Батьківський нікотин покращує пам’ять про страхи, зменшує введення нікотину та змінює генетичні та нейронні функції гіпокампа у нащадків
Mar 21, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Ліза Р. Голдберг1*|Дана Зейд1*|Мунір Гюнес Кутлу2|Роберт Д. Коул3|Валерія Лаллай4|Асваті Себастьян5|Іштван Альберт5|Крісті Д. Фаулер4|Віней Паріх6|Томас Дж. Гулд1
1 Департамент біоповедінкового здоров’я, Університет штату Пенсільванія, Юніверсіті Парк, Пенсільванія
2Кафедра фармакології, Медична школа Вандербільта, Нашвілл, Теннессі
3 Фармацевтичний коледж, Університет Кентуккі, Лексінгтон, Кентуккі
4Кафедра нейробіології та поведінки, Каліфорнійський університет Ірвайн, Ірвайн, Каліфорнія
5 Біоінформатика, біохімія та молекулярна біологія, Університет штату Пенсільванія, Юніверсіті Парк, Пенсільванія
6Кафедра психології, Університет Темпл, Філадельфія, Пенсільванія
Анотація
Вживання нікотину залишається дуже поширеним серед тютюнових виробів та електронних сигарет, що споживаються в усьому світі. Проте все більше доказів трансгенераційної епігенетичної спадковості свідчить про те, що вживання нікотину може змінити поведінку та нейробіологію наступних поколінь. Ми протестували вплив хронічного впливу нікотину в батьків на мишей C57BL6/J на формування страху у нащадків F1 і F2, а також зникнення зумовленого страху та спонтанне відновлення, самовведення нікотину, холінергічну функцію гіпокампа, експресію РНК і метилювання ДНК у F1 потомство. Вплив нікотину на батьківщину був пов’язаний із посиленням контекстуального та викликаного страху, а також спонтанним відновленням спогадів про згаслий страх. Крім того, підсилення нікотином було знижено у мишей, які отримували нікотин, згідно з парадигмою самостійного введення. Ці поведінкові фенотипи поєднувалися зі зміненою реакцією на нікотин, посиленням зв’язування нікотинового ацетилхолінового рецептора гіпокампа, зниженням викликаних холінергічних струмів гіпокампа та зміною метилювання та експресії генів гіпокампа, пов’язаних із розвитком і пластичністю нервової системи. Аналіз експресії генів свідчить про вплив багатьох поколінь на ширші генні мережі, потенційно залучені до нейропластичності та психічних розладів. Зміни в обумовленні страху так само вказують на фенотипи, аналогічні тривожним розладам, схожим на посттравматичний стрес.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: холінергічний, гіпокамп, навчання, мультигенераційний, нікотин, трансгенераційний
1. ВВЕДЕННЯ
Накопичені дані свідчать про те, що вплив наркотичних речовин поширюється не тільки на людину, але й впливає на фізіологічні та поведінкові фенотипи потомства, яке не зазнало контакту.1-3 Характеристика впливу нікотину в поколіннях має вирішальне значення, враховуючи поширеність вживання тютюнових виробів4 і різке зростання використання електронних сигарет.5 Через вплив нікотину на холінергічні системи мозку вплив нікотину викликає помітні зміни у функції мозку, які можуть лежати в основі нікотинової залежності та сприяти підвищенню ризику психічних розладів, включаючи депресію6 і тривогу.7 Епігенетичні модифікації після холінергічної активації можуть допускають постійний вплив на функцію клітин і ланцюгів.8,9 До недавнього часу вважалося, що ці епігенетичні модифікації були стерті після встановлення зародкової лінії і, таким чином, ізольовані від наступних поколінь. Однак епігенетичні модифікації, включаючи метилювання ДНК, посттрансляційні модифікації гістонів і некодуючі РНК, отримані в одному поколінні, можуть бути успадковані в наступному поколінні.10,11 Ці епігенетичні модифікації можуть опосередковувати багатопоколінні та міжгенераційні ефекти впливу нікотину батьків на поведінку нащадків і нейробіологію. .
Дослідження на гризунах у кількох незалежних лабораторіях почали виявляти наслідки впливу нікотину для багатьох поколінь і за поколіннями. Ця робота наразі виявила вплив впливу нікотину в батьків на депресивні та тривожні фенотипи1, когнітивну гнучкість2, поведінку, подібну до синдрому дефіциту уваги та гіперактивності (СДУГ)3, і експресію генів.1,2 Наслідки багатьох поколінь і трансгенерацій Вплив нікотину може вплинути на ендофенотипи, пов'язані з нікотиновою залежністю та психічним здоров'ям. Наприклад, ми показали, що вплив нікотину модулює контекстне обумовлення страху, модель залежного від гіпокампу навчання страху, пов’язаного з уразливістю до розладів психічного здоров’я, таких як посттравматичний стресовий розлад (ПТСР) і залежність.12-14 Нікотин вплив на вивчення контекстуального страху модулюється гіпокампом.15,16 Ми виявили, що гострий вплив нікотину посилює залежне від гіпокампу навчання страху,15,17 погіршує згасання контекстуального страху,18,19 та посилює спонтанне відновлення контекстуального страху після вимирання.18 Однак багатопоколінні та трансгенераційні ефекти впливу нікотину батька на ці фенотипи не були вивчені. Більше того, жодні попередні дослідження не характеризували вплив нікотину на холінергічну функцію у багатьох поколіннях. Багатопоколінне успадкування відноситься до фенотипів, що виникають у поколінні, яке безпосередньо слідує за особами, які зазнали впливу, у той час як трансгенераційне успадкування складається з опосередкованого зародковою лінією успадкування епігенетичної інформації між поколіннями за відсутності прямих впливів навколишнього середовища, які призводять до фенотипових варіацій.11 Тут ми розглянули обидва покоління трансгенераційний вплив впливу нікотину на батьківщину на контекстне навчання та навчання страху за сигналом у поколіннях F1 і F2, а також на самовведення нікотину, зв’язування нікотинового ацетилхолінового рецептора (nAChR) у гіпокампі, холінергічне функціонування гіпокампа, експресію генів у гіпокампі та метилювання ДНК у гіпокампі. покоління F1. Ми припускаємо, що вплив нікотину на батьківщину вплине на формування страху, експресію генів гіпокампа та функціонування нащадків і внуків.
ефекти екстракту цистанхи
2 МЕТОДИ ТА МАТЕРІАЛИ
2.1 Суб’єкти
Суб’єктами були самці та самки мишей C57BL/6J (віком 8–20 тижнів, лабораторія Джексона, Бар-Харбор, ME). За винятком житла для гаремного розведення, усіх тварин утримували групою з 12-годинним циклом світла/темряви та необмеженим доступом до їжі та води. Під час самостійного введення суб’єкти обмежувалися їжею від 85 до 90 відсотків від їхньої маси тіла, що харчувалися вільно, а воду надавали ad libitum. Усі поведінкові тести проводилися між 9:00 ранку та 6:00 вечора. Усі процедури були проведені відповідно до Посібника NIH з догляду та використання лабораторних тварин і схвалені комітетами IACUC Університету штату Пенсильванія, Університету Темпл або Каліфорнійського університету в Ірвайні.
2.2 Вплив нікотину на батьків
Самці (8 тижнів) отримували 0.9% стерильного фізіологічного розчину або гідротартратної солі нікотину (12,6 мг/кг/день, вільна основна маса – Fisher Scientific, Waltham, MA або MP Biomedical, Santa Ana, CA), розчинених у 0.9% стерильного фізіологічного розчину, що вводиться підшкірно за допомогою осмотичних міні-насосів (Alzet, модель 1004, Durect, Купертіно, Каліфорнія) протягом 28 днів. Ця доза створює рівні нікотину та котиніну в плазмі, які можна порівняти з тими, що спостерігаються у помірних курців.20,21
2.3 Покоління мишей F1 і F2
Період напіврозпаду нікотину у мишей становить приблизно 6 хвилин.22 Раніше було показано, що вплив відміни нікотину зникає через 4 дні після виведення нікотину.23-25 Таким чином, 4-денна затримка між лікуванням нікотином і розведення було реалізовано для забезпечення системного виведення нікотину перед розведенням. Мишей-самців поміщали в клітини з двома неінфікованими самками C57BL/6 J (віком 8–20 тижнів) на 2 тижні для отримання потомства F1. Миші F2 були створені шляхом спарювання наївних самців мишей F1 із наївними самками.
