканування з низькою енергією та 30–50 еВ для сканування з високою енергією. Дані мас-спектрів записували в діапазоні сканування 50–1000 Да в режимах позитивного та негативного іонного сканування. У цьому дослідженні було проведено швидке та ефективне порівняння між TGCD та стандартами за однакових умов LC-MS.

Тест на ріст матки

Це було виконано в суворій відповідності до рекомендацій Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин Національного інституту здоров'я. Усі експериментальні процедури були розглянуті та схвалені Комітетом з етики тварин Харбінського університету торгівлі, Китай.

Незрілі самки мишей Куньмін (приблизно 21 день народження, відлучені) вагою 12 ± 2 г були придбані в Центрі лабораторних тварин Чанчуньської національної бази біологічної промисловості (Чанчунь, Китай). Мишей містили в кімнаті з регульованою температурою (22 ± 2 градуси) з їжею та водою ad libitum. Експерименти на тваринах розпочали після п’яти днів акліматизації. Перед внутрішньошлунковим введенням досліджуваного розчину миші голодували протягом ночі з водою ad libitum.

Мишей випадковим чином розділили на 22 групи, по 10 тварин у кожній. Їм вводили експериментальні препарати в однаковому об’ємі двічі на день (вранці та ввечері) протягом чотирьох днів наступним чином:

Група 1: Внутрішньошлункові загальні глікозиди розчину для очищення C. deserticola (20 мл/кг), (об’єм розчину/вага миші),

ІІ група: внутрішньошлункова дистильована вода (група негативного контролю) і

Група III: внутрішньошлунковий діетилстильбестрол (20 мкг/мл) (група позитивного контролю).

На п'ятий день усіх мишей забивали. Маток негайно видаляли, зважували та розраховували коефіцієнт матки.

Статистичний аналіз

Для визначення статистично значущих відмінностей у різних параметрах у різних експериментальних групах використовувався двобічний t-критерій парної вибірки. Аналіз проводили за допомогою статистичного програмного забезпечення SPSS (SPSS для Windows v21.0, SPSS Inc., США). Відмінності вважалися статистично значущими на 95-відсотковому рівні довіри (p <>

Результати і обговорення

Лінійність та кореляція виходу актеозиду та загальних глікозидів

Рівняння лінійної регресії виходу актеозиду становило y {{0}}x – 14,75 (де x — концентрація актеозиду, а y — його відповідна площа піку) з коефіцієнтом кореляції r=1 в діапазоні концентрацій 0.12−{{10}}.72 мг/мл. Це означало лінійну калібрувальну криву. Рівняння лінійної регресії загального виходу глікозидів становило y=26.074x плюс 0,0866 (де x — концентрація загальної кількості глікозидів, а y — площа її відповідного піку) з коефіцієнтом кореляції r { {12}}.9982 в діапазоні концентрацій 0,013-0,065 мг/мл. Це також вказувало на лінійну калібрувальну криву.

Методичне дослідження

У методичному дослідженні досліджували точність, відтворюваність, стабільність та відновлення зразків. У прецизійному експерименті відносне стандартне відхилення (RSD) актеозиду та загальних глікозидів становило 1,43 відсотка та 0.05 відсотків відповідно. В експерименті з відтворюваністю RSD актеозиду та загальних глікозидів становив 0.10 відсотка та 1,44 відсотка відповідно. У 24-годинному експерименті зі стабільністю RSD актеозиду та загальних глікозидів становив 0,14% і 0,90% відповідно. В експерименті з відновлення, відновлення актеозиду становило 100,50 відсотка з RSD 2,08 відсотка, тоді як відновлення загальних глікозидів становило 99,12 відсотка з RSD 1,65 відсотка. Усі значення RSD були меншими за 3 відсотки. Ці результати продемонстрували хорошу точність і відтворюваність. Крім того, зразок був стабільним протягом 24 годин. Результати відновлення також знаходяться в межах допустимого (95-105 відсотків). Таким чином, цей метод можна використовувати для визначення актеозиду та загального виходу глікозидів після очищення.

