Частина 2: Взаємодія аскорбінової кислоти, 5-кофеоїлхінової кислоти та кверцетину-3-рутинозиду в присутності та відсутності заліза під час термічної обробки та вплив на антиоксидантну активність

Для отримання додаткової інформації. контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Натисніть посилання, щоб дізнатися деталі частини 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Обговорення

3.1. Зв’язок між структурою та активністю аскорбінової кислоти,5-кофеоїлхінової кислоти та кверцетин-3-рутинозиду

Перший показник AOA, виміряний для різних речовин залежно від співвідношення структура-активність, був результатом кількості функціональних груп. Порівнюючи всі три проаналізовані речовини, аскорбінова кислота мала найнижчий AOA, потім 5-кофеоілхінова кислота, тоді яккверцетин-3-рутинозиддосяг найвищого AOA. Csepregi та ін. [14] виявили такий же порядок при порівнянні АОА цих трьох сполук. Цей рейтинг можна пояснити загальною кількістю гідроксигруп: кверцетин-3-рутинозид має десять, 5-кофеоілхінова кислота має п’ять, ааскорбінова кислотамає чотири. дляфлавоноїди, загальна кількість гідроксильних груп та їх вплив на механізми АОА раніше було показано Бурдою та Олешеком [15]. Гідроксигрупи особливо цінні в ендіольних структурах, оскільки вони можуть легко окислюватися до дикетонів [8]. У досліджуваних речовинах структура ендіолу також важлива для здатності утворювати комплекси з іонами металів [16-18]. Структура ендіолу виникає в молекулах кверцетин-3-рутинозиду та 5-кофеоілхінової кислоти у фенільному кільці, що також може впливати на сильнішу АОА цих сполук. Подальші дослідження показали, що на AOA також можуть впливати інші молекулярні структури. На фенольні кислоти, можливо, впливають групи карбонових кислот, наприклад, гідроксифенілоцтова кислота (R-CH=CH-COOH) є слабшою електроноакцепторною групою порівняно з гідроксикоричною кислотою (R-CH,-COOH), наприклад як кавова кислота в 5-кофеоілхіновій кислоті [19]. У флавоноїдах аглікони мали вищі AOA, ніж відповідні глікозиди [20,21], у випадку кверцетин-3-рутинозиду, глікозиду, AOA агліконукверцетинотже вище [14]. Існує багато різних функціональних груп, які можуть впливати на AOA, і, отже, важливо використовувати різні тести з різними механізмами, такими як перенесення одного електрона (SET), перенесення атома водню (HAT) і послідовна втрата протонів електрона передача (SPLET) для виявлення. Кожен механізм і навіть використаний реагент для аналізу можуть виявити різні структури біоактивних сполук [22].

3.2. Вплив термічної обробки та взаємодії структурно різних антиоксидантів на антиоксидантну активність за відсутності мінерального заліза

