Частина 1: Гомоаргінін полегшує діабетичну нефропатію незалежно від синтази оксиду азоту-3

контактtina.xiang@wecistanche.com

Анотація

Нещодавно ми показали, що додавання гомоаргініну забезпечує захист нирок у моделей діабетичних мишей. У цьому дослідженні ми перевірили, чи є захисний ефект гомоаргініну незалежним від синтази оксиду азоту-3 (NOS3) при діабетичній нефропатії (DN). Експерименти проводили на мишах з дефіцитом NOS3 (NOS3-7) та їхніх однопослідних тварин дикого типу з використанням кількох низьких доз носія або стрептозотоцину та лікування гомоаргініном через питну воду протягом 24 тижнів. Додавання гомоаргініну протягом 24 тижнів у діабетичних NOS3-/мишей значно послаблювало альбумінурію, підвищення азоту сечовини в крові, гістопатологічні зміни та фіброз нирок, ниркові фіброзні маркери та рекрутування ниркових макрофагів порівняно з діабетичним NOS, який отримували носій3- / миші. Крім того, гомоаргінін відновив мітохондріальну функцію нирок після діабету. Важливо, що не було значних змін у експресії мРНК NOS1 або NOS2 у нирках між усіма групами. Крім того, добавки гомоаргініну покращили серцеву функцію та зменшили серцевий фіброз після діабету. Ці дані демонструють, що захисний ефект гомоаргініну не залежить від NOS3, що зрештою змінить наше розуміння механізму(ів), за допомогою якого гомоаргінін індукує захист нирок і серця при ДН. Захисний ефект гомоаргініну при ДН може бути опосередкований через покращення функції мітохондрій.

Ключові слова: серцева функція, діабетична нефропатія, гомоаргінін, NOS3

Натисніть, щоб дізнатися, для чого використовується цистанх

1. ВВЕДЕННЯ

Цукровий діабетє серйозною та все більш поширеною причиною захворюваності та смертності в Сполучених Штатах, за оцінками, 12-14 відсотків дорослих хворіють на діабет, а серед етнічних меншин цей показник ще вищий (Gao et al, 2016; Menke et al, 2015). . Економічні втрати та втрати продуктивності через діабетичні ускладнення становлять понад 245 мільярдів доларів США та призводять до фізіологічних та психологічних наслідків, включаючи системнізапалення, порушення роботи нирок і серця, депресія та соціальна тривожність (Jha та ін., 2018; Менке та ін., 2015; Морено та ін., 2018; Тао та ін., 2015; Vanstone та ін., 2015). Діабетична нефропатія (ДН) - це хронічне прогресуюче захворювання, що призводить до швидкого зниження та кінцевої стадії ниркової недостатності. За останнє десятиліття частота ниркової недостатності внаслідок діабету подвоїлася. Традиційні методи лікування, включаючи контроль артеріального тиску та рівня глюкози та інші зміни способу життя, лише помірно успішні у затримці прогресування ниркової недостатності. Таким чином, важливо визначити механізми, що беруть участь у розвитку та прогресуванні цукрового діабетухвороба печінки. Cistanche deserticolaвідноситься до традиційної китайської медицини і є препаратом, що тонізує нирки. Він в основному використовується при дефіциті нирок-ян, такому як біль у спині, біль у спині, імпотенція тощо. Однак у більшості хворих на цукровий діабет є дефіцит інь, і якщо у них є дефіцит ян, вони можуть приймати його належним чином. Однак його слід застосовувати з обережністю при таких проявах негативного жару, як страх перед спекою і нічна пітливість, сухість у роті. У будь-якому випадку спочатку проконсультуйтеся з лікарем.

