Частина 2: Новий підхід до посилення регенеративного потенціалу циркулюючих ендотеліальних клітин-попередників у пацієнтів із термінальною стадією захворювання нирок

Для отримання додаткової інформації. контактtina.xiang@wecistanche.com

3. Результати

3.1. Демографія пацієнта

Контрольна група та пацієнти з ESKD, які були включені в це дослідження, перераховані в таблиці 1. Демографічні параметри пацієнтів з ESKD, включаючи зріст і вагу тіла, тривалість діалізу, етіологію захворювання та вживання алкоголю, були зареєстровані та зібрані з медичних записів, які зберігаються Monash Health. , Клейтон, Вікторія, Австралія.

Незважаючи на те, що пізні культури EPC від усіх n{{0}} здорових пацієнтів були успішно отримані (з виходом ~1,5±0,3 × 10 градусів клітин/мл крові), дані були отримані з n=6-7 окремих культур, отриманих від пацієнтів, на групу лікування, щоб завершити різні проведені аналізи. Однак лише п’ять культур EPC із n=11 зразків крові пацієнтів із ESKD дозріли до пізніх EPC (з виходом ~2,2±0,3×10 градусів клітин/мл крові), дані з яких були отримані з n =3-5 окремих культур, отриманих від пацієнтів, на групу лікування. Крім того, кількість EPCколоній, отриманих від пацієнтів з ESKN (4,3±1,9; p<0.01 vs.="" epccolonies="" derived="" from="" patients)was="" significantly="" lower="" than="" those="" obtained="" from="" healthy="" patients="" (19.3±8.6;="" n="4" samples="" per="">

Натисніть тут, щоб познайомитися з пустельним женьшенем

3.2. Функціональний аналіз EPC, отриманих від контрольних пацієнтів

Пізні EPC, отримані та культивовані від здорових самців, експресували рецептор RXFP1 на поверхні їх клітин, як показано на малюнку 1A. Пізні EPC продемонстрували значне збільшення проліферативної здатності (на ~ 43 відсотки) через 24 години (Малюнок 1B); Утворення трубки, викликане EPC (як визначено довжиною трубки (на ~ 45 відсотків) і кількістю гілок, з’єднань і сіток (на ~ 60-90 відсотків) через 4 години (Малюнок 1C) і індуковане EPC загоєнням ран ( на ~60 відсотків) через 8 годин (рис. 1D), порівняно з необробленими клітинами при стимуляції 10 нг/мл RLX (усі р<0.05 vs.unstimulated="" cells),="" but="" not="" by="" 25%="" bm-msc-cm="" or="" 1="" ng/ml="">

Вражаюче те, що комбінований ефект 25 відсотків BM-MSC-CM і 10 нг/мл RLX ще більше посилив проліферацію EPC (~1.3-раз;p<0.001 vs.25%="" bm-msc-cm="" or="" 10="" ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 1b),="" epc-induced="" tube="" formation="" (including="" tube="" length="" (by~65%)and="" the="" number="" of="" branches,="" junctions="" and="" meshes="" (by~1.1-2.4-fold;="" figure="" 1c)="" over="" the="" same="" time-period="" and="" epc-induced="" wound="" healing="" (by="" ~87-88%)="" after="" 4-8="" h=""><0.01 vs.25%bm-msc-cm="" after="" 8="" h;="" figure="">

Для порівняння, 20 відсотків фетальної бичачої сироватки (позитивний контроль) стимулювало проліферацію EPC (на ~ 60 відсотків) через 24 години (p<0.001 vs.="" unstimulated="" cells;="" figure="" 1b)="" but="" failed="" to="" stimulate="" epc-induced="" capillary="" tube="" formation="" (figure="" 1c).="" based="" on="" these="" findings="" from="" healthy="" patient-derived="" epcs,="" the="" effects="" of="" 25%="" bm-msc-cm="" and/or="" 10="" ng/ml="" rlx="" were="" then="" evaluated="" on="" eskd="" patient-derived="">

