Пентраксин-3-опосередкована активація комплементу в моделі ішемії/реперфузії нирок у свиней

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

К'яра Дівелла та ін

АНОТАЦІЯ

Пентраксини — це сімейство еволюційно збережених молекул розпізнавання образів, які відіграють ключову роль у вродженому імунітеті та запаленні, наприклад опсонізації патогенів під час бактеріальних і вірусних інфекцій. Зокрема, було показано, що довгий Пентраксин 3 (PTX3) регулює кілька аспектів запалення судин і тканин під час трансплантації твердих органів.

У нашому дослідженні досліджували роль PTX3 як можливого модулятора активації комплементу в моделі ішемії/реперфузії нирок (I/R) у свиней. Ми продемонстрували, що ранні відкладення PTX3, спричинені травмою I/R, на перитубулярному та гломерулярному рівнях капілярів. Конфокальна лазерна скануюча мікроскопія виявила відкладення PTX3, локалізовані спільно з CD31 плюс ендотеліальними клітинами. Крім того, PTX3 асоціювався з інфільтрацією макрофагів (CD163), дендритних клітин (SWC3a) і міофібробластів (FSP1). Зокрема, ми продемонстрували значну PTX3-опосередковану активацію класичного (опосередкованого C1q) і лектину (опосередкованого MBL) шляхів комплементу. Цікаво, що відкладення PTX3 локалізуються спільно з активацією кінцевого комплексу комплементу (C5b-9) на ендотеліальних клітинах, що вказує на те, що PTX3-опосередкована активація комплементу відбувалася головним чином на рівні ниркових судин. Підсумовуючи, ці дані вказують на те, що PTX3 може бути потенційною терапевтичною мішенню для запобігання пошкодженню I/R, спричиненому комплементом.

листування до:Джузеппе Кастеллано

Ключові слова:ішемічне/реперфузійне пошкодження, система комплементу, пентраксин 3,нирка, класичний шлях

Cistanche tubulosa запобігає захворюванням нирок, натисніть тут, щоб отримати зразок

ВСТУП

Ішемічно-реперфузійне (І/Р) ушкодження є основною причиною гострогониркатравмапісля трансплантації і характеризується значною активацією системи комплементу [1, 2]. У цьому сценарії ендотеліальні клітини (ЕК) відіграють вирішальну роль у дезадаптивній репарації після I/R, що призводить до раннього фіброзу шляхом переходу ендотелію в мезенхіму (EndMT) [3]. Під час фази реперфузії комплемент керує імунологічними та запальними процесами, сприяючи різноманітним імунним та запальним захворюванням [2–5]. Інші важливі компоненти гуморального відділу вродженої імунної системи представлені пентраксинами, які, як вважають, відіграють ключову роль у судинній біології [6].

Пентраксини є сімейством мультимерних розчинних білків [6], які класифікуються на короткі та довгі сімейства на основі їх структури [7]. Ці еволюційно консервативні білки є ефекторами гострої фази, які служать датчиками для ініціації запалення та швидкого зростання в плазмі під час інфекції [8]. Довгий пентраксин 3 (PTX3) є розчинною молекулою розпізнавання образів, яка має вирішальне значення для вродженого імунного захисту та може активувати систему комплементу [9–11].

Зокрема, PTX3 індукував активацію класичного та лектинового шляхів шляхом зв’язування з C1q, MBL, фіколіном-2 і здатний впливати на альтернативний шлях через CFH [10–12].

На відміну від інших пентраксинів, що виробляються печінкою в крові (тобто CRP), PTX3 може вивільнятися резидентними клітинами в осередку запалення, наприклад, з мононуклеарних фагоцитів, дендритних клітин, фібробластів і EC [9], діючи паракринним чином. [13]. PTX3 також зберігається в готовому вигляді в нейтрофілах, локалізується в специфічних гранулах і секретується у відповідь на розпізнавання мікробних фрагментів [14]. У EC експресія PTX3 легко індукується TNF- та IL-1, що забезпечує перехід від спокійного, протизапального фенотипу до прокоагулянту та прозапального стану, таким чином сильно регулюючи мікросудинну функцію [7, 8]. ]. З цієї причини рівні PTX3 були описані якхронічнийнирказахворювання, збільшення рівня білка PTX3 корелювало зі зниженням ШКФ та серцево-судинними ускладненнями, однак досі мало відомо про роль PTX3 на ранніх стадіях гострого I/R-індукованогониркатравми [15, 16].