Стабільний AOA протягом тривалого часу 40 хвилин термічної обробки вказує на те, що термічна деградація менш важлива, ніж передбачалося спочатку. Крім того, дані ВЕРХ показали, що чиста 5-кофеоілхінова кислота та кверцетин-3-рутинозид були стабільними з максимальним розкладанням 20 відсотків під час термічної обробки. Попередні дослідження довели стабільність 5-кофеоілхінової кислоти до нормальної температури кипіння води [23], тоді як Давідович і Типек [24] виявили дев'ять похідних сполук після нагрівання 5-кофеоілхінової кислоти протягом 5 годин під рефлюкс. Для концентрації аскорбінової кислоти було виявлено розпад після 40 хвилин варіння. Факторами, що впливають на розпад аскорбінової кислоти без заліза у водному розчині, можуть бути значення рН, вплив світла, окислення, температура та різні концентрації [25,26]. У цьому дослідженні, швидше за все, головну роль відігравали фактори температура та концентрація, оскільки окисні процеси були зведені до мінімуму завдяки мінімальному газовому простору в мікропробірках. Можливо, що залишилася газової фази ще достатньо для розкладання в аеробних умовах. Різні умови призводять до отримання різних продуктів [27, 28], тому в цьому дослідженні після 40 хвилин варіння можна було знайти продукти обох умов. Юань і Чен [28] повідомили, що фурфурол, 2-фурова кислота, 3-гідрокси-2-пірон і невідома речовина є основними продуктами розпаду аскорбінової кислоти у водному розчині залежно від значення pH . Шинода та ін. [29,30] виявили в апельсиновому соку продукти розпаду фурфурол, 2-фурову кислоту, 5-гідроксимальтол, 3-гідрокси-2-пірон і 5-(гідроксиметил )фурфурол. Хсу та ін. [31] проаналізували аскорбінову кислоту в етанольних розчинах і виявили 2-фурову кислоту та 3-гідрокси-2-пірон. Залежно від аеробних або анаеробних умов, виявлені похідні аскорбінової кислоти (піки 3 і 4) можуть бути фурфуролом, 2-фуроєвою кислотою або 3-гідрокси-2-піроном або проміжними продуктами. Вміст аскорбінової кислоти зменшувався у зв’язку доза-реакція, а більш високі концентрації аскорбінової кислоти демонстрували нижчі коефіцієнти розкладання під час варіння. Аскорбінова кислота, здається, стабілізується у вищих концентраціях, ймовірно, завдяки водневим зв’язкам і енергії Ван-де-Ваальса [32].

У бінарних і потрійних сумішах були виявлені переважно додаткові ефекти на АОА. У бінарних сумішах, якщо речовина з більшою АОА зростала в концентрації, АОА їх комбінації також зростала. Інші дослідження також виявили адитивний ефект між (плюс)-катехіном (200 мкм) з аскорбіновою кислотою (50-200 мг/л)[33], а також між бінарними сумішами різних монотерпенів[34]. Лише в аналізі DPPH антагоністичні ефекти були виявлені в 5-кофеоілхіновій кислоті в поєднанні з кверцетин-3-рутинозидом і в потрійних сумішах із подвоєною концентрацією кверцетин-3-рутинозиду. Це може бути спричинено орієнтацією молекул у просторі, особливо кверцетин-3-рутинозиду, як досить великої молекули, та стеричною доступністю молекули радикала DPPH [35]. У аналізі TPC комбінація аскорбінової кислоти та 5-кофеоілхінової кислоти призвела до сильних антагоністичних ефектів у співвідношенні 1:2, тоді як зворотні суміші зі співвідношенням 2:1 призвели до сильного синергічного ефекту, що перевищує суму відповідні AOA. Подвійна концентрація аскорбінової кислоти може дати, за цих умов, додатковий поштовх AOA завдяки самостабілізації з наступною стабілізацією інших молекул, що продемонстровано 5-кофеоілхіновою кислотою в цьому експерименті. У гранатово-нектариновому соку між природними фенолами та аскорбіновою кислотою виявлено таку ж взаємодію, тоді як у виноградному соку спостерігалося посилення антагоністичних ефектів за рахунок збільшення концентрації аскорбінової кислоти [36]. Ці результати свідчать про те, що суміші аскорбінової кислоти, 5-кофеоїлхініну та кверцетин-3-рутинозиду досягають найвищого потенціалу АОА, коли найпотужнішіантиоксидантидоступні у великій кількості.

Натисніть, щоб дізнатися більше про продукти

3.3. Вплив мінералу заліза

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>аскорбінова кислота. Однак додавання заліза до сумішей вплинуло на результати аналізів TEAC і DPPH, тоді як аналізи TPC практично не вплинули. З цієї причини при роботі зі зразками, багатими на залізо, важливо використовувати різні аналізи з різними робочими механізмами.