2.4 Обумовлення страху
Процедури викликання страху та зникнення були детально описані раніше.19 Коротко, мишей тренували та тестували в камерах із шумопоглинанням (18,8 × 20 × 18,3 см, фоновий шум 65 дБ; MED Associates, St. Albans, VT). Мишей F1 і F2 обумовлювали страх двома парами умовних стимулів (CS, 30 с, білий шум 85 дБ)–безумовних стимулів (США, 2 с, 0,57 мА поштовхи стопи), розділених 120 секундами. Щоб дослідити гострий вплив нікотину на формування страху у мишей F1 і F2, потомство отримувало гострий нікотин (0,09 мг/кг, маса вільної основи NIC, ip; нікотин гідротартратна сіль, Fisher Scientific) або фізіологічний розчин (SAL) за 2-4 хвилини до на навчання та тестування. Через двадцять чотири години після тренування мишей повертали в тренувальний контекст на 5 хвилин, щоб оцінити контекстне заморожування. Після контекстного тестування мишей помістили в різні камери для оцінки навчання страху за сигналом. Експериментатори, які не бачили умов, оцінювали замерзання, визначене як відсутність довільних рухів, окрім дихання, за допомогою неупередженого методу вибірки часу.19 Щоб дослідити потенційні ефекти стелі під час тестування за сигналом, окрема когорта мишей F1 пройшла ідентичне навчання лише з одним CS-US сполучення, а також контекстне згасання страху та спонтанне відновлення також досліджувалися. Зникнення страху відбулося протягом п’яти послідовних сеансів, починаючи з наступного дня після контекстного тестування та тестування страху за сигналами. Після останнього сеансу вимирання мишей не турбували в їхніх домашніх клітках протягом 7 днів, а потім повторно протестували в контексті навчання для спонтанного одужання. Щоб визначити, чи були будь-які спостережувані відмінності в обумовленні страху через різницю в чутливості до шоку, тривозі або ширшому дефіциті навчання, самців і самок тварин NIC- і SAL-побатьків додатково тестували у відкритому полі, чутливість до шоку, піднятий плюс лабіринт ( EPM) і нові парадигми розпізнавання об’єктів (повні методи та результати див. у Допоміжній інформації).
2.5 Самостійне введення їжі та внутрішньовенного введення нікотину
A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 гранул за сеанс протягом трьох наступних сеансів), суб’єктам катетеризували яремну вену під анестезією ізофлураном (1–3 відсотки)/кисневими парами, як описано раніше.26 Мишам дозволяли більше або дорівнювати 72 годинам для відновлення після операції до доступу. щоб знову відповісти за харчову винагороду. Відновлення відповіді на їжу гарантує, що миші достатньо відновилися після внутрішньовенної операції та демонструють нормальну оперантну реакцію після затримки доступу до оперантних камер. Потім мишам дозволили самостійно вводити нікотин внутрішньовенно (в/в) протягом 1-годинних щоденних сеансів, 6-7 днів на тиждень (гідротартрат нікотину, розчинений у 0.9% стерильному фізіологічному розчині, {{1{ {12}}}}.03 мг/кг/інфузія, вільна основна маса; MP Biomedical, Санта-Ана, Каліфорнія). Нікотин внутрішньовенно доставлявся шприцевим насосом Razel (Med Associates). Кожен сеанс мав два висувних важеля (один активний, один неактивний). Виконання критеріїв відповіді на активному важелі призвело до введення внутрішньовенної інфузії нікотину (0.{{20}}об’єм інфузії 3 мл; графік FR5TO20 с). Відповіді на неактивний важіль були записані, але не мали запланованих наслідків. Після восьми сеансів збору при 0,03 мг/кг/інфузії дозу інфузії змінили на 0,1 мг/кг/інфузію протягом шести сеансів. Для кожної дози для статистичного аналізу використовували середнє споживання за останні три сеанси. Катетери щодня промивали фізіологічним стерильним фізіологічним розчином (0,9% мас./об.), що містить гепарин (100 одиниць USP/мл). Прохідність катетера перевіряли за допомогою Brevital (metohexital sodium, Eli Lilly, Indianapolis, IN) після фази самостійного введення нікотину. Щоб оцінити поведінку, пов’язану з рецидивом, мишей перевірили на інкубацію тяги після сеансу відразу після останньої дози 0,1 мг/кг/інфузії внутрішньовенного самостійного введення нікотину; у цій процедурі мишам дозволяється реагувати на активний важіль, але не отримують вливання нікотину. Під час першого базового інкубаційного сеансу (день 1) мишей помістили в оперантні камери за графіком FR5TO20 с із умовною активацією світлового сигналу. Після цього мишей помістили в домашні клітки на 20 днів. На 21-й день утримання мишей перевіряли на інкубацію тяги, причому активний важіль підсвічувався за графіком FR5TO20 с. Дослідження проводилися експериментаторами, які не бачили групових умов, а поведінкові реакції автоматично реєструвалися програмним забезпеченням MedAssociates.
2.6 Зв'язування нікотинового ацетилхолінового рецептора
Аналіз зв’язування радіоліганду16 проводили з використанням гіпокампу 8-тижневих мишей NIC-Sired (5 M і 10F) і SAL-Sired (9 M і 6F) F1. Зразки гомогенізували за допомогою буфера для лізису (5 мМ Tris плюс 5 мМ EDTA плюс 5 мМ EGTA), центрифугували при 100 000 g протягом 30 хвилин при 4 градусах, ресуспендували в буфері для лізису та знову центрифугували. Гранули ресуспендували в буфері Tris/10% сахарози та інкубували з [3H]епібатидином ([3H]EB) (~2 нМ на основі 27, 28) (питома активність 54,1 Кі/ммоль, PerkinElmer, Бостон, Массачусетс) протягом 1 годину при кімнатній температурі. Для зв’язування nAChR було обрано [3H]EB, оскільки попередні результати показали, що гетеромерні 4 2 nAChR гіпокампа опосередковують вплив нікотину на формування страху.17 Неспецифічне зв’язування оцінювали в присутності 300 мкМ нікотину (гідротартратна сіль нікотину). розчинений у трис-буфері, концентрація вільної основи). [3H]EB-зв’язані nAChR були відфільтровані (24-лунковий збирач клітин, Brandel Co, Gaithersburg, MD), а рідинний сцинтиляційний лічильник (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) виміряв радіоактивність фільтра. Специфічне зв’язування, виражене у фмоль/мг тканини, розраховували як різницю між загальним і неспецифічним зв’язуванням.16
2.7 Амперометричні холінергічні записи in vivo
Окрему когорту мишей віком від 10 до 20 тижнів NIC-Sired і SAL-Sired F1 використовували для оцінки змін холінергічної передачі в гіпокампі за допомогою амперометрії. Керамічні мікроелектроди (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY) з 4 (15 × 333 мкм) платиновими ділянками запису, розташованими попарно (верхній і нижній), були покриті холіноксидазою (номер ЄС 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), як повідомлялося раніше. 29 Електроди були електрополімеризовані з мета-фенілендіаміном (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) для підвищення селективності для виявлення струмів холіну. Мікроелектроди з чутливістю більше або дорівнює 3 пА/мкМ і межею виявлення менше або дорівнює 400 нМ для холіну використовувалися для забезпечення чутливого індексу вивільнення ацетилхоліну (ACh).30 Тварин анестезували уретаном (1,2-1,5 г/кг, ip), а вкриті ферментом мікроелектроди стереотаксично опускали в дорсальний (A/P -1,7 мм, M/L ± 1,5 мм, D/V -2,3 мм) або вентральний (A/P -3,1 мм, M /L ± 3,0 мм, D/V -4,3 мм) гіпокамп. Вентральний і дорсальний гіпокамп оцінювалися окремо, оскільки вони по-різному сприяють контекстному обумовленню страху: вентральний гіпокамп (vHPC) відіграє більш помітну роль у асоціації та вираженні страху, тоді як дорсальний гіпокамп (DHCP) є критичним для контекстної пам’яті.31 Ag/ Електроди порівняння AgCl були імплантовані в контралатеральний ростральний відділ головного мозку.
Амперометричні записи проводилися з частотою 2 Гц із застосуванням фіксованого потенціалу плюс 0,7 В, і дані були оцифровані (потенціостат FAST-16, Quainton, Nicholasville, KY). Фонові струми стабілізували протягом 60 хвилин, потім ліки вносили в гіпокамп за допомогою скляного капіляра (діаметр наконечника: 15 мкм), прикріпленого до електрода. Вивільнення ACh, викликане деполяризацією, вимірювали шляхом застосування або коротких імпульсів калію (KCl 70 мМ; 100 нЛ) або NIC (1 мМ вільної основи, нікотину тартрат; 100 нЛ) під тиском від 2 до 10 psi кожні 2 хвилини. Записи були врівноважені для області гіпокампу (спинної або вентральної) та препарату (калій або NIC). Амплітуди холінового сигналу вимірювали за зміною струму в покритому ферментом каналі порівняно з базовим струмом і конвертували в мкМ еквіваленти холіну на основі калібрування in vitro. Для усунення артефактів було прийнято самореференсування шляхом віднімання струмів із дозорних каналів.29 Розташування мікроелектродів було підтверджено фарбуванням за Нісслем корональних зрізів гіпокампу (рис. S1). Для статистичного аналізу використовували середні значення двох відповідей на маніпуляцію препаратом на тварину.