Роль PTX3 у запальних захворюваннях нирок двовалентна, з іншого боку, білок може активувати класичні та лектинові шляхи, сприяючи початковому запаленню та пошкодженню [10–12]. З іншого боку, N-кінцевий домен PTX3 модулював активацію комплементу, послаблював рекрутинг лейкоцитів і пригнічував інтерстиціальний фіброз при гострому ураженні нирок, сприяючи відновленню тканин [17–20].

Комплемент відіграє ключову роль у патофізіології гострої травми, спричиненої І/Р.ниркатравма[21, 22]. На свинячій моделі ураження нирок I/R ми продемонстрували ключову роль активації системи комплементу в індукції EndMT і раннього фіброзу із залученням як класичного, так і лектинового шляхів [23]. Крім того, ми продемонстрували, що терапевтичне інгібування цих шляхів комплементу рекомбінантним C1-INH (rhC1INH) призвело до значного зниження відкладення комплементу зі зменшенням залучення інфільтруючих запальних клітин і тубулоінтерстиціального пошкодження [23]. Ці результати також підтвердили Delpech PO та інші [24]; значну модуляцію відкладень у клубочках і канальцях C1q, MASP і C4d оцінювали через 30 хвилин після реперфузії, що вказує на центральну роль C1-INH у протидії класичним і лектиновим шляхам.

У цьому дослідженні ми досліджували можливу участь PTX3 в опосередкуванні ранньої активації комплементу при пошкодженні ниркового I/R, характеризуючи різні клітинні джерела PTX3.

РЕЗУЛЬТАТИ

PTX3 експресується ендотеліальними клітинами та імунними інфільтруючими клітинами в моделі I/R у свиней

По-перше, ми досліджували присутність PTX3 у свинячої моделі теплого I/R-індукованого ураження нирок. Ми спостерігали дуже обмежені відкладення PTX3 у нормальній тканині (рис. 1A). Пошкодження I/R викликало дифузне відкладення PTX3 вже через 15 хвилин після реперфузії (Малюнок 1B, 1C) у тубулоінтерстиціальній зоні (Малюнок 1E), у перитубулярних капілярах (Малюнок 1D; стрілка) і на рівнях клубочків (Малюнок 1D). Відкладення PTX3 все ще можна було виявити через 1 годину після реперфузії на рівні перитубулярних капілярів (рис. 1G). У нашій попередній роботі [23] ми продемонстрували, що основними ознаками пошкодження I/R є апоптоз канальцевих епітеліальних клітин і рекрутування інфільтруючих запальних клітин, таких як моноцити, дендритні клітини та лімфоцити. Тим не менш, за допомогою рутинної гістологічної оцінки (додатковий малюнок 1) ми продемонстрували, що 30 хвилин теплої ішемії з наступною 15 хвилиною раннього інтерстиціального пошкодження канальців, спричиненого реперфузією, характеризується більшою капілярною конгестиєю та фокальною цитоплазматичною вакуолізацією епітелію ниркових канальців порівняно з базальним хвороба.

Щоб додатково охарактеризувати клітинну локалізацію відкладень PTX3 і оцінити його потенційний вплив на модуляцію запальної відповіді та пошкодження, ми виконали аналіз подвійного імунного фарбування та конфокальної мікроскопії. Експресію білка PTX3 було виявлено в більшості EC на перитубулярному (Рис. 2A) і клубочкових (Рис. 2B) рівнях капілярів через 15 хв після реперфузії.