Рисунок 1. Вплив CM та/або RLX, отриманих з BM-MSC, на життєздатність/проліферацію, ангіогенез і загоєння ран EPC, отримані від здорових пацієнтів. Було виявлено, що пізні EPC CD34t з крові здорових пацієнтів чоловічої статі експресують споріднений рецептор RLX, RXFP1; шкала =50 мкм （A）. Проліферація EPC через 24 години (24 години) від n =7 EPC, отриманих пацієнтом, на групу (B); EPC-опосередковане утворення трубки (визначається за загальною довжиною трубки, кількість гілок, кількість з’єднань і кількість сіток) через 4 години від n =6 EPC, отриманих пацієнтом, на групу (C) та EPC-опосередковане загоєння рани через 4 години та 8 годин від n=6пацієнта- похідні EPC на групу (D), визначали у відповідь на 20 відсотків фетальної бичачої сироватки (FBS; позитивний контроль), 25 відсотків BM-MSC-CM (25 відсотків CM), RLX [1 нг/мл (RLX{{26} }) або 10 нг/мл (RLX-10)] або комбінований ефект 25 відсотків CM і RLX-1 або RLX-10. Повне закриття рани було досягнуто необробленими EPCs протягом 24 годин. Типові зображення утворення капілярної трубки з необроблених EPC та EPC, оброблених 25 відсотками CM окремо або в поєднанні з RLX-10 (C) і закриття рани з необроблених EPC і тих, які оброблені 25% CM плюс RLX{{36} }(D). Кольорові кружечки в кожному зі стовпців кожної гістограми представляють окремі точки даних з кожної групи. Дані були проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим ретельним тестом Тьюкі, щоб уможливити численні порівняння між групами.*p<><><0.001 vs.untreated=""><><001, *=""><0001vs.25%cm-treated><><0.001 vs.rlx1-treated=""><><0.001 vs.rlx-10-treated=""><><0.01 y.25%cm+rlx-1-treated="">

3.3. Функціональний аналіз EPC, отриманих у пацієнтів з ESKD

Як описано раніше, лише п’ять культур EPC із n =11 зразків крові пацієнтів із ESKD дозріли до пізніх EPC, з яких дані були отримані з n =3-5 окремих культур пацієнтів/груп лікування. Ці EPC, отримані пацієнтами з ESKD, все ще експресували RXFP1 (що свідчить про те, що вони також могли реагувати на лікування RLX; рис. 2A), але мали знижену життєздатність і проліферативну здатність (на ~70 відсотків; p< 0.01="" vs.="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients)="" compared="" to="" their="" counterparts="" isolated="" and="" grown="" from="" normal="" patients="" (figure="" 2b).="" interestingly,="" the="" addition="" of="" 20%="" fbs="" (positive="" control)and="" all="" treatments="" evaluated,="" stimulated="" epc="" proliferation="" (by~1.2-1.6-fold)="" after="" 24="" h,="" almost="" back="" to="" levels="" that="" were="" measured="" from="" untreated="" epcs="" from="" normal="" patients(all="" no="" different="" from="" untreated="" cells="" derived="" from="" normal="" patients;="" figure="" 2b).10="" ng/ml="" rlx="" alone="" promoted="" epc-mediated="" tube="" length,="" number="" of="" junctions="" and="" number="" of="" meshes="" after="" 4h="" (all="" by~1-2.5-fold),="" whereas="" all="" three="" measures="" in="" addition="" to="" the="" number="" of="" branches="" were="" further="" increased="" by="" the="" combined="" treatment="" (all="" by~3.1-4.2-fold;="" all=""><0.05 vs.25%bm-msc-cm="" or="" 10ng/ml="" rlx="" alone;="" figure="" 2c).="" epc-induced="" wound="" healing="" in="" vitro="" from="" eskd="" patients="" took="" longer="" to="" achieve="" compared="" to="" that="" from="" healthy="" patients="" but="" was="" more="" rapidly="" stimulated="" by="" 10="" ng/ml="" rlx(by~54%)or="" the="" combination="" therapy="" (by="" ~63%)="" to="" almost="" complete="" closure="" after="" 24="" h="" (figure="">

Малюнок 2. Вплив CM та/або RLX, отриманих з BM-MSC, на життєздатність/проліферацію, ангіогенез і загоєння ран, отримані від пацієнта з ESKD V стадії. Було також виявлено, що пізні EPC, отримані з крові чоловіків-пацієнтів з ESKD, експресують RXFP1; шкала bar= 50 um (A). Проліферацію EPC через 24 години (24 години) визначали за n=4 EPC, отриманими пацієнтом, на групу у відповідь на 20% FBS (позитивний контроль), 25% BM -MSCCM (25 відсотків CM), RLX [10 нг/мл (RLX-10)] або комбінований ефект 25 відсотків CM плюс RLX-10. Дані нелікованих EPC, отримані від здорових пацієнтів чоловічої статі (наведені на малюнку 1B) також включені для порівняння (B). EPC-опосередковане утворення трубки (визначається на основі загальної довжини трубки, кількості розгалужень, кількості з’єднань і кількості сіток) через 4 години з n=3 отриманих пацієнтом EPC на групу (C) та EPC-опосередкованого загоєння рани через 24 години з n=5 EPC, отриманих пацієнтом, на групу (D), визначався у відповідь на 25% BM-MSC-CM (25% CM), RLX[10 нг/мл (RLX-10)] або комбінований ефект 25 відсотків CM плюс RLX-10. Показано репрезентативні зображення формування трубки (C) і закриття рани (D) для кожної з чотирьох проаналізованих груп. Кольорові кружечки в кожному зі стовпців кожної гістограми представляють окремі точки даних з кожної групи; в той час як кумулятивний відсоток загоєння рани в кожній із досліджуваних груп протягом 24 годин показано (C).*p<><><0001 vs="" untreated=""><><001 vs.25%cm-treated="" cells;=""><0.05,><0.01 vs.rlx-10-treated="">