Однофакторне дослідження ТГКД

На очищення TGCD за допомогою макропористої смоли може впливати багато факторів, таких як тип смоли, фактори статичної адсорбції (час адсорбції, концентрація витоку та pH розчину зразка) та умови елюювання (швидкість потоку, об’єм і концентрація). Використовуючи як індекси адсорбційну ємність та швидкості десорбції та елюції ТГЦД, умову експерименту визначали за результатами однофакторних експериментів. Використовуючи макропористу адсорбційну смолу типу AB-8, були визначені наступні оптимальні умови: 0.5 мг/мл розчину зразка, pH 10, час статичної адсорбції 8 год, 2 BV дистильована вода для промивання домішок, 20 BV 80% етанолу як елюент і швидкість потоку 0,5 BV/хв. Конкретні результати показані на малюнках 1-7.

CCD для оптимізації технології очищення ТГКД

За результатами однофакторного дослідження в якості показників було обрано три чинники, що суттєво впливають на метод очищення, а саме рН розчину зразка (х1), концентрацію елюенту (х2) та об’єм елюенту (х3). Відповідно до принципу CCD, кожен фактор має п'ять рівнів. Максимальний і мінімальний рівні цих різних факторів були встановлені відповідно до результатів попереднього експерименту. Рівні факторів наведені в таблиці 1, а експериментальні результати наведені в таблиці 2.

Загальні виходи глікозидів і актеозидів були визначені для оптимізації методу очищення TGCD. По-перше, загальні виходи глікозидів і актеозидів були встановлені відповідно до числових критеріїв бажаності (d) між {{0}}-1. Потім розраховується загальна бажаність (OD) [OD=(d1, d2, d3,...,dn)1/n, де n — число індексу]. Програмне забезпечення SPSS21.{{10}} та програмне забезпечення design-expert використовувалися для множинної лінійної регресії та біноміального підбору незалежних змінних і OD, з p < 0.05="" розглядалося="" статистично="" значущий="" стандарт="" рівняння.="" рівняння="" з="" більшим="" значенням="" r="" (множинний="" коефіцієнт="" кореляції)="" було="" обрано="" як="" найкращу="" модель.="" багатофакторне="" лінійне="" рівняння="" представлено="" як="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" плюс="" 0.034x2="" плюс="" 0,012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" p="0.004)." біноміальне="" рівняння="" таке:="" y="–" 21,92173="" –="" 0,74079x1="" плюс="" 0,62914x2="" плюс="" 0,041161x3="" плюс="" 0,014972x1x2="" плюс="" 2,06050*10-4x1x3="" плюс="" 1,05698="" ×="" 10-3x2x3="" -="" 0.029589x="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0.012)." з="" наведених="" вище="" рівнянь="" видно,="" що="" коефіцієнт="" кореляції="" рівняння="" багатовимірної="" лінійної="" регресії="" нижчий.="" кореляція="" між="" незалежними="" та="" залежними="" змінними="" дуже="" низька,="" і="" її="" було="" визнано="" небажаним="" для="" використання="" в="" лінійній="">

Але коефіцієнт кореляції біноміального рівняння був високим, і це призвело до гарної відповідності. Тому була обрана біноміальна модель. На основі всебічного аналізу фігури поверхні та контурної карти в поєднанні з експериментальними даними (значення OD біля {{0}}.6) було отримано оптимальний діапазон методу очищення. На малюнку 8 видно, що максимальне значення OD було отримано, коли pH розчину зразка (A) був у діапазоні 9-10, а концентрація елюенту (B) була в діапазоні 79-85 відсотків. . На рисунку 9 показано, що максимальне значення OD було отримано, коли значення pH розчину зразка (A) було в діапазоні 9-10, а об’єм елюенту (C) був в діапазоні 20-25 BV. На рисунку 10 показано, що максимальне значення OD було отримано, коли концентрація елюенту (B) була в діапазоні 80-85 відсотків, а об'єм елюенту (C) був в діапазоні 20-25 BV. З комплексного аналізу цих даних було визначено, що рН розчину зразка, концентрація елюенту та об’єм елюенту знаходяться в діапазоні 9-10, 80-85 відсотків і 20-25 BV відповідно. На основі багатовимірного біноміального рівняння для змінних похідних результатів і оптимальної схеми було встановлено, що найкращий метод очищення TGCD був при концентрації елюенту (етанолу) 85 відсотків і об’ємі 25 BV при рН 11. Відповідне значення OD становило 0,8332 , а загальний вихід глікозидів становив 73,0339 % . Візуальне враження від малюнків 8-10 визначає, що найкращим методом є той, у якому розглядалися взаємодії між двома факторами, хоча найкращим методом, виведеним із формули, є той, у якому були включені взаємодії між трьома факторами. Два результати відрізнялися, і вважалося, що оптимальним методом очищення є концентрація елюенту (етанолу) 85 відсотків і об’єм 25 BV при pH 11.