Лише в аналізі DPPH AOA чистого кверцетин-3-рутинозиду та в комбінації з аскорбіновою кислотою, еквімолярною чи нееквімолярною з подвоєними концентраціями кверцетин-3-рутинозиду, мали нижчі значення в присутності заліза. Болігон та ін. [351] пояснив, що аналіз DPPH краще виявляє менші антиоксиданти завдяки стеричній доступності цих радикалів. Імовірно, кверцетин-3-рутинозид з двома зв’язуючими сторонами може утворювати досить великі комплекси із залізом і, таким чином, бути недоступним для аналізу. Як зазначають Kejic та ін. [8] це можна пояснити утворенням супрамолекулярних комплексів через координацію іонів металів. У поєднанні з аскорбіновою кислотою, яка здатна будувати комплекси змішаної валентності у співвідношенні 1:2 [12], імовірно, ці більші змішані комплекси не можуть взаємодіяти з радикалом DPPH. На відміну від результатів цього дослідження, інші дослідження [18,37,38] за допомогою аналізу DPPH виявили, що комплекси кверцетин-3-рутинозиду є більш ефективними антиоксидантами, ніж чистий кверцетин-3-рутинозид. Відомо, що хелатні комплекси флавоноїдів та іонів металів можуть заперечувати радикальну активність комплексованих іонів металів [39]. Єдина відмінність полягала в тому, що в цьому дослідженні використовувався сульфат амонію заліза (II) замість хлориду або сульфату заліза (ⅡI), які використовувалися в роботі Symonowics і Kolandek [39].

Виявлено синергетичний ефект між аскорбіновою кислотою та 5-кофеоілхіновою кислотою в присутності заліза у співвідношенні 2:1 та антагоністичний ефект у співвідношенні 1:2. Комбінація 5-кофеоілхінової кислоти із залізом in vivo не рекомендована [6]. Проте це дослідження показало, що in vitro подвоєна кількість аскорбінової кислоти порівняно з 5-кофеоілхіновою кислотою може навіть мати синергічний вплив на AOA. Подальші дослідження співвідношень можуть показати, чи можна також досягти позитивних ефектів in vivo.

Згідно з даними ВЕРХ, додавання заліза до зразка матиме мінімальний вплив на його каталітичну активність, оскільки зменшилася лише концентрація аскорбінової кислоти в 0 хв варених зразків. У варених зразках аскорбінової кислоти, на відміну від зразків без заліза, вищі концентрації аскорбінової кислоти призвели до вищого коефіцієнта розпаду.5-Кофейно-хінінова кислота та кверцетин-3-рутинозид потребують додаткових факторів, температури та часу, а також взаємодії в сумішах, щоб діяла каталітична активність заліза. Кверцетин-3-рутинозид у присутності заліза знижувався лише в бінарних сумішах з аскорбіновою кислотою після термічної обробки. Це може бути пов’язано з тим, що флавоноїд діє як первинний антиоксидант, а потім утворений радикал сполуки реагує з аскорбіновою кислотою, регенеруючи вихідну сполуку [18]. 5-Кофеоілхінова кислота, здається, є особливою, оскільки вона захищає кверцетин-3-рутинозид, тоді як аскорбінова кислота не здатна захистити кверцетин-3-рутинозид. Отже, 5-кофеоілхінова кислота може бути ключовою молекулою для стабілізації системи в поєднанні із залізом і термічною обробкою. Ця гіпотеза про 5-кофеоілхінову кислоту як стабілізуючу молекулу була додатково підтверджена в потрійних сумішах. Тут кверцетин-3-рутинозид завжди стабілізувався 5-кофеоілхіновою кислотою, тому навіть у присутності аскорбінової кислоти не спостерігалося зниження концентрації кверцетин-3-рутинозиду. В іншому дослідженні 5-кофеоілхінінова кислота продемонструвала захисні властивості проти деградації антоціанів через механізм спільної пігментації [40]. З усіх трьох речовин у присутності заліза з’явилися нові продукти розпаду з, можливо, вищим AOA. Кофейну кислоту (пік 6) ідентифікували як 5-продукт розпаду кофеїлхінової кислоти (дані не показано). Це призвело до припущення, що інша речовина може бути хінною кислотою або одним із дев’яти можливих похідних, описаних Давідовичем і Типеком [24]: хінна кислота;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-дигідроксифеніл)-2-гідроксипропаноіл]-1,4,5-тригідроксициклогексанкарбонова кислота;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-дигідроксифеніл)-3-гідроксипропаніл]-1,4,5-тригідроксициклогексанкарбонова кислота; транс 3-О-кофеоїлхінова кислота; транс 5-О-кофеоїлхінова кислота; транс-4-О-кофеоїлхінова кислота; кавова кислота; цис-5-О-кофеоілхінова кислота; 4,5-дикафеоілхінова кислота. Для кверцетин-3-рутинозиду на хроматограмі з’являється продукт розпаду, який неможливо ідентифікувати.