Добре відомо, що пошкодження I/R характеризується підвищеною активацією вроджених і адаптивних імунних реакцій, включаючи переміщення запальних клітин у хворий орган, що ще більше посилює пошкодження через імунні клітини та систему комплементу [25]. У нашій свинячій моделі ми також спостерігали вже через 15 хвилин після реперфузії щільний запальний інфільтрат, що складається переважно з макрофагів і дендритних клітин в інтерстиціальній зоні канальців. Ми виявили, що обидві ці антигенпрезентуючі клітини характеризуються підвищеною експресією PTX3 порівняно з T0, оскільки спостерігали збільшення кількості CD163 plus /PTX3 plus (рис. 2E, 2F, 2K) і SWC3a plus /PTX3 plus (Рис. 2G, 2H, 2L) клітини на інтерстиціальних рівнях канальців на T15.

Експресія PTX3 може сприяти EndMT при травмі I/R

У попередніх спостереженнях ми продемонстрували, що пошкодження I/R було відповідальним за EndMT [26, 27], що характеризується придбанням мезенхімального фенотипу EC із втратою специфічних ендотеліальних маркерів і збільшенням мезенхімальних маркерів, таких як фібробласт-специфічні протеїн 1 (FSP-1), нейрональний кадгерин (N-кадгерин) і альфа-актин гладкої мускулатури (альфа-SMA). Таким чином, ми досліджували, чи може експресія PTX3 за допомогою EC впливати на цей процес. Як і очікувалося, коли ми досліджували експресію альфа-SMA як маркерів активованих міофібробластів, ми не виявили жодної спільної локалізації між альфа-SMA та PTX3 (рис. 2C, 2D). Навпаки, протягом усього періоду спостереження ми спостерігали збільшення тубулоінтерстиціального FSP1 плюс /PTX3 плюс міофібробластів (Рисунок 2K–2M).

Відкладення PTX3 пов'язані з активацією системи комплементу

Нарешті, ми дослідили, чи були відкладення PTX3 пов'язані з активацією комплементу. Дійсно, як і інші компоненти сімейства пентраксину, PTX3 може регулювати активацію класичного шляху комплементу [7]. Щоб визначити зв’язок між PTX3 і активацією комплементу, ми провели імунофлюоресценцію з подвійною міткою для оцінки експресії PTX3 і терміналу. Комплекс комплементу, C5b-9, з використанням антитіла, спрямованого проти С9-неоепітопу. Ми спостерігали значну спільну локалізацію відкладень PTX3 і C5b-9 (рис. 3A, 3B). Кінцевий комплекс комплементу був локалізований на перитубулярному рівні, а також у перитубулярних капілярах разом із шаром ендотеліальних клітин, як ми продемонстрували раніше [23, 28]. Оскільки PTX3 може активувати систему комплементу через класичний і лектиновий шляхи, ми оцінили відкладення C1q і MBL в паренхімі нирок. Цікаво, що відкладення C1q (Рис. 3E, 3F) і MBL (Рис. 3C, 3D) були в основному знайдені на інтерстиціальному та капілярному рівнях (Рис. 3C-3F), як описано раніше [23], і локалізовані з відкладеннями PTX3.

C1-інгібітор перешкоджає зв’язуванню PTX3 на ендотеліальних клітинах

У нашій попередній роботі [23] ми продемонстрували, що введення C1-інгібіторів призвело до значного зниження відкладення комплементу зі зменшенням залучення інфільтруючих запальних клітин і тубулоінтерстиціального пошкодження. Тому ми перевірили рівень експресії PTX3 у тварин, які отримували rhC1-INH. Ми виявили, що інфузія C1-інгібітора зменшила відкладення PTX3 у перитубулярних капілярах та на інтерстиціальному рівні через 15 хвилин після реперфузії (рис. 4A).

Крім того, щоб підтвердити гіпотезу про те, що зменшення відкладень PTX3 у тварин, які отримували rhC1-INH, було пов’язане з пригніченням пошкодження ендотелію, ми провели експерименти in vitro та оцінили зв’язування rhC1-INH і PTX3 з культивований EC за нормальних умов або за наявності клітинного стресу (рис. 4B). Аналіз FACS показав, що EC у нормальних умовах не зв’язував як rhC1-INH, так і PTX3. Згідно з нашим попереднім дослідженням [26], ми спостерігали підвищене клітинне зв’язування rhC1-INH на H2O2-стимульованому ЕС порівняно з базальними умовами. Крім того, за відсутності rhC1-INH, PTX3 може зв’язувати активований EC. Цікаво, що коли H2O2-активована EC була інкубована з PTX3 і rhC1-INH, ми спостерігали, що C1INH зміг захистити EC після блокування зв’язування PTX3.