Вимірювання росту матки

Коефіцієнт матки для кожної групи наведено в таблиці 3. Порівняно з групою негативного контролю результати інших груп значно відрізнялися. Було виявлено, що всі TGCD, отримані за допомогою 20 різних методів очищення, проявляли естрогенну дію.

Підтверджувальний експеримент

Комплексні результати ПЗС та тесту на ріст матки показали, що оптимальним методом очищення вважається концентрація елюенту (етанолу) 85 відсотків і об’єм 25 BV при рН 11. Під час

у процесі перевірки середній вихід загальних глікозидів становив 70,9150 відсотка. Середнє відхилення між прогнозованими та фактичними значеннями склало 2,1180 відсотка. Таким чином, можна припустити, що передбачуваність і експериментальна достовірність цієї моделі хороші.

Ідентифікація ТГКД після очищення

На основі часу утримування та даних MS було припущено про 21 природний компонент, у тому числі кампнеозид 1, 2′-ацетилактеозид, цистанозид A, цистанозид B, сірінгалід A, 3'- - L-рамнопіранозид, тубулозид A, тубулозид B, салідрозид, цистанозид G, теніпозидова кислота, декафеоїлактеозид, 8-епілоганова кислота, ехінакозид, цистанозид F, цистантубулозид B1, ізоактеозид, актеозид, цис-актеозид, канканозид E, османтузид B і цистанозид C. Час утримання, MS і MS/ Інформація про MS, формулу та можливі сполуки наведено в таблиці 4.

Q-TOF-MS особливо підходить для структурної ідентифікації складних молекулярних компонентів ліків і харчових продуктів, оскільки він може забезпечити можливий елементний склад через точну молекулярну масу та структурні характеристики іонів-фрагментів. Щоб встановити систематичну структурну характеристику, для ідентифікації також використовували Q-TOF-MS, дані MS, пошук бази даних та опубліковану довідкову літературу. Молекулярна формула кожного цільового компонента була виведена з вихідного іона та зіставлена ​​з відомими сполуками. Ця формула може бути додатково визначена з її пов’язаних іонів-фрагментів. Наприклад, пік 5 показав переважаючий депротонований іон при m/z 654 (C30H38O16), який був ідентичним елементному складу кампнеозиду 1. Втрата кофеоїлу утворилася з іона-фрагмента при m/z 493, а втрата фрагмент rha утворився з іона-фрагмента при m/z 347.

Висновок

Використовуючи технологію LC-Q-TOF-MS, був розроблений і повністю перевірений простий і надійний метод якісного аналізу TGCD. Дані перевірки для скринінгу та ідентифікації природних сполук з TGCD були задовільними. Двадцять одна біологічно активна сполука з TGCD була припущена наступним чином: салідрозид, цистанозид G, геніпозидова кислота, декафеоїлактеозид, кампнеозид 1, 8-епілоганова кислота, 2'-ацетилактеозид, цистанозид A, цистанозид B, сірінгалід A3′{{9 }}L-рамнопіранозид, ехінакозид, цистанозид F, цистантубулозид B1, ізоактеозид, актеозид, тубулозид A, цис-актеозид, канканозид E, османтузид B, цистанозид C і тубулозид B. Структурна характеристика цих сполук може стати експериментальною основою для їх контроль якості та подальше клінічне застосування через їх естрогенну активність. Це може запропонувати новий і вдосконалений терапевтичний варіант для лікування постменопаузального синдрому, таким чином уникаючи побічних ефектів і побічних реакцій терапії естрогенами.

Скорочення

ТГКДCistanche deserticolaзагальні глікозиди LC/Q-TOF-MS рідинна хроматографія/квадрупольна часпролітна мас-спектрометрія

Методологія поверхні відгуку RSM

Центральний композитний дизайн CCD

MS мас-спектрометрія HPLC/Q-TOF-MS Високоефективна рідинна хроматографія/квадрупольна часпролітна мас-спектрометрія

ACN ацетонітрил

Об'єм ліжка BV

Загальна бажаність OD

РХ-МС рідинна хромато-мас-спектрометрія

Q-TOF-MS квадрупольна часопролітна мас-спектрометрія

TCM традиційні китайські ліки

RSD відносне стандартне відхилення

Подяки

Цей проект було підтримано Національним фондом природничих наук Китаю (№ 81073015), Науковим фондом природи провінції Хейлунцзян (ZD2017014), планом навчання молодих інноваційних талантів коледжу провінції Хейлунцзян (UNPYSCT- 2017209). Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів щодо публікації цієї статті.