3.4. Здатність утворювати хелати з двовалентним залізом (Fe3 плюс) і двовалентним залізом (Fe2 плюс)

У всіх зразках, що містять аскорбінову кислоту, тривалентне залізо відновлювалося до двовалентного. У цьому процесіаскорбінова кислотазабирає електрон від двовалентного заліза і відновлює його до двовалентного заліза, а сам стає радикалом. Нестабільний радикал швидко перетворюється на дегідроаскорбінову кислоту та подальші продукти розпаду [12]. Через відсутність гідроксипероксиду реакція назад у тривалентне залізо через цикл Фентона неможлива. У 0 хв приготовлених бінарних сумішей більше 20 відсотків заліза було зв’язано в присутності аскорбінової кислоти. Відомо, що аскорбінова кислота утворює комплекси з іонами заліза та інших металів шляхом хелатування через ядра 3-O та 2-O після витіснення водню з 3-OH та 2- ОН групи [16,17,41. Він також може утворювати комплекси заліза з аскорбатом змішаної валентності [42]. Однак аскорбінова кислота є слабким хелатуючим агентом, і після варіння в чистих і змішаних зразках були виявлені лише сліди зв’язаного заліза за наявності аскорбінової кислоти. Крім того, в процесі варіння аскорбінова кислота розпадається на продукти розпаду, які, здається, не можуть хелатувати із залізом.

5-Кофеоілхінова кислота є відносно поганим відновником. Ферумне залізо відновлювалося 5-кофеоілхіновою кислотою, і при тривалому варінні відновлення збільшувалося.5-Кофеоілхінінова кислота утворює хелати з тривалентним залізом у передачі заряду ліганду до металу [17].5-Кофеоілхінінова кислота несе одну можливу сторону зв'язування в структурі 3,4 ендіолу кавової кислоти. Це може бути показником того, чому кофеїнова кислота є біоактивною частиною 5-кофеоілхінової кислоти, тоді як хіна кислота майже не має АОА [43]. Ендіоли інгібували утворення ОН завдяки утворенню комплексу заліза [41] у співвідношенні один до одного [44,45]. Lamy та ін. [46] дійшли висновку, що 5-кофеоілхінова кислота утворює мономерні комплекси, тоді як Kiss та ін. [47] знайшли олігомерні види. На відміну від попередніх досліджень [17,48], лише сліди зв’язаного заліза були виявлені в присутності 5-кофеоілхінової кислоти до та після термічної обробки. Це можна пояснити нейтральними умовами pH у цьому дослідженні, тоді як інші дослідження працювали в кислому середовищі на основі значення pH від 1-2.5 у шлунку людини [48]. Через кілька годин у зразках, що зберігалися, було виявлено чорний осад, який є індикатором комплексів 5-кофеоїлхінова кислота – тривалентне залізо. Для аналізу використовували нещодавно змішані зразки, тому утворення цих комплексів при нейтральному рН вимагає більш тривалого періоду часу. Комплекси заліза з кавовою кислотою показали незначну активність поглинання [49]. Крім того, немає спектрофотометричних доказів реакції між хінною кислотою та тривалентним залізом [48]. На відміну від 5-кофеоілхінної кислоти, у зразку кверцетин-3-рутинозиду виявлено зв’язане залізо навіть після термічної обробки.