ДИСКУСІЯ

У цьому дослідженні ми продемонстрували відкладення PTX3 на ранній фазі ураження нирок I/R та його можливий внесок у розвиток EndMT. Цікаво, що ми виявили, що PTX3-опосередкована активація комплементу відбувається головним чином на судинному рівні, локалізуючись спільно з C1q і MBL, молекулами розпізнавання класичних і лектинових шляхів каскаду комплементу.

Пошкодження I/R викликає виражену запальну реакцію, що характеризується активацією комплементу, безкисневими радикалами та продукцією прозапальних цитокінів, що призводить до активації ендотелію судин і периферичних лейкоцитів [29, 30]. Під час пошкодження І/Р активація комплементу призводить до відкладення компонентів комплементу на поверхневій мембрані пошкодженої та дисфункціональної ЕК з одночасним утворенням анафілатоксинів та посиленням запального процесу [31]. Під час запалення PTX3 швидко зростає і може відігравати центральну роль у модулюванні ендотеліальної відповіді. Дійсно, PTX3 було показано як потенційний біомаркер дисфункції ендотелію судин при кількох захворюваннях, включаючи хронічніниркахвороба, прееклампсія та ряд судинних захворювань [7, 16, 17, 32]. Ми також продемонстрували, що PTX3 бере участь в інших судинних ускладненнях, таких як недостатність артеріовенозної фістули у пацієнтів на гемодіалізі [33]. Ці спостереження свідчать про те, що PTX3 може бути сполучною ланкою між запальною відповіддю та ендотеліальною дисфункцією [34]. Відповідно до цих досліджень ми спостерігали відкладення PTX3 на ендотеліальному рівні вже через 15 хвилин після реперфузії (рис. 2A, 2B). Наші результати також продемонстрували, що на ранній фазі пошкодження I/R PTX3 локалізувався разом з маркером міофібробластів, FSP-1 (Рис. 2I, 2J), але не з альфа-SMA, маркером, який експресується активованим міофібробластом (Рис. 2C, 2D). Взяті разом, ці дані можуть свідчити про те, що ендотеліальна дисфункція та процес EndMT [35], які спостерігаються у I/R тварин [26], вперше виникли у EC, що експресує PTX3.

Зв'язок між PTX3 і запальними клітинами широко відомий. У цій статті ми спеціально зосередилися на притаманних ефектах PTX3 в інтерстиціальній інфільтрації лейкоцитів, які є основним джерелом PTX3 [36]. Зокрема, ми виявили макрофаги та дендритні клітини через 15 хвилин після реперфузії, які експресують більш високі рівні PTX3 (рис. 2E-2H). Ці дані узгоджуються зі зростаючою кількістю доказів, які свідчать про важливу роль вродженого імунітету в опосередкуванні раннього пошкодження при травмі I/R [23]. Рання активація комплементу в нирковій тканині після пошкодження I/R призводить до генерації кількох медіаторів запалення, які збільшують залучення імунних клітин [21, 23, 37, 38]. Нещодавні дослідження визначили PTX3 як один із основних компонентів мережі, яка організовує запальну реакцію, викликану травмою I/R [39]. У різних експериментальних моделях травми I/R PTX3 може виконувати подвійну протилежну роль у конкретних тканинах [40, 41]. Рання продукція PTX3 пов’язана з пошкодженням нирок, оскільки вона індукує ранню експресію молекул ендотеліальної адгезії та хемокінів, які прискорюють місцеву дезадаптивну запальну відповідь.

Навпаки, тривале місцеве виробництво PTX3 запобігає надмірному запаленню та дисфункції органів [41].