Конфлікт інтересів

Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Список літератури

[1] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Фенілетаноїдні глікозиди з протизапальною дією зі стебел Cistanche deserticola, культивованих у пустелі Тарім, Fitoterapia, 2013, 89, {{4} }.

[2] Guo Y., Cao L., Zhao Q., Zhang L., Chen J., Liu B., Zhao B., Попередні характеристики, антиоксидантна та гепатопротекторна активність полісахариду з Cistanche deserticola, Міжнародний журнал біологічних макромолекул , 2016, 293, 678-685.

[3] Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y., Tu PF, Протизапальні іридоїди зі стебел Cistanche deserticola, вирощених у пустелі Тарім, Китайський журнал природних ліків, 2016, 14, 61-65.

[4] Peng F., Chen J., Wang X., Xu C., Liu T., Xu R., Зміни рівнів фенілетаноїдних глікозидів, антиоксидантної активності та інших ознак якості скибочок Cistanche deserticola шляхом обробки парою, хімічна та Pharmaceutical Bulletin (Токіо), 2016, 64, 1024-1030.

[5] Wang T., Zhang X., Xie W., Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": a review, The American Journal of Chinese Medicine, 2012, 40, 1123-1141.

[6] Song Y., Song Q., Li J., Zhang N., Zhao Y., Liu X., Jiang Y., Tu P., Інтегрована стратегія кількісної диференціації ромашки міжCistanche deserticolaі C. tubulosa за допомогою високоефективної рідинної хроматографії та мас-спектрометрії з гібридною потрійною квадрупольною лінійною іонною пасткою, Journal of Chromatography A, 2016, 1429, 238-247.

[7] Li Y., Peng Y., Wang M., Zhou G., Zhang Y., Li X. Швидкий скринінг та ідентифікація відмінностей між метаболітамиCistanche deserticolaі водний екстракт C. tubulosa у щурів за допомогою комбінованого аналізу розпізнавання образів UPLC-Q-TOF-MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2016, 131, 364-372.

[8] Li WL, Sun XM, Song H., Ding JX, Bai J., Chen Q., HPLC/Q-TOF-MS-Based Identification of Absorbed Constituents and Their Metabolites in Rat Serum and Urine after Oral Administration of Cistanche Deserticola Extract, Journal of Food Science, 2015, 80, H2079-2087.

[9] Almasi A., Dargahi A., Mohamadi M., Biglari H., Amirian F., Raei M., Видалення пеніциліну G шляхом поєднання сонолізу та фотокаталітичного (сонофотокаталітичного) процесу з водного розчину: оптимізація процесу з використанням RSM (Response Surface Methodology), Electron Physician, 2016, 8,

[10] 2878-2887. Hou W., Zhang W., Chen G., Luo Y., Optimization of Extraction Conditions for Maximal Phenolic, Flavonoid and Antioxidant Activity from Melaleuca bract data Leaves Using the Response Surface Methodology, PloS One, 2016, 11,

[11] e0162139. Pooralhossini J., Ghaedi M., Zanjanchi MA, Asfaram A., Вибір екстракції за допомогою ультразвуку в поєднанні зі спектрофотометрією для швидкого визначення галової кислоти у зразках води: центральний композитний дизайн для оптимізації змінних процесу, Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 34 , 692- 699.

[12] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Структурна характеристика та ідентифікація фенілетаноїдних глікозидів зCistanches deserticola YC MaUHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochemical Analysis, 2012, 23, 668-676.

[13] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Кількісний аналіз Cistanches Herba за допомогою високоефективної рідинної хроматографії в поєднанні з детектуванням діодної матриці та високим роздільна мас-спектрометрія в поєднанні з хемометричними методами. Journal of Separation Science, 2013, 36, 1945-1952.

[14] Li WL, Chen Q., Yang B., Gao S., Zhang JJ, Скринінг фітоестрогенних ефективних екстрактів і дозиCistanche deserticola, Китайські лікарські трави, 2013, 5, 292-296.

[15] Li YP, Huang FR, Dong J., Xiao C., Xian RY, Ma ZG, Zhao J., Rapid Identification of Cistanche via Fluorescence Spectrum Imaging Technology Combined with Principal Components Analysis and Fisher Distinction, Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi, 2015, 35, 689-694.