Кверцетин-3-рутинозид відновлював тривалентне залізо до двовалентного заліза з мінімальним збільшенням за рахунок тривалого варіння. Ця помірна відновна активність кверцетин-3-рутинозиду була раніше описана Mira та ін. [50]. Залізовідновлювальну активність кверцетин-3-рутинозиду було виявлено в 3-рутинозиді, 5,7,3',4'-OH [50]. Помірну взаємодію з двовалентним залізом можна пояснити меншою кількістю -OH груп, що призвело до меншої щільності негативного заряду на стороні хелатоутворення [50]. Флавоноїди можуть хелатувати з іонами металів на трьох потенційних координаційних сторонах: (i) між 5-гідрокси та 4-карбонільними групами, (ii) між 3-гідрокси та 4-карбонільними групами, і (ii) між 3', A'-гідроксигрупами в Bring [39]. Кверцетин-3-рутинозид використовує сторони зв’язування (i) і (i)[9], а до 3-гідроксигрупи приєднується рутинозид. Спектральні дані навіть показали, що іони металів зв'язані лише з 3', A'-гідроксигрупою [18]. Хелати більш ефективні з залізом у його двовалентній формі [50]. У бінарних сумішах кверцетин-3-рутинозид не здатний утворювати комплекси за наявності аскорбінової кислоти, на відміну від потрійних сумішей. За наявності 5-кофеоілхінової кислоти виявляється невелика кількість зв’язаного заліза. Це вказує на те, що 5-caffeoylquinic захищає молекули кверцетин-3-рутинозиду в присутності аскорбінової кислоти, тому кверцетин-3-рутинозид може утворювати комплекси із залізом.

4. Матеріали та методи

4.1.Хімічні речовини

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 відсотків), додекагідрат сульфату заліза амонію та гексагідрат сульфату заліза амонію були придбані у Carl Roth (Карлсруе, Німеччина).

4.2.Зразки

Водні розчини та суміші автентичних стандартів аскорбінової кислоти, {{0}}кофеоілхінової кислоти та кверцетин-3-рутинозиду готували як чисті розчини та суміші в різних співвідношеннях. Усі можливі бінарні суміші виготовляли в еквімолярних співвідношеннях, а нееквімолярні співвідношення з однією сполукою подвоювали. Потрійні суміші також готували в еквімолярних співвідношеннях, а також в нееквімолярних співвідношеннях з подвоєнням однієї або двох сполук відповідно. Кінцеві концентрації антиоксидантів становили 0,3 мМ для кожного досліджуваного розчину. Крім того, усі експерименти повторювали після додавання 0.3 мМ заліза ({{10}}.15 мМ двовалентного заліза та 0,15 мМ двовалентного заліза) загалом на суміш. Вибрані кількості антиоксидантів і заліза не ґрунтуються на фізіологічних або харчових рівнях, вони ґрунтуються на молекулярних масах для вивчення ефекту молекулярної взаємодії. Таким чином, було встановлено еквімолярне співвідношення між загальними антиоксидантами та залізом. Усі суміші варили 0, 10, 20 і 40 хв в киплячій воді, а потім охолоджували на льоду, щоб припинити процес нагрівання. Це було зроблено для трьох незалежних повторів.