PTX3 є каскадним модулятором комплементу [9, 42]; це узгоджується з плейотропними властивостями PTX3, що вказує на подвійну роль PTX3 як модулятора або підсилювача вродженої імунної відповіді [39]. Спочатку PTX3 активує комплемент шляхом зв’язування C1q і MBL [43]; однак раннє посилення запалення має бути обмежено цільовою областю. Таким чином, PTX3, залучаючи фактор H або пригнічуючи ангіогенез, може також зменшити запальну відповідь і активацію комплементу, зберігаючи паренхіму нирок від запального пошкодження [43]. Хоча активація комплементу в I/R у гризунів в основному локалізована на канальцевому рівні [44], під час фази реперфузії ендотелій є основною мішенню для різних прозапальних агентів, включаючи медіатори комплементу [2]. Раніше ми продемонстрували, що на свинячій моделі пошкодження I/R, а також у пацієнтів з DGF активація системи комплементу відбувається на ранній фазі, на перитубулярних капілярах, всередині інтерстицію та на ендотелії клубочків [23]. Наші дані показали чітку спільну локалізацію відкладень C5b-9 на PTX3 плюс EC через 15 хвилин після реперфузії (рис. 3A, 3B). Таким чином, ендотелій нирок, здається, є поширеним місцем активації комплементу, опосередкованої PTX3-, на ранній фазі пошкодження I/R як у доклінічних, так і в клінічних умовах.

Взаємодія пентраксинів із C1q та його роль в активації класичного шляху комплементу добре описані [45–47]. У контексті вроджених імунних відповідей PTX3 може зв’язувати різні компоненти комплементу та модулювати активацію комплементу [43, 48]. PTX3 активує комплемент шляхом зв’язування C1q [49]. Наші результати на тваринній моделі чітко продемонстрували, що PTX3 може опосередковувати активацію класичного шляху шляхом взаємодії з C1q (рис. 3E, 3F). Крім того, PTX3 також модулює лектиновий шлях комплементу, як показано на малюнку 3C, 3D. MBL зв’язує PTX3 через свій колагеноподібний домен [45], а комплекси MBL/PTX3 рекрутують C1q і викликають відкладення C3 і C4 на поверхні клітин-мішеней.

Загалом ці результати свідчать про центральну роль PTX3 у посередництвіниркапошкодження при пошкодженні І/Р, що може мати важливі наслідки для терапії, спрямованої комплементом, при пошкодженні І/Р нирок.

У нашому попередньому дослідженні [26] ми досліджували участь комплементу в опосередкуванні активації ЕС за допомогою рекомбінантної форми C1-INH, потужного інгібітора протеаз класичного та лектинового шляхів комплементу (C1r, C1s, і MASP2). На тій самій тваринній моделі ми показали (рис. 4А), що терапевтичне інгібування обох шляхів за допомогою rhC1INH зменшує відкладення PTX3 у перитубулярних капілярах та на інтерстиціальному рівні через 15 хвилин після реперфузії. Ці дані, підтверджені результатами in vitro щодо EC (рис. 4B), привели нас до гіпотези, що rhC1INH може захищати пошкоджений EC після блокування зв’язування PTX3. У літературі є дані про зв’язування C1-INH з молекулами ендотеліальної адгезії, експресованими на активованому ендотелії, званими селектинами, зокрема Р- та Е-селектинами [50, 51]. Це зв’язування з EC може перешкоджати взаємодії ендотелію та лейкоцитів під час запалення, і це є ще одним важливим протизапальним механізмом [50, 51]. Таким чином, ми припустили, що rh-C1INH може зв’язувати активований EC і опосередковувати місцеву регуляцію активації комплементу та запального процесу. У наших попередніх дослідженнях ми продемонстрували участь комплементу в пошкодженні I/R та інших імуноопосередкованих захворюваннях нирок [38, 52–54]. Механізми активації комплементу в цій тваринній моделі можуть мати важливі наслідки для інтерпретації даних, які очікуються в умовах людини. Для успішної розробки терапевтичних втручань, спрямованих на активацію комплементу [36, 54], важливо встановити достовірність даних свиней щодо того, що відбувається в клінічних обставинах. Оскільки це дослідження обмежується обсерваційними дослідженнями, необхідні подальші експерименти, щоб окреслити взаємопов’язані механізми між PTX3 і комплементом, які можуть висвітлити нові терапевтичні стратегії. З наведених вище результатів наші дані підтверджують гіпотезу про те, що PTX3 може регулювати численні аспекти опосередкованого комплементом I/R ушкодження, таким чином представляючи собою потенційну терапевтичну мішень.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Модель свині з травмою нирок