4. Обговорення

Попередні дослідження показали, що кількість EPCs зменшується у пацієнтів з ESKD, що корелює зі значним збільшенням смертності, спричиненої захворюванням. Також повідомлялося, що тривалий гемодіаліз, який вважається основною терапією ESKD, також може сприяти збільшенню цієї спричиненої ESKD втрати EPC у пацієнтів. Однак інші дослідження також повідомляли, що гемодіаліз у пацієнтів з ESKD не спромігся відновити здатність самих EPC до проліферації та міграції in vitro порівняно з EPC, отриманими у здорових пацієнтів. Ці сукупні висновки дали обґрунтування того, чому терміново потрібні агенти, які могли б покращити проліферацію та функцію EPC. Оскільки розширення EPCyield для алогенної терапії виявилося дещо складним і трудомістким, наше дослідження запропонувало нове лікування шляхом поєднання CM, отриманого з BM-MSC, і RLX для посилення проліферації EPC і функціональних можливостей підвищених EPC in vitro, з основним зосереджено на забезпеченні дослідження підтвердження концепції для прямого клінічного перекладу в модулюванні регенеративної здатності EPCs in vivo. Це дослідження вперше продемонструвало терапевтичний потенціал поєднання BM-MSC-CM з RLX як засобу сприяння життєздатності, проліферативної та регенеративної здатності EPC людини.

У цьому дослідженні ми продемонстрували успішне виділення та характеристику ранніх і пізніх EPCs із крові здорових пацієнтів і пацієнтів із ESKD, яку було зібрано з невеликого об’єму крові (близько 5-40 мл). Більшість попередніх досліджень використовували приблизно 50 мл периферичної крові як вихідний об’єм для виділення EPC [24-26]. Деякі дослідження не вказують початковий об’єм крові, необхідний для виділення EPC. Крім того, пізні EPC були ідентифіковані відповідно до їх морфології, а також їх високої проліферативної здатності та здатності утворювати колонії з 20 мл периферичної крові, що свідчить про те, що для отримання EPC, які могли б проліферувати, було потрібно мінімум 20 мл периферичної крові. . У цьому дослідженні, хоча кількість зразків для пацієнтів з ESKD була з невеликої когорти порівняно з контрольними суб’єктами, з початковим об’ємом ~5 мл периферичної крові, ми визначили, що результати EPC були не тільки низькими, але й не завжди могли прогресувати. диференціація в пізні EPC колонії. Крім того, ранні EPC спостерігалися у здорових контрольних осіб у 6-10 дні культивування, тоді як пізні EPC з’являлися через 14-28 днів культивування. Ці спостереження узгоджувалися з попередніми звітами [25]. Декілька факторів можуть сприяти диференціації або трансформації PBMC у ранні та пізні EPC.

Хоча лише BM-MSC можуть викликати репаративні ефекти в нирках через їх протизапальну, антиапоптотичну, антиоксидантну, проангіогенну дію та стимуляцію EPC, терапевтична ефективність цих стовбурових клітин серйозно знижується в умовах хронічних захворювань 30. Також було показано, що BM-MSCs мають більший ренопротекторний ефект у багатьох різних експериментальних моделях і наразі оцінюються в різних клінічних дослідженнях [31]. Проте менша кількість досліджень досліджувала ангіогенну роль МСК у фіброзних моделяххвороба печінки. В одному дослідженні повідомлялося про вплив МСК на судинну систему нирок, у якому кондиціоноване середовище з BM-MSC, збагачене факторами росту, такими як VEGF, HGF та IGF-1, могло посилити ріст EC аорти та поширення. Крім того, дослідження на доклінічній моделі хвороби Альпорта (генетичний стан, що характеризується мікросудинними аномаліями та функціональною недостатністю нирок) показало, що миші, які отримували MSC-CM, експресували високий рівень мРНК VEGFR у нирках, але не в нирках. кровообігу, а також посилюєтьсянирковийПроліферація EC in vitro.