2.8 Статистичний аналіз
Статистичні порівняння проводили за допомогою SPSS (IBM, Armonk, NY) або GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Викиди визначалися значеннями на 2 стандартних відхилення вище середнього. Якщо виявлено викид, інформація буде включена в розділ результатів. Критерій значущості встановлено на рівні=0,05. Спочатку проводився статистичний аналіз із врахуванням статі як фактора для всіх експериментів, що перевіряли потомство як чоловічої, так і жіночої статі. Аналізи були згорнуті за статтю, якщо тристороння або двостороння взаємодія зі статтю не була виявлена (P> 0,05). Дані аналізували за допомогою t-критерію, 1- або 2-факторного дисперсійного аналізу залежно від обставин. Суттєві основні або взаємодіючі ефекти супроводжувалися ретроспективними порівняннями ЛСД. За результатами дисперсійного аналізу повторних вимірювань проводилося постфактум порівняння Бонферроні з поправкою на багаторазові порівняння. Якщо були виявлені нерівні дисперсії, використовувався t-критерій Велча для нерівних дисперсій, а ступені свободи округлювались у меншу сторону.
2.9 Виділення РНК/ДНК
Дорослих мишей F1 (віком 8 тижнів; n=3 M і 3 F на групу) піддали евтаназії через вивих шийки матки. Гіппокампи швидко розрізали на вентральну та дорсальну частини (у співвідношенні 1:1), об’єднували з лівого та правого боків і швидко заморожували на сухому льоду. ДНК і РНК були спільно виділені та очищені за допомогою AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Концентрацію та якість РНК і ДНК оцінювали за допомогою NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) і Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Для виділення РНК мінімальне число цілісності РНК (RIN) становило 8,5.
2.10 Аналіз транскриптомів через
Бібліотеки секвенування РНК були підготовлені Інститутом Хака в Центрі геноміки наук про життя (Університет штату Пенсільванія) для односторонніх зчитувань 150 bp за допомогою набору для підготовки ланцюгової бібліотеки мРНК Illumina TruSeq (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія) і секвенували на Illumina HiSeq 2500 у режимі швидкого циклу (три послідовних цикли з приблизно 10 мільйоном зчитувань на зразок). Якість файлів FASTQ було перевірено за допомогою FASTQC і вони мали середні показники якості за зчитування Phred більше 30 (тобто менше 0,1 відсотка помилки послідовності). Файли FASTQ були вирівняні за еталонним геномом миші (mm10; UCSC Genome Browser) за допомогою TopHat (v2.1.0)32 на Galaxy Project33. Запонки та Cuffmerge (v2.2.1.0)34 використовувалися для складання транскриптів із зіставлених читань і об’єднання файлів стенограм для остаточного складання транскриптома. Значення P, скориговані на частоту помилкових відкриттів (FDR), були розраховані для диференціальної експресії генів із зразків NIC-Sired і SAL-Sired за допомогою Cuffdiff (v2.2.1.3),34 зі стандартним пороговим значенням FDR 0,05.35 Набори даних транскриптому були депоновані. до Gene Expression Omnibus.
2.11 Аналіз збагачення
Диференційно експресовані гени аналізували за допомогою аналізу шляхів винахідливості (IPA, запуск у грудні 2018 р.; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Редвуд-Сіті, Каліфорнія, США)36, щоб виявити потенційне збагачення асоціативних біологічних мереж. Параметри циклу вказували максимум 35 молекул на мережу генів і обмежували аналіз тканиною ЦНС ссавців або клітинними лініями. Статистичну значущість для збагачення визначали за допомогою правостороннього точного критерію Фішера з поправкою на багаторазове тестування.
2.12 Цільове секвенування бісульфіту
ДНК, спільно ізольовану з РНК (див. Розділ 2.9), використовували для аналізу метилювання ДНК. RNA-seq ідентифікувала 952 та 162 диференціально експресованих генів у vHPC та DHCP відповідно. Унікальні гени 1010 із цих комбінованих списків були відібрані для збагачення бісульфітом-seq за допомогою спеціальної системи збагачення SeqCap Epi (Roche, Pleasanton, CA, США; таблиця S1).38 Цільовий бісульфіт секвенування було виконано в Інституті Хака штату Пенсільванія Головного центру геномики наук про життя. Бібліотеки були створені з використанням набору KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Вілмінгтон, Массачусетс). Бібліотеки, перетворені на бісульфіт натрію, ампліфікували та збагачували за допомогою ПЛР для вибраних геномних ділянок за допомогою спеціального набору зондів захоплення (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, США). Захоплену ДНК секвенували на Illumina HiSeq 2500, використовуючи зчитування парних кінців 100 нт. Якість файлів FASTQ було перевірено за допомогою FASTQC. Послідовності адаптерів Ilumina були видалені, а основи низької якості були обрізані за допомогою Trimmomatic.39 Обрізання основи низької якості було виконано за допомогою підходу ковзного вікна, обрізання, коли середня якість у вікні з чотирма парами основ падала нижче порогового значення 20, з мінімальна довжина зчитування 35. Після обрізання файли FASTQ мали середнє значення показників якості Phred за зчитування більше 30 (тобто менше 0,1 відсотка помилки послідовності). Обрізані зчитування були зіставлені з еталонним геномом миші (mm10) за допомогою Bowtie240, реалізованого в Bismark.41 Екстракт метил_ у Bismark використовувався для отримання інформації про метилювання CpG і для створення звітів про метилювання. MethylKit42 використовувався для аналізу диференціально метильованих областей (DMR). Статус метилювання підсумовувався за неперекриваючими вікнами з 500 пар основ і проводився диференційний аналіз метилювання зі стандартним FDR 0,05.35 Набори даних були депоновані в Gene Expression Omnibus.
Користь екстракту цистанки
3 РЕЗУЛЬТАТИ
3.1 Батьківський нікотин посилює контекстне обумовлення страху та скасовує гостре нікотинове посилення контекстного страху у мишей покоління F1 та F2
Самці та самки мишей F1 із NIC-Sired та SAL-Sired після гострого введення SAL або NIC (0.09 мг/кг внутрішньовенно, малюнок 1A) викликали страх. Повний аналіз базової лінії, попереднього CS та заморожування CS включено в Додаткову інформацію. 3-факторний дисперсійний аналіз контекстуального заморожування з лікуванням батька, гострим медикаментозним лікуванням і статтю як факторами виявив значну взаємодію батько × гострий медикаментозний курс (F(1,36)=32.75, P <.{{27) }}01).="" оскільки="" не="" було="" суттєвої="" взаємодії="" між="" статтю="" та="" батьком="" або="" гострим="" медикаментозним="" лікуванням,="" було="" виконано="" двофакторний="" дисперсійний="" аналіз="" за="" статтю="" та="" виявлено="" значущу="" взаємодію="" між="" батьком="" та="" гострим="" медикаментозним="" лікуванням="" (f(1,40)="20).96" ,="" p="">< 0,001).="" астрономічні="" порівняння="" показали,="" що="" миші="" nic-sired="" f1,="" які="" отримували="" фізіологічний="" розчин,="" продемонстрували="" посилене="" контекстне="" обумовлення="" страху="" порівняно="" з="" мишами="" sal-sired="" f1,="" які="" отримували="" фізіологічний="" розчин="" (t20="2.73," p=""><.05). згідно="" з="" попередніми="" висновками43,="" гострий="" нік="" при="" дозі="" 0,09="" мг/кг="" викликав="" посилене="" контекстне="" формування="" страху="" у="" мишей="" sal-sired="" (t22="2.99," p=""><.01). однак="" гострий="" нік="" при="" дозі="" 0,09="" мг/кг="" порушував="" контекстуальне="" формування="" страху="" у="" мишей,="" які="" мали="" нік="" (t18="3.36," p=""><.01). загалом="" рівні="" заморожування="" контексту="" у="" мишей="" nic-sired="" nic="" були="" порівнянними="" з="" тими,="" які="" спостерігалися="" у="" мишей="" sal-sired="" sal="" при="" обох="" 0,09="" мг/кг="" (p=""> 0,05).
Крім того, самців і самок тварин з NIC- і SAL-побатьками перевіряли на чутливість до удару (Малюнок S2), піднятий плюс лабіринт (EPM, Малюнок S3), відкрите поле та нові парадигми розпізнавання об’єктів (Малюнок S4, повну інформацію про методи див. у допоміжній інформації). і результати). За винятком NIC-Sired самок у EPM (у яких спостерігалася підвищена поведінка, подібна до тривоги) і NIC-Sired тварин у чутливості до шоку (у яких спостерігалася знижена вокальна реактивність на шок, що не вплинуло б на посилений фенотип навчання страху, характерний для кількох поколінь), відмінностей немає. були виявлені між мишами NIC- та SAL-Sired.