Тваринна модель ураження нирок I/R була розроблена, як описано раніше [23]. Після схвалення етичним комітетом Міністерства охорони здоров’я 4-місячні самки великих білих свиней (n=8, n=4 для групи, 20 кг) пройшли перевірку експериментальна відкрита хірургічна процедура під загальним наркозом. Тварини голодували протягом 24 годин перед введенням у наркоз. Електрокардіограма, частота серцевих скорочень, насичення гемоглобіну киснем, склад дихальних газів, частота дихання, дихальний об’єм, тиск у дихальних шляхах, систолічний артеріальний тиск крові та центральний венозний тиск безперервно контролювали та записували автоматично (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finland) . Ліву ниркову артерію та вену ізолювали, і петлю судини розташовували навколо ниркової артерії за допомогою затискача під прямим кутом. Біопсія нирки була виконана до ішемії (T0). Потім індукували ішемічну фазу (30 хв) перетягуванням судинної петлі. Потім проводили кілька біопсій через 15, 30 і 60 хвилин після реперфузії; тварин умертвляли через 24 години після хірургічної процедури. Частину кожного зразка біопсії негайно заморозили в середовищі з оптимальною температурою різання (Tissuetek, Піттсбург, Пенсильванія) і зберігали в рідкому азоті. Іншу частину фіксували у забуференому формаліні (4 відсотки) протягом 12 годин і заливали в парафін за допомогою стандартних процедур.

Мікроскопічне дослідження

Залиті парафіном ниркові зразки з біопсії нирок використовували для звичайного гістологічного фарбування (H&E, періодична кислота-Шифф). Зображення були отримані за допомогою пристрою Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, США). Інтерстиціальні та клубочкові ураження канальців були оцінені за допомогою якісного аналізу двома спостерігачами (CD, MR), які не знали про походження

Антитіла

Первинні антитіла, використані в цьому дослідженні, розпізнають наступні антигени: PTX3 (MNB4: прямий проти N-кінцевого домену PTX3, Exira Life Sciences In., Larsen, Швейцарія); CD163 (моноцити/макрофаги, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (дендритні клітини, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (фібробласт-специфічний білок 1, Abcam, Кембридж, Великобританія); альфа-актин гладких м’язів (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Санта-Крус, Каліфорнія, США); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Велика Британія); MBL (3E7: прямо проти домену розпізнавання вуглеводів MBL, Hycult biotechnology, Uden, Нідерланди) і C9 неоантиген (aE11, Hycult biotechnology). Перехресну реактивність підтверджено шляхом попередньої інкубації специфічних антитіл перед їх використанням із людськими пептидами, які використовуються для їх отримання. Попередня інкубація скасувала специфічне фарбування на тканині свиней.

Імунофлюоресцентна тканинна та конфокальна лазерна скануюча мікроскопія

Характеристику та локалізацію сигналу PTX3 досліджували на замороженій тканині, включеній у середовище OCT (Tissue-Tek). Скела інкубували з 5% кролячої сироватки протягом 1 години при 37°C. Потім слайди інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі зі специфічними антитілами. Після трьох промивань у PBS предметні скла інкубували з відповідними вторинними антитілами (Alexa Flour 488 і 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Усі зрізи забарвлювали TO-PRO-3 (молекулярні зонди). Негативні контролі готували з невідповідними антитілами. Зрізи аналізували за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Німеччина). Кількість клітин, що проникають, вимірювали принаймні в 10 полях високої потужності (x630) на секцію двома незалежними спостерігачами, які не бачили походження предметних стекол. Остаточні підрахунки були середніми з двох показників. У жодному випадку мінливість між спостерігачами не перевищувала 20 відсотків.