Попереднє дослідження показало, що цитокіни та фактори росту всередині CM пуповини-MSC значно збільшили кількість трубок і відсоток відновлення рани ендотеліальних клітин судин пуповини людини (HUVEC) in vitro. Механізм, що лежить в основі цієї властивості, було ідентифіковано за допомогою підвищеної експресії цитокінів SDF-1-CXCR4 і MCP-1, які підвищили швидкість міграції HUVEC для закриття ранової області, створеної під час аналізів загоєння ран, проведених . Однак, враховуючи наші попередні дослідження, які продемонстрували, що лише 100% BM-MSC-CM може значно стимулювати показники проліферації EPC, утворення капілярних трубок, ангіогенезу та загоєння ран, тоді як титрування BM-MSC-CM до 25 відсотків зменшило ці показники. ефектів, у поточному дослідженні було використано 25 відсотків BM-MSC-CM, щоб можна було оптимально визначити потенційні синергетичні ефекти 25 відсотків CM і RLX.

RLX демонструє свій ангіогенний потенціал, індукуючи VEGF і основний фактор росту фібробластів (bFGF) на ранових ділянках у мишей. Крім того, було показано, що RLX збільшує внутрішньоклітинний NO, отриманий з кісткового мозку людини, а також міграцію у мишей, що свідчить про те, що RLX може сприяти ангіогенезу in vivo. Однак було помічено, що RLX не зв’язувався безпосередньо з ECs, а скоріше індукував ангіогенез завдяки своїй здатності стимулювати фактори росту, які відіграють роль у загоєнні ран. Навпаки, це дослідження продемонструвало, що життєздатність/проліферація, утворення трубок і здатність до загоєння ран EPC були значно покращені при введенні 10 нг/мл RLX, що відповідає попереднім висновкам [18]. Крім того, було помічено, що як ранні, так і пізні EPC експресують рецептор RXFP1, що свідчить про те, що RLX зможе безпосередньо зв’язуватися зі своїм рецептором на EPC для сприяння проліферації EPC та індукованого EPC ангіогенезу in vitro.

Попередні дослідження нашої лабораторії продемонстрували, що поєднання BM-MSC та RLX більш ефективно ослаблює або реверсує органзапаленняі фіброз у мишачих моделях обструктивної нефропатії [15], гіпертонічної хворобиХХН, або хронічне алергічне захворювання дихальних шляхів (AAD)[37] in vivo. Результати цього дослідження тепер розширили ці висновки, щоб продемонструвати, що комбіновані ефекти CM і RLX, отримані з BM-MSC, можуть підвищити життєздатність і швидкість проліферації людських EPC, отриманих пацієнтами з ESKD, in vitro (до рівнів, виміряних у здорових пацієнтів), і здатність цих клітин сприяти ангіогенезу. Це було продемонстровано підвищеною здатністю комбінованої терапії сприяти утворенню капілярної трубки та загоєнню ран, спричиненому EPC, порівняно з монотерапією CM. У цьому контексті можливо, що опосередковані NO васкулогенні ефекти RLX, які призвели до індукованого RLX (при 10 нг/мл) збільшення числа EPC і опосередкованого EPC загоєння ран, були синергетично посилені ефектами EPC, що сприяють ангіогенні медіатори (такі як VEGF і bFGF), які секретуються BM-MSC-CM і стимулюються RLX. Незважаючи на природу цього дослідження ex vivo та невелику кількість проаналізованих культур EPC, отриманих пацієнтами з ESKD, синергічні переваги оцінюваної комбінованої терапії були чітко очевидними.

5. Висновки

Оскільки збільшення виходу EPC за допомогою алогенних терапевтичних засобів виявилося складним і трудомістким, ця нова терапія може мати великі надії як лікування хворих на ESKN. Загалом, результати цього дослідження мають високу клінічну значущість, особливо для пацієнтів з ESK, у яких втрата циркулюючої кількості EPC сприяє порушенню росту та ангіогенезу, несприятливим серцево-судинним наслідкам і пов’язаній із цим смертності. Крім того, оскільки пацієнти з ESKN часто помирають відзахворювання судин(атеросклероз, інсульт, захворювання периферичних судин) [40], ця комбінована терапія може забезпечити новий засіб уповільнення прогресування судинних захворювань у цих пацієнтів. Крім того, розробка нової терапії, яка може сповільнити прогресування ХХН, заощадить системі охорони здоров’я мільярди доларів на замісній нирковій терапії. Оскільки як MSC, так і RLX вже проходять клінічну оцінку, нові стратегії, що включають цю комбіновану терапію, можуть бути швидко відстежені для випробувань на людях.