МАЛЮНОК 1. Батьківський нікотин посилює контекстне зумовлення страху та послаблює гостре нікотинове посилення зумовлення страху. Контекстне заморожування було значно вищим у NIC-Sired плюс SAL порівняно з контролем SAL-Sired плюс SAL. Гострий рівень нікотину при рівні 0,09 мг/кг посилив контекстне обумовлення страху у SAL-Sired, але значно зменшив контекстне обумовлення страху у тварин NIC-Sired (n=10-12 на групу). B. Контекстне заморожування було значно вищим у NIC-grandsire плюс SAL порівняно з контрольною групою SAL-grandsire плюс SAL (n=9-11 на групу). Смуги помилок вказують на стандартну помилку середнього (SEM), *P <>
Щоб визначити, чи зберігається погіршене контекстне формування страху в наступному поколінні (F2), мишей-самців і самок F2 NIC-grandsire і SAL-grandsire виводили з наївних мишей-самців F1. Повний аналіз базової лінії, попереднього CS та заморожування CS включено в Додаткову інформацію. Тристоронній дисперсійний аналіз контекстуального заморожування проводився з лікуванням дідуся, гострої медикаментозної терапії та статтю як незалежними факторами (рис. 1B). Оскільки не було суттєвої взаємодії між статтю та батьком або гострою медикаментозною терапією, було виконано двосторонній дисперсійний аналіз за статтю. Було виявлено значний основний ефект батька (F(1,37)=9.88, P <.01), і="" пост-гок="" порівняння="" показало,="" що="" миші="" nic-grandsire="" демонстрували="" посилене="" контекстне="" обумовлення="" страху="" порівняно="" з="" з="" мишами="" sal-grandsire="" (t39="3.04," p=""><0,01). крім="" того,="" миші="" sal-grandsire,="" яким="" вводили="" гострий="" nic,="" посилювали="" контекстуальне="" обумовлення="" страху="" (t19="2.41," p="0.026)," але="" гострий="" nic="" не="" посилював="" контекстуальне="" обумовлення="" страху="" у="" мишей="">
МАЛЮНОК 2. Батьківський нікотин посилює кондиціонування викликаного страху та спонтанне відновлення пам’яті про страх. Щоб дослідити потенційні ефекти обмеження під час контрольного тестування, окрема когорта мишей F1 пройшла ідентичний тренінг лише з одним поєднанням CS-US. У мишей NIC-Sired було посилено як контекстне, так і викликане страхом мишей порівняно з мишами SAL-Sired, навчених з 1 парою CS-US (n=8-10 на групу). B. Вплив нікотину на батьків не вплинув на зникнення контекстуального страху, але посилив спонтанне відновлення пам’яті про страх через 7 днів після останнього сеансу згасання (n=8-10 на групу). Смуги помилок вказують на стандартну помилку середнього (SEM), *P <>
3.2 Батьківський нікотин посилює кондиціонування викликаного страху у мишей покоління F1
Щоб перевірити, чи ефект стелі перешкоджає виявленню групових відмінностей для викликаного страху (див. Додаткову інформацію), окрему групу мишей F1 навчили з однією парою CS-US. У цій когорті було виявлено посилення контекстуального обумовлення страху (t7=3.21, P <.05), а="" також="" обумовлення="" страху="" за="" сигналом="" у="" мишей="" nic-sired="" (t6="2.41," p=""><. 05;="" малюнок="">
3.3. Батьківський нікотин посилює спонтанне відновлення пам’яті про контекстний страх у мишей покоління F1
Когорту мишей F1, які отримали одну пару CS-US, згодом перевірили на зникнення та спонтанне відновлення пам’яті про контекстний страх. Миші F1 NIC-Sired продемонстрували нормальне згасання страху, але показали посилене спонтанне відновлення контекстної пам’яті страху порівняно з мишами SAL-Sired (t7=3.38, P <0.05; рис.="">
3.4 Нікотин від батька зменшує самостійне введення нікотину
Перед навчанням самостійному введенню нікотину суб’єктів аналізували на їхню здатність вивчати оперантне завдання для отримання харчової винагороди, і жодних відмінностей не спостерігалося (Додаткова інформація, рис. S5). Щоб перевірити потенційний вплив впливу нікотину на батьків на посилення нікотину у нащадків F1, було оцінено отримання внутрішньовенного самостійного введення нікотину (0.03 мг/кг/інфузія) у двофакторному дисперсійному аналізі змішаного дизайну, який визначив основний ефект сеансу (F(7,119)=13.60, P <.001) і="" сеанс="" ×="" взаємодія="" лікування="" батька="" (f(7,119)="5.00," p="">< .001).="" проте="" ретельні="" тести="" не="" виявили="" жодних="" статистично="" значущих="" відмінностей="" між="" групами="" на="" кожному="" з="" восьми="" сеансів="" збору="" даних="" (рис.="" 3a).="" потім="" було="" проаналізовано="" кількість="" активних="" і="" неактивних="" натискань="" важеля,="" щоб="" визначити,="" чи="" зберігали="" групи="" протягом="" сеансу="" перевагу="" активного="" важеля="" під="" час="" збору="" даних="" (малюнок="" 3b),="" що="" виявило="" основний="" ефект="" сеансу="" (f(7238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" і="" взаємодія="" сеанс="" ×="" лікування="" батька="" (f(21,238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc="" аналіз="" показав,="" що="" групи="" відрізнялися="" в="" перший="" день="" самостійного="" застосування="" нікотину.="" група="" nic-sired="" показала="" більш="" активне="" натискання="" важеля="" порівняно="" з="" групою="" sal-sired.="" цей="" ефект="" може="" вказувати="" на="" вищий="" рівень="" поведінки,="" пов’язаної="" з="" пошуком="" наркотиків="" у="" перший="" день="" контакту,="" наполегливість="" реакції="" на="" винагороду="" за="" їжу="" та/або="" зниження="" когнітивної="" гнучкості="" при="" переході="" реакції="" з="" їжі="" на="" наркотики.="" однак="" ця="" різниця="" не="" зберігалася="" протягом="" наступних="" сеансів.="" миші="" sal-sired="" демонстрували="" сталу="" статистично="" значущу="" перевагу="" активного="" важеля="" над="" неактивним="" важелем="" (post="" hoc="" p="">< 0,01),="" але="" миші="" nic-sired="" не="" демонстрували="" такої="" збереженої="" переваги="" для="" сеансів="">
МАЛЮНОК 3 Нікотин від батька зменшує самостійне введення нікотину. Миші-самці NIC- та SAL-Sired (n=9-10 на групу) не відрізнялися за загальною кількістю інфузій, отриманих для кожного сеансу протягом періоду збору на 0 .03 мг/кг/інфузійна доза. B. Під час збору даних кількість активних і неактивних натискань на важіль суттєво відрізнялася під час першого сеансу, причому миші NIC-Sired nicotine демонстрували більшу кількість активних натискань важеля порівняно з мишами SAL-Sired. Однак під час наступних сеансів миші NIC-Sired зменшили реакцію, що призвело до відсутності суттєвих відмінностей між їхньою кількістю активних і неактивних натискань важеля в сесіях 3-8. На відміну від цього, тварини SAL-Sired демонстрували стабільну статистично значущу перевагу активному важелю над їх неактивним важелем. C. Середня кількість інфузій нікотину протягом трьох останніх сеансів збору суттєво не відрізнялася між мишами NIC- та SAL-Sired. D. При помірній дозі 0,1 мг/кг/інфузію миші NIC-Sired самостійно вводили значно меншу кількість інфузій нікотину. E. Оцінка інкубації тяги виявила значне збільшення відповіді на раніше активний важіль після 21 дня утримання лише для мишей SAL-Sired. Смуги помилок вказують на стандартну помилку середнього (SEM), *P <>
Для подальшого вивчення потенційних групових відмінностей, контролюючи варіабельність протягом початкової фази отримання, було вивчено середню кількість інфузій нікотину протягом останніх трьох сеансів, час, коли суб’єкти демонстрували більш узгоджену реакцію на нікотин (рис. 3C). Групи суттєво не відрізнялися за середньою кількістю інфузій нікотину (P > 05). Після цього мишей перевели на дозу нікотину 0,1 мг/кг/інфузію, яка раніше була показана як краща для дорослих мишей C57BL6/J.44 При цій дозі миші NIC-Sired самостійно вводили меншу кількість інфузій (t{ {7}}.20, P <.05; малюнок="" 3d).="" для="" інкубації="" поведінки="" тяги,="" яка="" вважається="" мірою="" посиленого="" пошуку="" наркотиків="" під="" час="" утримання,="" двофакторний="" дисперсійний="" аналіз="" змішаного="" дизайну="" з="" сеансом="" і="" лікуванням="" батька="" визначив="" основний="" ефект="" сеансу="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p=""><.001). у="" той="" час="" як="" тварини="" sal-sired="" демонстрували="" ефект="" інкубації="" з="" більшою="" реакцією="" на="" 21="" день="" утримання="" порівняно="" з="" днем="" 1,="" миші="" nic-sired="" не="" демонстрували="" збільшення="" поведінки,="" пов’язаної="" з="" пошуком="" нікотину="" (p=""><>
3.5 Вплив нікотину на батьківщину змінює холінергічний зв’язок і функцію гіпокампа
Високоафінне зв’язування гетеромерного nAChR гіпокампу посилювалося у мишей NIC-Sired F1 (t28=2.14, P <.05; sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0,044).="" одного="" суб’єкта="" (nic-sired)="" було="" вилучено,="" оскільки="" значення="" зв’язування="" були="" на="" два="" стандартних="" відхилення="" вищими="" за="">
Амперометричні записи струмів ACh, викликаних калієм і нікотином, оцінювали в F1 dHPC і vHPC. Через неоднакові розміри вибірки для кожної статі стать не була включена як попередній фактор у ці аналізи. Холінергічні сигнали, спричинені деполяризацією KCl, не відрізнялися між мишами SAL- та NIC-Sired у dHPC (P > 0,05; рис. 4A); однак місцеве застосування нікотину призвело до значного зниження амплітуди холінергічного сигналу у мишей NIC-Sired (t8=2.33, P <.05; рис.="" 4c).="" у="" vhpc="" вивільнення="" ach="" було="" зменшено="" у="" мишей="" nic-sired="" після="" застосування="" kcl="" (t8="2.60," p=""><.05; рисунок="" 4b)="" або="" нікотину="" (t8="2.98," p=""><.05 ;="" малюнок="">
МАЛЮНОК 4 Нікотин від батька знижує холінергічні сигнали в гіпокампі. Сигнали холіну популяції dHPC викликані KCl-індукованою кінцевою деполяризацією. Не було виявлено суттєвих відмінностей між тваринами-батьками NIC- і SAL (n=5 на групу). B, сигнали холіну популяції vHPC, викликані KCl-індукованою кінцевою деполяризацією, були знижені у мишей NIC-Sired. C, Сигнали холіну dHPC, викликані нікотином, були знижені у мишей NIC-Sired. D. Сигнали холіну vHPC, викликані нікотином, були знижені у мишей NIC-Sired. Впливу статі на холінергічні сигнали не спостерігалося. Смуги помилок вказують на стандартну помилку середнього (SEM), *P <>
3.6 Вплив нікотину по батькові по-різному змінює експресію генів дорсального та вентрального гіпокампу
Аналіз транскриптома гіпокампа F1 за допомогою РНК-секвенування виявив 952 диференціально експресованих генів у vHPC (FDR=0.05; Таблиця S2). З цих генів 612 були знижені, а 340 були активовані у мишей NIC-Sired. У dHPC лише 162 гени були диференційовано експресовані у мишей NIC-Sired порівняно з мишами SAL-Sired (FDR=0.05). З цих 162 генів 86 було знижено, а 76 — посилено. Сто три гени зі зміненою експресією генів перекриваються між vHPC і dHPC.