Аналіз культури клітин і проточної цитометрії

Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (HUVEC, EC) були придбані в American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Italy). EC вирощували в рекомендованому середовищі EndoGro (Merck Millipore, Дармштадт, Німеччина). EC висівали з щільністю 1{{10}},000клітин/см2 і стимулювали обробкою H2O2 (3 відсотки, 1 година). Потім базальний і стимульований EC двічі промивали PBS і видаляли PBS-EDTA 2мМ і трипсином 0.001×. Потім клітини ресуспендували в PBS та інкубували відповідно з PTX3 (рекомбінантний людський PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Німеччина) (1 мкг/мл) або/та з rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 мкг /мл) протягом 60 хв. Після триразового промивання PBS 1X клітини ресуспендували в буфері для проточної цитометрії (FACS) (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, pH 7,2, 0,2 відсотка бичачого сироваткового альбуміну та 0,02 відсотка азиду натрію) та інкубували з реагентом, що блокує FCR (Miltenyi Biotec) протягом 10 хв при кімнатній температурі. Після блокування ЕК інкубували з C1-INH кролика проти людини (надано професором М. Даха, Лейденський університет, розведення 1/100) або/та з щурячим анти-PTX3 (MNB4, Exira Life). Sciences In., 1/20 розведення) при кімнатній температурі протягом 30 хв і промивають буфером FACS. Потім клітини інкубували з козячими анти-кролячими IgG PE (молекулярні зонди, розведення 1/100) або/з анти-щурячими IgG FITC (молекулярні зонди, розведення 1/100) при кімнатній температурі протягом 30 хвилин і тричі промивали. Клітини аналізували за допомогою FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, США) і програмного забезпечення Kaluza. Область позитивності визначали за допомогою моноклональних антитіл, відповідних за ізотипом, і загалом було отримано 104 події для кожного зразка. Було проведено три незалежних експерименти.

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення (SD) і порівнюються за допомогою дисперсійного аналізу або парного t-критерію Стьюдента, відповідно. Відмінності вважалися статистично значущими, коли значення р були меншими за 0.05. Дані аналізували за допомогою програмного пакету Statview (версія 5.0) (SAS Inc. Co., Кері, Північна Кароліна, США). Графіки відображалися за допомогою GraphPad Prism Software 5.

Скорочення

I/R: ішемія/реперфузія; ЕК: ендотеліальні клітини; PTX3: пентраксин 3; FSP-1: фібробластоспецифічний білок 1; N-кадгерин: нейрональний кадгерин; альфа-SMA: альфа-актин гладких м'язів.

АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК

CD координував дослідження, брав участь у імунологічному міченні та конфокальній мікроскопії ниркових зрізів, а також написав рукопис. AS та RF брали участь у розробці дослідження, зробили внесок у аналіз даних, провели експерименти in vitro та критично переглянули рукопис. MR та GSN виконали гістопатологічний аналіз зображення. LL, FS, AMC виконали тваринну модель ішемічно-реперфузійного ушкодження та допомогли переглянути рукопис. GL, PD та MB виконали всі хірургічні процедури на моделі свині та допомогли переглянути рукопис. MRD, P.vdP., C.vK. і FS переглянули рукопис.

PP, ER, GG, GS і LG критично переглянули рукопис. GC надав нові аналітичні інструменти, розробив і контролював дослідження. CD, AS та RF однаково зробили внесок у це дослідження. Усі автори долучилися до статті та схвалили подану версію.

ПОДЯКА

Ми дякуємо Клаудії Курчі з відділення нирок, діалізу та трансплантації, відділення невідкладної допомоги та трансплантації органів,

Університету Барі за чудову технічну допомогу.

КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ

Автори заявляють, що не мають конфлікту інтересів.

ФІНАНСУВАННЯ

Це дослідження було підтримано Університетом Барі «Альдо Моро», Міністерством охорони здоров’я Італії (GR 2016- 02362239 «Підхід на основі транскриптоміки для визначення прогностичних факторів і терапевтичних цілей для відстроченої функції трансплантата униркареципієнти трансплантації", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD отримав стипендію на цей проект) та Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori" - AIM-1810057-захід 2, наданий AS

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Bonventre JV, Yang L. Клітинна патофізіологія гострої ішеміїниркатравма. J Clin Invest. 2011 рік; 121:4210-21.