4.3. Фотометричні вимірювання

Антиоксиданти(чисті або змішані) за відсутності та присутності заліза вимірювали їхню загальну відновну та антиоксидантну активність у трьох незалежних технічних повторах за допомогою високопродуктивного методу в 96-лункових планшетах (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, США). Були використані різні тести через різні механізми реакції: перенесення одного електрона (SET) і перенесення атома водню (HAT). У той час як аналіз TEAC і TPC базується на SET [17,18], для тесту DPPH в літературі не зовсім ясно, чи він заснований на SET, HAT або навіть комбінації цих двох механізмів [{{6} }]. Недавнє дослідження Фоті [51] виявило, що феноли можуть реагувати з DPPH за допомогою послідовного переносу електронів із втратою протонів (SPLET), поєднання двох механізмів. Такі фактори, як середня полярність і потенціал іонізації, впливають на переважний механізм.

4.3.1. Загальний вміст фенолів (TPC)

Загальний вміст фенолу (TPC) визначали за допомогою методу Фоліна-Чіокальтеу в 96-лунковому планшеті, який раніше описували Bobo-Garcia та ін. [52]. з деякими змінами.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Загальна назва цього тесту вводить в оману, оскільки реактив Фоліна-Чокальтеу також реагує на нефенольні речовини, такі як вітаміни та мінерали [22]. Він краще описує «загальну відновну активність» біоактивних сполук.

4.3.2. Еквівалентна антиоксидантна здатність Trolox (TEAC)

Антиоксидантну активність визначали за допомогою аналізу TEAC у 96-лунковому планшеті з деякими модифікаціями. Основний розчин із 9,6 мг ABTS і 1,66 мг персульфату калію, заповнений H2O до 25 мл, готували та інкубували в темряві при кімнатній температурі протягом 12-16 год. З цього основного розчину готували робочий розчин TEAC, що містив 5 мл основного розчину, заповненого до 25 мл 100-відсотковим MeOH.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Поглинання радикалів

Theантиоксидантactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Синергізм і антагонізм

Для аналізу синергетичних та антагоністичних ефектів антиоксидантної активності проведено порівняння результатів, отриманих експериментально, з теоретичними значеннями, розрахованими за сумою ефектів окремих компонентів у відповідній концентрації [53]. Синергізм описує взаємодію двох або більше речовин так, що спільна дія є більшою, ніж сума кожної окремої дії. Навпаки, антагонізм — це явище, коли взаємодія двох або більше речовин у комбінації має загальний ефект, який є меншим, ніж сума їхніх окремих ефектів.

4.5. Визначення іонного заліза

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Різниця між загальним залізом та іонним залізом, сумою двовалентного та тривалентного заліза, є зв’язаним залізом.

4.6.ВЕРХ-DAD

Для кількісного визначення антиоксидантів аскорбінової кислоти, 5-кофеоілхінової кислоти та кверцетин-3-рутинозиду та продуктів їх розпаду в тих самих екстрактах, що використовуються для фотометричного дослідження

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） були підготовлені. Похідні сполуки були попередньо ідентифіковані шляхом аналізу чистих стандартів за присутності та відсутності заліза перед і після термічної обробки. Тому новий пік повинен походити від стандарту вставки. Крім того, вибрані суміші вимірювали за допомогою ВЕРХ-МС для перевірки запропонованої структури.

4.7. Статистичний аналіз

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Редмонд, США) і R Statistics (версія 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) використовувалися для тестів біостатистики та представлення та малювання результатів даних. Інференційну статистику для оцінки та зв’язування методів лікування проводили за допомогою тристороннього дисперсійного аналізу (ANOVA), ретроспективного тесту HSD Тьюкі та кореляції Пірсона. Використані пакети R були ggplot2 [55], mean [56] і multcomp [57].