3.7 Вплив нікотину від батька змінює шляхи транскрипції, залучені до розвитку нервової системи
У vHPC аналіз IPA визначив провідну мережу «Неврологічні захворювання, пошкодження організму та аномалії, загибель і виживання клітин» (оцінка=41, таблиця S3) і другу провідну мережу «Розвиток і функціонування нервової системи, морфологія тканин, неврологічні Хвороба» (бал=23). П’ять найкращих категорій «Молекулярні та клітинні функції»: «Клітинна морфологія» (88 молекул), «Клітинна збірка та організація» (79 молекул), «Клітинний розвиток» (96 молекул), «Клітинна функція та підтримка» (79 молекул), і "Клітинний ріст і проліферація" (87 молекул). Найпопулярнішими функціями розвитку та функціонування фізіологічної системи були «Розвиток і функціонування нервової системи» (175 молекул), а деякі з найпопулярніших функцій захворювань і розладів включають «Неврологічні захворювання» (друге, 191 молекула) і «Психологічні розлади» (четверте, 90 молекул ) (Таблиця S4).
На додаток до результатів IPA аналіз збагачення за допомогою Enrichr надав додаткові докази змін у клітинному рості та розвитку в vHPC, з найпопулярнішими біологічними термінами GO, включаючи «сплайсинг РНК», «реакція на розгорнутий білок» і «регуляцію клітинного росту» та « стабілізація білка» (Таблиця S5). Відповідно, «сплайсосомний комплекс» був ідентифікований як верхній клітинний термін GO. Аналіз шляху KEGG за допомогою Enrichr додатково вказав на функціонування сплайсосоми та передачу сигналів MAPK як шляхи, на які потенційно впливає.
Незважаючи на значно коротший перелік диференціально експресованих генів у dHPC порівняно з vHPC, були ідентифіковані подібні шляхи та терміни, збагачені dHPC (таблиці S3 та S4). Аналіз IPA визначив найкращу мережу «Поведінка, неврологічні захворювання, травми організму та аномалії» (оцінка=24) і другу найкращу мережу «Неврологічні захворювання, травми організму та аномалії та психологічні розлади (оцінка=20) .
П’ять найкращих категорій молекулярних і клітинних функцій у dHPC: «Клітинний розвиток» (29 молекул), «Клітинний ріст і проліферація» (29 молекул), «Клітинна морфологія» (27 молекул), «Клітинна збірка та організація» (23 молекули) і «Функція та підтримка клітин» (25 молекул). «Розвиток і функціонування нервової системи» знову було визначено як найпоширеніший термін у класифікації розвитку та функціонування фізіологічної системи (другий, 44 молекули). Найбільш збагачені терміни в класифікації функцій хвороб і розладів включали «Неврологічні захворювання» (1-е місце, 51 молекула) і «Психологічні розлади» (п’яте, 31 молекула). Аналіз збагачення за допомогою Enrichr виявив кілька різних біологічних термінів GO для dHPC порівняно з vHPC, включаючи «регуляцію загибелі нейронів» і «розвиток мозку» (таблиця S5), що є доповненням до молекулярної та клітинної функції IPA «Смерть і виживання клітин».
Для подальшого вивчення функціональної ролі диференційовано експресованих транскриптів, що перекриваються між dHPC і vHPC, було оцінено диференційовано експресовані гени, спільні для обох регіонів (загалом 103). Диференційно експресовані транскрипти між двома областями, що перекриваються, були знижені або посилені в одному напрямку, що свідчить про загальні зміни в транскрипційних шляхах у різних областях мозку мишей, які мають NIC. Першими п’ятьма категоріями молекулярних і клітинних функцій, визначених IPA, були «Клітинна смерть і виживання» (17 молекул), «Клітинний рух» (10 молекул), «Передача сигналів між клітинами та взаємодія» (17 молекул), «Клітинний ріст». і проліферація» (18 молекул) і «Клітинна морфологія» (17 молекул) (Таблиця S4)
Диференціально експресовані гени, унікальні для dHPC і vHPC, згодом аналізували окремо в IPA, щоб перевірити різницю нейробіологічних адаптацій між двома регіонами (таблиця S6). Немає збагачених канонічних шляхів, що перекриваються між унікальним vHPC унікальним аналізом dHPC. Найбільш збагачені канонічні шляхи, унікальні для vHPC (всього 44), включали «Передачу сигналів кальцію» та «Передачу сигналів рецепторів глюкокортикоїдів», тоді як найкращі канонічні шляхи dHPC (всього вісім) включали «Метаболізм гормонів щитовидної залози» та «Передачу сигналів апоптозу, опосередкованого ретиноєвою кислотою». Збагачені захворювання та функції, унікальні для vHPC (всього 295), включали «Формування [гіппокампу] рогу Аммона» та «Кількість клітинних виступів», тоді як унікальні терміни збагачених хворобами та функціями dHPC (загалом 111) включали «Запалення білої речовини» та «Демієлінізацію». ."
3.8 Вплив нікотину батька змінює метилювання ДНК гіпокампу
Цілеспрямований аналіз метилювання ДНК був проведений, щоб визначити, чи змінене метилювання ДНК у відповідних регуляторних областях пояснює диференціальну експресію генів у потомстві NIC-Sired F1. Мішені включали 1114 диференціально експресованих генів, ідентифікованих у dHPC або vHPC. У vHPC було виявлено 11 диференціально метильованих областей (DMR), з яких вісім демонструють підвищене метилювання, а три – знижене (таблиця 1). З 11 DMR 10 були розташовані в регіонах, пов’язаних з геном, який демонстрував змінену експресію у vHPC. У dHPC було виявлено 30 DMR, з яких 15 показали підвищене метилювання, а 15 показали зниження метилювання. З 30 DMR 29 були розташовані в областях, пов’язаних з геном, який демонстрував змінену експресію в dHPC.
Бенефективність ехінакозиду цистанчі
4 ОБГОВОРЕННЯ
Поглиблене розуміння епігенетичних процесів у поєднанні з нещодавніми даними, включаючи поточні відкриття, поставило під сумнів традиційне розуміння спадковості. Фактори, окрім самого генотипу, можуть визначати фенотипи в наступних поколіннях, і впливи в межах покоління не можуть бути відокремлені від потомства. Дане дослідження показує, що шкідливий вплив нікотину на здоров’я може вийти за рамки індивідуального впливу та вплинути на наступні покоління. Ми визначили багатопоколінні та трансгенераційні ефекти впливу нікотину на батьківщину до зачаття у мишей C57BL/6J на кондиціонування павлівського страху, що призвело до сильніших спогадів про страх у потомства F1 та F2. Вплив нікотину на батьків також призводив до зниження самостійного прийому нікотину та послаблення поведінки, пов’язаної з рецидивом, що свідчить про більшу негативну реакцію на нікотин. На підтримку цих поведінкових відмінностей спостерігалися зміни в холінергічній функції гіпокампа та епігенетичних процесах у різних поколіннях. Разом ці результати вказують на зміни у функції нервової системи у потомства мишей, які зазнали впливу нікотину, що призводить до зміни поведінкових фенотипів.