2. Jang HR, Rabb H. Вроджена імунна відповідь при гострій ішеміїниркатравма. Клін Імунол. 2009 рік; 130:41–50.

3. Ріклін Д, Хаджішенгалліс Г, Ян К, Ламбріс Дж.Д. Комплемент: ключова система для імунного нагляду та гомеостазу. Nat Immunol. 2010 рік; 11:785–97.

4. Турман Дж.М., Холерс В.М. Центральна роль альтернативного шляху комплементу в захворюваннях людини. J Immunol. 2006 рік; 176:1305-10. PMID: 16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Inflammaging and Complement System: A Link Between AcuteниркаТравма та хронічне пошкодження трансплантата. Передній імунол.

2020 рік; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Пентраксини у вродженому імунітеті: уроки з PTX3. Cell Tissue Res. 2011 рік; 343:237–49.PMID:20683616

7. Ceślik P, Hrycek A. Довгий пентраксин 3 (PTX3) у світлі його структури, механізму дії та клінічних наслідків. Аутоімунітет. 2012 рік; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): ендогенний модулятор запальної відповіді. Медіатори запалення. 2012 рік; 2012:920517.PMID:22577258

9. Гарланда С, Боттацці Б, Бастон А, Мантовані А. Пентраксини на перехресті між вродженим імунітетом, запаленням, відкладенням матриксу та жіночою фертильністю. Annu Rev Immunol. 2005 рік; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Довгий пентраксин PTX3 як прототип гуморального рецептора розпізнавання образів: взаємодія з клітинним вродженим імунітетом. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Синергія між фіколіном-2 і пентраксином 3 підвищує вроджене імунне розпізнавання та відкладення комплементу. J Biol Chem. 2009 рік; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 модулює імунофлогоз у пухлині мікрооточення і є прогностичним фактором для пацієнтів зі світлоклітинним нирково-клітинним раком. Старіння (Олбані, Нью-Йорк). 2020 рік; 12: 7585–602.PMID: 32345771

13. Соуза Д.Г., Амарал Ф.А., Фагундес К.Т., Коельо Ф.М., Арантес Р.М., Соуза Л.П., Мацук М.М., Гарланда К., Мантовані А., Діас А.А., Тейшейра М.М. Довгий пентраксин PTX3 має вирішальне значення для запалення тканин після

кишкова ішемія та реперфузія у мишей. Am J Pathol. 2009 рік; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. The humoral pattern recognition receptor PTX3 зберігається в гранулах нейтрофілів і локалізується в позаклітинних пастках. J Exp Med. 2007 рік; 204: 793–804. PMID: 17389238

15. Тонг М., Карреро Дж.Дж., Куреші А.Р., Андерстам Б., Хеймбюргер О., Барані П., Аксельсон Дж., Алвестранд А., Стенвінкель П., Ліндхольм Б., Суліман М.Е. Пентраксин 3 у плазмі у хворих на хроннирказахворювання: зв’язок із функцією нирок, білковою енергією, виснаженням, серцево-судинними захворюваннями та смертністю. Clin J Am Soc Nephrol. 2007 рік; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Підвищені рівні циркуляції та тканинна експресія пентраксину 3 при уремії: відображення ендотеліальної дисфункції. PLoS One. 2013 рік; 8: e63493.PMID:23658833

17. Преста М, Камоцці М, Сальваторі Г, Руснаті М. Роль розчинного рецептора розпізнавання образів PTX3 у судинній біології. J Cell Mol Med. 2007 рік; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Пентраксини PTX3 і SAP у вродженому імунітеті, регуляції запалення та ремоделюванні тканин. J Гепатол. 2016 рік; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Пентраксин 3 інгібує інтерстиціальний фіброз, спричинений гострим ураженням нирок, шляхом пригнічення шляху IL-6/Stat3. Запалення. 2014 рік; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. «Солодка» сторона довгого пентраксину: як глікозилювання впливає на функції PTX3 у вродженому імунітеті та запаленні. Передній імунол. 2013 рік; 3:407. PMID: 23316195