5. Висновки

Виходячи з вищеописаних результатів, на AOA аскорбінової кислоти, 5-кофеоілхінової кислоти та кверцетин-3-рутинозиду впливають їх молекулярна структура, концентрація, співвідношення та взаємодія з іншими антиоксидантами та залізом. Здається, що взаємодія особливо відіграє важливу роль в AOA при поєднанні аскорбінової кислоти та 5-кофеоілхінової кислоти. Тут виявлено синергетичний і антагоністичний ефекти. Температура мала мінімальний вплив на АОА, в той же час температура впливала на стабільність усіх антиоксидантів у певних сумішах, особливо в присутності заліза. Лише концентрація аскорбінової кислоти зменшувалася за відсутності заліза з подовженим часом варіння, а концентрація 5-кофеоілхінової кислоти зменшувалася лише за присутності заліза, тоді як концентрація кверцетин-3-рутинозиду зменшувалася лише в комбінації з аскорбіновою кислотою в наявність заліза. У поєднанні із залізом 5-кофеоілхінова кислота змогла захистити інші молекули від зниження їхньої концентрації під час термічної обробки.

У рослинах комбінації аскорбінової кислоти, 5-кофеоілхінової кислоти та кверцетин-3-рутинозиду не тільки можливі, але й поширені. Отже, ці результати дають базові знання про процеси, які відбуваються під час варіння овочів. Харчові матриці є більш складними і містять незліченну кількість біологічно активних сполук, включаючи ферменти, інші мінерали або кислоти, які змінюють умови реакції або самі є реагентами. Ці складні взаємодії виходять далеко за межі цього дослідження, а корисні концентрації та взаємодіїантиоксидантиу варених овочах повинні бути розглянуті в майбутньому.

Список літератури

1. Меллор, Д.Д.; Наумовський, Н. Вплив какао на цукровий діабет: потенціал підшлункової залози та печінки як ключових органів-мішеней, більше ніж антиоксидантний ефект? Міжн. J. Food Sci. технол. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Крозьє, А.; Джаганат, І. Б.; Кліффорд, М. Н. Феноли, поліфеноли та дубильні речовини: огляд. Вторинні метаболіти в рослинах: поява, структура та роль у раціоні людини; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, USA, 2006; С. 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Міллер Д. Перехідні метали як каталізатори реакцій «автоокислення». Вільний радикал. Biol. Мед. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Бюхнер Н.; Крумбейн, А.; Рон, С.; Kroh, LW Вплив термічної обробки на флавоноли рутин і кверцетин. Швидка комун. Мас-спектр. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Лерісс, М.; Гарсіа-Касаль, Міннесота; Солано, Л.; Барон, MA; Аргуелло, Ф.; Лловера, Д.; Рамірес, Дж.; Літс, І.; Троппер, Е. Біодоступність заліза у людей зі сніданків, збагачених біс-гліцин хелатом заліза, фітатами та поліфенолами. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Харрелл, РФ; Редді, М.; Кук, Дж. Д. Інгібування всмоктування негемового заліза в організмі людини напоями, що містять поліфеноли. бр. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Костюк В.А.; Потапович А. І. Антирадикальні та хелатні ефекти у флавоноїдному захисті від пошкодження клітин, спричиненого діоксидом кремнію. Арк. Біохім. біофіз. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Кеїк, З.; Капланек, Р.; Масарік, М.; Бабула, П.; Матковський, А.; Філіпенський, П.; Весела, К.; Гбурек, Дж.; Сикора, Д.; Мартасек, П.; та ін. Комплекси заліза з флавоноїдною антиоксидантною здатністю та не тільки. Міжн. J. Mol. наук. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Латос-Брозіо, М.; Масек, А. Аналіз зв'язків структура-активність мономерних і полімерних поліфенолів (кверцетин, рутин і катехін), отриманих різними методами полімеризації. Chem. Біодайвери. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Гуллон, Б.; Лу-Чау, ТА; Морейра, Монтана; Лема, Дж.М.; Eibes, G. Rutin: Огляд методів екстракції, ідентифікації та очищення, біологічної активності та підходів до підвищення його біодоступності. Trends Food Sci. технол. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]