Нащадки мишей-самців F1 і F2, які зазнали впливу нікотину, продемонстрували посилене контекстне та викликане страхом. Незважаючи на відсутність відмінностей у згасанні контекстуального страху між мишами NIC- і SAL-Sired F1, миші NIC-Sired показали покращене спонтанне відновлення спогадів про контекстний страх. Важливо, що не було виявлено відмінностей у чутливості до шоку між мишами NIC- та SAL-Sired, які могли б пояснити посилення кондиціонування страху. Посилене обумовлення страху може свідчити про загальне покращення процесів навчання на відміну від модуляції процесів, більш специфічних для страху вчитися. Однак у мишей NIC-Sired не спостерігалося жодних змін у розпізнаванні нових об’єктів, оперативному навчанні їжі або пересуванні у відкритому полі, хоча було виявлено статево-специфічний ефект збільшення часу відкритої руки EPM у самок мишей NIC-Sired. Хоча це не виключає потенційних модифікацій інших систем навчання або когнітивних процесів, ці висновки разом свідчать про те, що навчання страху може бути більш чутливим до впливу нікотину в багатьох поколіннях і між поколіннями. Крім того, ці результати свідчать про зміну холінергічної функції у тварин NIC-Sired. Нікотин модулює контекстне обумовлення страху. У той час як гострий нікотин посилює контекстне обумовлення страху15,45, відмова від хронічного нікотину порушує контекстне обумовлення страху.16,21 У цьому дослідженні гострий нікотин посилив контекстне обумовлення страху у мишей F1 і F2 від мишей, які отримували фізіологічний розчин. Навпаки, гострий нікотин порушив контекстуальне формування страху у мишей NIC-Sired і не мав ефекту у мишей NIC-grandsire, що може вказувати на зміну холінергічного функціонування в гіпокампі.
Вплив впливу нікотину від батька на подальше самостійне застосування нікотину в поколінні F1 також вказує на порушення холінергічної функції. Під час отримання внутрішньовенного самостійного введення нікотину в нижчій дозі групи не відрізнялися за кількістю інфузій нікотину, хоча в групі NIC-Sired було виявлено збільшення кількості активних натискань важеля. Це свідчить про те, що миші NIC-Sired, можливо, демонстрували наполегливість у відповіді на винагороду за їжу та/або знижували когнітивну гнучкість у переході реакції з їжі на ліки. Однак також варто зазначити, що групи не відрізнялися в день 1 інкубації потягу, який представляє сеанс згасання (наприклад, відсутність інфузій нікотину під час сеансу), і, таким чином, цей ефект, здається, був присутній, коли підкріплювачі перемикається, але не за відсутності підкріплювача під час сеансу вимкнення. Миші NIC-Sired також продемонстрували зниження самостійного введення нікотину в помірній дозі, що узгоджується з нещодавньою роботою, яка виявила зменшення вживання алкоголю, кокаїну та опіоїдів, пов’язане з впливом батьківського алкоголю, кокаїну та морфіну (наприклад, Vassoler et al.,46 як розглянуто в Goldberg and Gould47). Спостережуване зниження самостійного прийому нікотину можна пояснити або зниженням чутливості до корисних ефектів нікотину та/або підвищеною чутливістю до несприятливих ефектів нікотину. Дійсно, групи відрізнялися за помірною дозою нікотину, але не за меншою дозою нікотину, що підтверджує уявлення про підвищену аверсивну реакцію на вищу дозу. Цікаво, що ми також виявили відсутність інкубації тяги на 21-й день у мишей NIC-Sired після самостійного введення помірної дози, що свідчить про те, що зниження поведінки, пов’язаної з пошуком нікотину, може бути пов’язане з пам’яттю, пов’язаною з відразою до нікотину. Хоча різні нейронні субстрати можуть лежати в основі цих впливів на споживання нікотину та відповіді, пов’язані з рецидивом, нещодавнє дослідження показало, що зниження ДНК-метилтрансферази в області СА1 гіпокампу зменшує самовведення морфіну.48 Цей висновок разом із відомою функцією холінергічної функції гіпокампа в процесів навчання та пам'яті, додатково підтверджує уявлення про порушення процесів, опосередкованих нікотином, у гіпокампі мишей NIC-Sired.
Відповідно до цього, миші NIC-Sired продемонстрували підвищене зв’язування nAChR з високою спорідненістю в гіпокампі. Ми також виявили зниження вивільнення ACh, викликаного калієм, у vHPC, а також вивільнення ACh, викликаного нікотином, як у dHPC, так і vHPC тварин NIC-Sired. Зміни у вивільненні ACh, викликаному деполяризацією, відображають змінену холінергічну функцію нижче за зв’язування рецептора, тоді як зміни у вивільненні ACh, викликаному нікотином, відображають змінену функцію nAChR. Ці дані узгоджуються з попередніми висновками щодо посиленого високоафінного зв’язування nAChR після зниження функції nAChR.49 Оскільки вивільнення ACh, викликане калієм і нікотином, було змінено у vHPC мишей NIC-Sired, vHPC може бути більш чутливим до наслідки впливу нікотину на багато поколінь. Відомо, що DHPC модулює контекстне обумовлення страху.31, 50 Інгібування vHPC порушує як сигнальний, так і контекстний стан страху ing51,52, а холінергічні ураження vHPC порушують обумовлення викликаного страху.53
Трава цистанка
Ми також показали, що пряме вливання нікотину в dHPC посилює контекстне обумовлення страху, тоді як вливання у vHPC порушує контекстне обумовлення страху.15 vHPC також може модулювати спонтанне відновлення спогадів про контекстний страх, оскільки інактивація прелімбічної схеми vHPC зменшує спонтанне відновлення спогадів про контекстний страх. 54 У той час як інші області мозку, задіяні в обумовленні страху, такі як мигдалеподібне тіло,55 також можуть зазнавати впливу нікотину від батька, ці висновки разом із наявними даними свідчать про те, що зміни у функції vHPC можуть бути причиною зміненого обумовлення страху у мишей NIC-Sired. . Ми припустили, що наслідки впливу нікотину на багато поколінь можуть бути пов’язані зі змінами ефекторів транскрипції, що діють перед цими нейронними системами. Геномне транскрипційне секвенування в vHPC і dHPC мишей покоління F1 ідентифікувало 1114 диференціально експресованих генів між мишами NIC- і SAL-Sired. Ця різниця була більшою у vHPC (952) порівняно з dHPC (162), відповідно до більшої зміни vHPC відносно холінергічної функції dHPC та змін у контексті та викликаному страху. Подальший аналіз шляхів запропонував значні зміни в транскрипційних шляхах, пов’язаних із передачею сигналів глюкокортикоїдів і нейронним розвитком/пластичністю в обох областях гіпокампу.
Для того, щоб ідентифікувати потенційні адаптації, специфічні для vHPC, аналіз шляху проводився з використанням лише транскриптів, специфічних для обох субрегіонів гіпокампу. Немає збагачених канонічних шляхів IPA, що перекриваються між vHPC і dHPC, які є функціонально різними підобластями гіпокампу.31 Коли гени, які перекриваються між dHPC і vHPC, були видалені, верхні збагачені канонічні шляхи, унікальні для vHPC, включали «сигналізацію глюкокортикоїдного рецептора», що свідчить про унікальну , додаткова зміна функціонування глюкокортикоїдів у цій області порівняно з dHPC. З метою ідентифікації верхніх епігенетичних регуляторів, які можуть впливати на експресію генів, ми виконали цілеспрямоване секвенування метилювання ДНК, використовуючи складений список генів dHPC і vHPC, які диференційовано експресуються, ідентифікованих за допомогою секвенування РНК. Дивно, але ми виявили лише 11 DMR у vHPC і 30 DMR у dHPC між тваринами NIC- та SAL-Sired. Хоча це несподівано, враховуючи набагато більшу кількість диференціально експресованих транскриптів у vHPC, метилювання ДНК є лише одним із кількох регуляторних факторів, які можуть впливати на експресію генів, і метилювання ДНК не завжди призводить до зміненої експресії генів.56 З 11 DMR vHPC сім показали моделі метилювання, що відповідають напрямку диференціальної транскрипції (знижена транскрипція з підвищеним метилюванням ДНК і підвищена транскрипція зі зниженим метилюванням). Диференційно метильовані гени в vHPC включали Fkbp5, Ksr1 і Pnpla2. Цікаво, що транскрипція Fkbp5 і Ksr1 була порушена в одній поведінковій мишачій моделі посттравматичного стресового розладу57, де мишей піддавали впливу електричного струму, а потім демонстрували ситуаційні нагадування. Fkbp5 кодує шаперон глюкокортикоїдного рецептора, функціонування якого було пов’язане з дезадаптивною тривалою реакцією на стрес у осіб з ПТСР та іншими тривожними розладами.58
Зокрема, дослідження на людях показують, що метилювання та транскрипція Fkbp5 корелюють із тяжкістю симптомів посттравматичного стресового розладу, таким чином посилення метилювання та зниження транскрипції передбачають більш серйозні симптоми посттравматичного стресового розладу.59,60 Експресія Fkbp5 модулює функціонування осі HPA, яка, як вважають, опосередковує його участь у ПТСР.59,61 Наше відкриття посиленого спонтанного відновлення пам’яті про страх у поєднанні з порушенням регуляції транскрипційних шляхів, пов’язаних із передачею сигналів глюкокортикоїдів у тварин NIC-Sired, може вказувати на підвищену вразливість до фенотипів, подібних до ПТСР. У dHPC моделі DMR значною мірою не узгоджувалися з напрямком експресії диференціального транскрипту, виявленим за допомогою секвенування РНК, що свідчить про те, що зміни в метилюванні ДНК vHPC, спричинені впливом нікотину на батьківщину, є більш значущими з точки зору впливу на експресію генів, ніж у dHPC. Це узгоджується з нашою ідентифікацією більшої кількості диференційовано експресованих транскриптів і більш перебільшених змін холінергічної передачі в NIC-Sired vHPC порівняно з dHPC. Наш цілеспрямований підхід секвенування міг обмежити здатність виявляти потенційну регуляцію транскрипції за допомогою дистально метильованих послідовностей. Майбутні дослідження, включаючи аналіз метилювання ДНК у всьому геномі, модифікації гістонів і експресії малих РНК, забезпечать більш повну інтерпретацію цих знахідок.
Потенційним обмеженням нашого плану впливу нікотину є зосередженість на впливі нікотину від батька, щоб дослідити вплив впливу нікотину на покоління та покоління. Незважаючи на те, що інші дослідження, що виявляють фенотипи багатьох/трансгенерацій після прийому батьками наркотиків, включаючи кокаїн46 і морфін62, не виявили відмінностей у догляді за матір’ю, цілком можливо, що вплив нікотину від батька може вплинути на догляд за матір’ю. Майбутні дослідження впливу на материнську допомогу виправдані. Оскільки зараз ми зосереджені на впливі батьків, у майбутній роботі слід також порівняти вплив впливу батьків і матері. Загалом, ці результати дають нове розуміння ефектів впливу нікотину на покоління та покоління, що підтверджується зростаючою кількістю літератури, що характеризує вплив впливу наркотиків на покоління та покоління (як розглянуто в Goldberg and Gould47). Це дослідження було першим, у якому перевірено контекстне формування страху у нащадків F1 і F2 самців, які зазнали впливу нікотину, і виявлено посилене формування пам’яті страху та спонтанне відновлення спогадів про страх. Це дослідження також було першим, у якому було виявлено змінене самостійне введення нікотину та інкубацію тяги у нащадків F1, які піддавалися впливу нікотину.
У мишей NIC-Sired було виявлено диференціальне метилювання в генах, пов’язаних із посттравматичним стресовим розладом і дисрегуляцією осі HPA, а також одночасні порушення пов’язаних зі стресом шляхів транскрипції. Батьківський нікотин також був пов’язаний зі зниженням холінергічної функції гіпокампа та збільшенням зв’язування nAChR у гіпокампі. Цікаво, що пацієнти з посттравматичним стресовим розладом, які не курили, демонструють значно вищий мезіотемпоральний кортикальний високоафінний зв’язок nAChR63, і посттравматичний стресовий розлад пов’язаний із сильнішим обумовленням страху та спонтанним відновленням згаслих спогадів про страх.64 Разом наші результати свідчать про те, що вплив нікотину може впливати на багато поколінь. підвищення сприйнятливості нащадків до симптомів, подібних до ПТСР. Цей висновок разом з іншими нещодавніми відкриттями, які демонструють вплив впливу нікотину на когнітивну гнучкість2 для багатьох поколінь, свідчить про те, що негативні наслідки впливу нікотину на здоров’я мають ширшу мережу, ніж вважалося раніше.
Екстракт цистанхи
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1 Dai J, Wang Z, Xu W та ін. Вплив нікотину від батька визначає іншу поведінку в наступному поколінні через гіперметилювання mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017; 7 (1): 7286.
2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE та ін. Вплив нікотину на самців мишей викликає порушення поведінки в багатьох поколіннях нащадків. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.
3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Трансгенераційна передача гіперактивності в мишачій моделі СДУГ. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.
4. Каммінгс К.М., Проктор Р.Н. Зміна суспільного уявлення про куріння в Сполучених Штатах: 1964-2014. Епідеміологічні біомаркери раку Поперед. 2014; 23 (1): 32-36.
5. Хуанг Л.Л., Ковітт С.Д., Сатфін Е.Л., Патель Т., Ренні Л.М., Гольдштейн А.О. Використання електронних сигарет серед учнів середньої школи та його зв’язок із вживанням сигарет і відмовою від куріння, Опитування молоді в Північній Кароліні щодо тютюнопаління, 2011 і 2013 рр. Попередня Хронічна дис. 2016;13:E103.
6. Холлідей Е. Д., Нусеро П., Кутлу М. Г. та ін. Довгостроковий вплив хронічного нікотину на емоційну та когнітивну поведінку та морфологію клітин гіпокампу у мишей: порівняння впливу нікотину у дорослих та підлітків. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.
7. Джонсон Дж.Г., Коен П., Пайн Д.С., Кляйн Д.Ф., Касен С., Брук Дж.С. Зв'язок між курінням сигарет і тривожними розладами в підлітковому та ранньому дорослому віці. ДЖАМА. 2000;284:2348-2351.
8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM та ін. Епігенетичний механізм опосередковує вплив нікотину на структуру та поведінку нейронів. Nat Neurosci. 2016; 19 (7): 905-914.
9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Холін зменшує дефіцит навчання дорослих і скасовує епігенетичну модифікацію факторів ремоделювання хроматину, пов’язаних із впливом нікотину у підлітків. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239-248.
10. Берд А. Уявлення про епігенетику. природа 2007;447:396-398.
11. Скіннер М.К. Середовищне епігенетичне трансгенераційне успадкування та соматична епігенетична мітотична стабільність. Епігенетика. 2011; 6: 838-842.
12. Девіс Дж.А., Гулд Т.Дж. Асоціативне навчання, гіпокамп і нікотинова залежність. Curr Drug Abuse Rev. 2008; 1: 9-19.
13. Кутлу М.Г., Паріх В., Гулд Т.Дж. Нікотинова залежність і психічні розлади. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171-208.
14. Паріх В., Кутлу М.Г., Гулд Т.Дж. Дисфункція nAChR як загальний субстрат шизофренії та коморбідної нікотинової залежності: сучасні тенденції та перспективи. Schizophr Res. 2016;171:1-15.
15. Кенні Дж.В., Рейбак Дж.Д., Гулд Т.Дж. Нікотинові рецептори в дорсальному та вентральному гіпокампі по-різному модулюють контекстне обумовлення страху. Гіпокамп. 2012; 22: 1681-1690.
16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Генетичне походження впливає на наслідки відмови від хронічного нікотину на навчання та зв’язування нікотинового ацетилхолінового рецептора з високою спорідненістю в дорсальному та вентральному гіпокампі. Психофармакологія (Берль). 2013; 225 (1): 201-208.
17. Девіс Дж.А., Гулд Т.Дж. Вплив DHBE і MLA на індуковане нікотином посилення контекстуального страху у мишей C57BL/6. Психофармакологія (Берль). 2006;184:345-352.
18. Кутлу М.Г., Зейд Д., Тумоло Дж.М., Гулд Т.Дж. Миші у підлітковому та підлітковому віці менш чутливі до впливу гострого нікотину на згасання та спонтанне відновлення. Brain Res Bull. 2018;138:50-55.
19. Кутлу М.Г., Гулд Т.Дж. Гострий нікотин затримує зникнення контекстуального страху у мишей. Behav Brain Res. 2014;263:133-137.
20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3rd. Хімічний склад нікотину, метаболізм, кінетика та біомаркери. В: Психофармакологія нікотину. Берлін, Гейдельберг: Springer; 2009:29-60.
21. Девіс Дж.А., Джеймс М.Р., Сігел С.Дж., Гулд Т.Дж. Відмова від хронічного прийому нікотину погіршує контекстне формування страху у мишей C57BL/6. J Neurosci. 2005; 25: 8708-8713.
22. Петерсен DR, Норріс KJ, Томпсон JA. Порівняльне дослідження розподілу нікотину та його метаболітів у трьох інбредних лініях мишей. Препарат Метаб Диспос. 1984;12:725-731.
23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM та ін. Тривалість дефіциту контекстуального страху, пов’язаного з відміною нікотину, відповідає змінам у гіпокампальній активації високоафінних нікотинових ацетилхолінових рецепторів. Нейрофармакологія. 2012;62:2118-2125.
24. Кутлу М.Г., Олівер К., Хуан П., Лю-Чен Л.Й., Гулд Т.Дж. Порушення контекстуального згасання страху хронічним нікотином і відмова від хронічного нікотину пов’язані з підвищенням регуляції nAChR в гіпокампі. Нейрофармакологія. 2016;109:341-348. 25. Дамай М.І., Као В., Мартін БР. Характеристика спонтанної та прискореної абстиненції нікотину у миші. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.
26. Фаулер CD, Лу Q, Джонсон П.М., Маркс MJ, Кенні PJ. Субодиниця нікотинового рецептора Habenular alpha5 контролює споживання нікотину. природа 2011;471:597-601.
27. Ломаццо Е., Макартур Л., Ясуда Р.П., Вулф Б.Б., Келлар К.Дж. Кількісний аналіз гетеромерних нейрональних нікотинових рецепторів у гіпокампі щурів. J Neurochem. 2010; 115: 625-634.
28 Тернер Дж.Р., Кастеллано Л.М., Бленді Дж.А. Паралельні анксіолітичні ефекти та підвищення регуляції нейрональних нікотинових ацетилхолінових рецепторів після хронічного нікотину та вареникліну. Нікотин Tob Res. 2011; 13: 41-46.
29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Префронтальні бета2 субодиниці та альфа7 нікотинові ацетилхолінові рецептори по-різному контролюють глутаматергічну та холінергічну передачу сигналів. J Neurosci. 2010; 30: 3518-3530.
30. Паріх В., Стартер М. Холінергічні системи переднього мозку та пізнання: нові ідеї, засновані на швидкому виявленні спайків холіну за допомогою біосенсорів на основі ферментів. В: Мікроелектродні біосенсори. Totowa, NJ: Humana Press; 2013: 257-277.
31. Fanselow MS, Dong HW. Чи є дорсальний і вентральний гіпокамп функціонально відмінними структурами? нейрон. 2010;65(1):7-19.
32. Кім Д, Пертеа Г, Трапнелл С, Піментел Х, Келлі Р, Зальцберг С.Л. TopHat2: точне вирівнювання транскриптомів за наявності вставок, делецій і злиття генів. Genome Biol. 2013; 14 (4): R36.
33. Афган Е, Бейкер Д, ван ден Бек М та ін. Платформа Galaxy для доступних, відтворюваних і спільних біомедичних аналізів: оновлення 2016 року. Nucleic Acids Res. 2016; 44: W3-w10.
34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G та ін. Збірка транскриптів і кількісна оцінка за допомогою RNA-Seq виявляють неанотовані транскрипти та перемикання ізоформ під час диференціювання клітин. Нац біотехн. 2010; 28 (5): 511-515.
35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Контроль рівня помилкових відкриттів у дослідженні генетики поведінки. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.
36. Крамер А, Грін Дж, Поллард Дж молодший, Тугендрейх С. Підходи до причинно-наслідкового аналізу в аналізі винахідливості. Біоінформатика. 2014; 30 (4): 523-530.
37. Кулешов М.В., Джонс М.Р., Руйяр А.Д. та ін. Enrichr: комплексне оновлення веб-сервера для аналізу набору генів 2016 року. Nucleic Acids Res. 2016; 44 (W1): W90-W97.
38. Вендт Дж., Розенбаум Х., Річмонд Т.А., Джеддело Дж.А., Берджесс Д.Л. Цільове секвенування бісульфіту за допомогою системи збагачення SeqCap epi. Методи Mol Biol. 2018;1708:383-405.
39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: гнучкий тример для даних послідовності Illumina. Біоінформатика. 2014;30(15):2114-2120.
40. Langmead B, Salzberg SL. Швидке вирівнювання зчитування з пропусками за допомогою Bowtie 2. Методи Nat. 2012; 9 (4): 357-359.
41. Крюгер Ф., Ендрюс С.Р. Bismark: гнучкий засіб вирівнювання та виклик метилювання для застосувань Bisulfite-Seq. Біоінформатика. 2011; 27 (11): 1571-1572.
42. Акалін А, Кормакссон М, Лі С та ін. methylKit: комплексний пакет R для аналізу профілів метилювання ДНК у всьому геномі. Genome Biol. 2012; 13 (10): R87.
43. Gould TJ, Lommock JA. Нікотин посилює контекстне обумовлення страху та зменшує дефіцит контекстуального страху, спричинений етанолом. Behav Neurosci. 2003; 117 (6): 1276-1282.
44. Фаулер CD, Кенні PJ. Внутрішньовенне самовведення нікотину та індуковане відновлення у мишей: вплив дози нікотину, швидкості інфузії препарату та попереднього інструментального навчання. Нейрофармакологія. 2011; 61 (4): 687-698.
45. Gould TJ, Wehner JM. Нікотин посилює контекстне обумовлення страху. Behav Brain Res. 1999; 102 (1-2): 31-39.
46. Вассолер Ф.М., Вайт С.Л., Шмідт Х.Д., Садрі-Вакілі Г., Пірс Р.К. Епігенетичне успадкування фенотипу стійкості до кокаїну. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.
47. Голдберг Л.Р., Гулд Т.Дж. Багатопоколінні та трансгенераційні ефекти впливу батьків на зловживання наркотиками на поведінкові та нервові функції. Eur J Neurosci. 2018; 50 (3): 2453-2466.
48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W та ін. DNMT3a в СА1 гіпокампа має вирішальне значення для отримання щурами самостійного введення морфіну. наркоман біол. 2019;▪:▪‐▪.
49. Шварц Р.Д., Келлар К.Дж. Місця зв'язування нікотинових холінергічних рецепторів у мозку: регуляція in vivo. Наука. 1983; 220 (4593): 214-216.
50. Лог С.Ф., Пейлор Р., Венер Дж.М. Поразки гіпокампу викликають дефіцит навчання у інбредних мишей у водному лабіринті Морріса та умовному страху. Behav Neurosci. 1997; 111 (1): 104-113.
51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Вентральний гіпокамп і страх у щурів: різні антероградні амнезії страху після інфузії N-метил-D-аспартату або його неконкурентного антагоніста MK-801 у вентральний гіпокамп. Behav Brain Res. 2001; 126 (1-2): 159-174.
52. Марен С., Холт В.Г. Кондиціонування гіпокампу та павлівського страху у щурів: інфузії мусцимолу у вентральний, але не дорсальний гіпокамп погіршують набуття умовного завмирання на слуховий умовний стимул. Behav Neurosci. 2004; 118 (1): 97-110.
53. Стайб Дж.М., Делла Валле Р., Нокс Д.К. Порушення медіальної перегородки та діагональних смуг холінергічних проекцій Брока на вентральний гіпокамп порушують слухову пам’ять про страх. Neurobiol Learn Mem. 2018;152:71-79.
54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Специфічна для шляху активація клітин вентрального гіпокампу, що виступають у прелімбічну кору, зменшує поновлення страху. Neurobiol Learn Mem. 2019; 161: 63-71.
55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Латеральне мигдалеподібне ядро: сенсорний інтерфейс мигдалеподібного тіла при обумовленні страху. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.
56. Джонс П.А. Функції метилювання ДНК: острівці, стартові сайти, генні тіла та інше. Nat Rev Genet. 2012; 13 (7): 484-492.
57. Танака М, Лі Х, Чжан Х та ін. Залежна від регіону та часу генна регуляція в мигдалині та передній поясній корі моделі миші, схожої на ПТСР. Mol Brain. 2019;12(1):25.
58. Підшивка Е.Б. Роль FKBP5, ко-шаперону глюкокортикоїдного рецептора в патогенезі та терапії афективних і тривожних розладів. Психоневроендокринологія. 2009; 34 (Додаток 1): S186-S195.
59 Sarapis C, Cai G, Bierer LM та ін. Генетичні маркери ризику посттравматичного стресового розладу та стійкості серед тих, хто вижив після атак на Всесвітній торговий центр. Дис Маркери. 2011;30(2-3):101-110.
60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Епігенетичні біомаркери як предиктори та кореляти покращення симптомів після психотерапії у ветеранів бойових дій із ПТСР. Front Psych. 2013; 4: 118.
61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA та ін. Моделі експресії генів, пов'язані з посттравматичним стресовим розладом після нападу на Всесвітній торговий центр. Біологічна психіатрія. 2009;66:708-711.
62. Li CQ, Luo YW, Bi FF та ін. Розвиток поведінки, подібної до тривоги, через передачу сигналів гіпокампу IGF-2 у нащадків під впливом батьківського морфіну: ефект збагаченого середовища. Нейропсихофармакологія. 2014;39(12):2777-2787.
63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S та ін. Наявність нікотинового ацетилхолінового рецептора beta2 при посттравматичному стресовому розладі. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.
64. Мілад М.Р., Пітман Р.К., Елліс К.Б. та ін. Нейробіологічні основи нездатності пригадати пам'ять про вимирання при посттравматичному стресовому розладі. Біологічна психіатрія. 2009;66(12):1075-1082.