Гомоаргінін, ендогенний аналог аргініну, який не бере участі в синтезі білка, став новим гравцем у здоров’ї та хворобах (Pilz та ін., 2015). Гомоаргінін синтезується мітохондріальною аргінін: гліцин-амідинотрансферазою (AGAT) у нирках з використанням L-аргініну та L-лізину як субстратів (Choe та ін., 2013; Ryan & Wells, 1964), і катаболізується за допомогою аланін: гліоксилат-амінотрансферази 2 (AGXT2). (Родіонов та ін. 2016). Концентрація гомоаргініну в плазмі обернено корелює з ризиком серцево-судинних захворювань і загальної смертності (Jud et al., 2018; Marz et al, 2010), підвищеним ризиком фатальних інсультів (Haghikia et al., 2017), застійної серцевої недостатності та гіпертрофія лівого шлуночка (Atzler та ін., 2013, 2017; Bahls та ін., 2018; Pilz, Edelmann та ін., 2014), старіння (Atzler, Schwedhelm та ін., 2014; Marz та ін., 2010) , куріння (Atzler, Gore та ін., 2014; Sobczaket al., 2014; Vogler та ін., 2015; Zwan та ін., 2013), індекс маси тіла (Atzler, Gore та ін., 2014; Marz та ін., 2010). ; Pilz, Teerlink та ін., 2014) і вагітність (Valtonen та ін., 2008). Низький рівень гомоаргініну є індикатором серцевої дисфункції з пов’язаним високим рівнем асиметричного диметиларгініну (ADMA) (Atzler, Schwedhelm, et al., 2014; Jud et al., 2018; Kayacelebiet al., 2014; Pilzet al., 2015 ; Vogler al, 2015). Вплив низького рівня гомоаргініну на виробництво/дію оксиду азоту (NO) пов’язують із підвищеним ризиком інсульту та атеросклерозу (Haghikia et al, 2017). Ендотеліальна синтаза оксиду азоту (NOS3) конститутивно експресується в ендотеліальних клітинах і функціонує для регулювання внутрішньоклітинних рівнів NO у відповідь на рівні кальцію (Zanchi et al., 2000). Гомоаргінін може брати участь у синтезі NO, слугуючи субстратом для NOS, оскільки гомоаргінін, навіть маючи меншу спорідненість до NOS порівняно з аргініном, може метаболізуватися до NO та гомоцитруліну (Drechsler et al., 2011). У нирках низький рівень гомоаргініну є сильним фактором ризику раптової серцевої смерті та смерті внаслідок серцевої недостатності у пацієнтів на гемодіалізі (Drechsler et al., 2011). Крім того, низькі рівні гомоаргініну пов’язані з підвищеним ризиком розвитку серцево-судинних захворювань у пацієнтів після трансплантації нирки (Kayacelebi та ін., 2017). Як у тварин (Banchaabouchi та ін., 2001; Тофуку та ін., 1985), так і у людей (Drechsler та ін. 2013) при хронічних ураженнях нирок рівні гомоаргініну знижуються, а низькі рівні гомоаргініну в плазмі крові були значно пов’язані зі зниженою швидкістю клубочкової фільтрації (ШКФ) і протеїнурією (Ravani et al., 2013). Хоча епідеміологічні дані показали, що зниження рівня гомоаргініну було пов’язане зі збільшенням смертності від захворювань нирок і серцево-судинної системи (Drechsler et al., 2015; Jud et al., 2018; Marz et al., 2010; Ravani et al., 2013), прямі фізіологічні механізми гомоаргініну залишаються неясними. Раніше ми показали, що гомоаргінін є ефективним засобом лікування DN (Wetzel et al., 2019). Однак механізм дії гомоаргініну при порушенні функції нирок і серця невідомий.

У поточному дослідженні ми перевірили гіпотезу про те, що захисний ефект гомоаргініну на функції нирок і серця при діабеті не залежить від NOS3. Наші результати показують, що гомоаргінін опосередковує захист нирок і серця у діабетичних мишей NOS3-一, що зрештою змінить наше розуміння механізму(ів), за допомогою якого гомоаргінін полегшує діабетичне ураження нирок. Захисний ефект гомоаргініну при ДН може бути опосередкований через покращення функції мітохондрій.

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

2.1 Модель миші з діабетом

Усі експерименти на тваринах проводили на самцях6-тижневих мишей (The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J або NOS3-1-Harbor, ME). Мишей утримували при 23 градусах С і циклі світло-темрява 12:12 із вільним доступом до стандартної їжі та води. Діабет був викликаний внутрішньоочеревинною ін’єкцією 50 мг/кг стрептозотоцину (STZ) або фізіологічного розчину після 6--годинного голодування протягом 5 днів поспіль. Всі процедури проводили вранці протягом усього дослідження. Рівень глюкози в крові вимірювали у мишей, які не голодували, за допомогою глюкометра Contour Next EZ зі смужками Contour Next із хвостової вени мишей, причому рівень глюкози в крові мишей із цукровим діабетом був вище 350 мг/дл. L-гомоаргінін (Sigma, St. Louis MO, Cat #: H1007) додавали в питну воду в концентрації 50 мг/л, як описано раніше (Wetzel et al., 2019), і замінювали кожні 4 дні. Наприкінці дослідження (24 тижні)24-зразки сечі збирали, мишей піддавали евтаназії за допомогою внутрішньоочеревинної ін’єкції коктейлю кетаміну/ксилазину; плазма була отримана шляхом пункції серця, а нирки і серця були вилучені для подальших досліджень. Для збору сечі мишей поміщали окремо в метаболічні клітини на 16 годин із вільним доступом до питної води, а сечу збирали в збірні пробірки, що містять 200 мкл мінерального масла, яке запобігає випаровуванню сечі. Кров збирали пункцією серця і центрифугували при 3000 g протягом 3 хвилин при 4 градусах для відділення плазми. Після збору всі зразки зберігалися при -80°C до аналізу. Кількість мишей на групу наведено в таблиці 1. Зразки, отримані від мишей Ins2Aita, були отримані, як описано раніше (You et al., 2015). Усі досліди на тваринах були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Техаського університету в Сан-Антоніо.

2.2 Імуногістохімія

Тканини нирок миші фіксували в 10-відсотковому формаліні та заливали в парафін, а потім вирізали зрізи 3- мкм. Імуногістохімію проводили на залитих парафіном зрізах з антитілом Mac-2 проти миші (клон M3/38; Cedarlane, Burlington, NC), як описано раніше (You et al., 2013, 2014). Зображення були зроблені за допомогою мікроскопа Olympus BX60 і цифрової камери Olympus Q-Color3 за допомогою програмного забезпечення для зображень Q-capture Pro 7. Кількість гломерулярних макрофагів підраховували в 20 клубочках на зріз (кількість макрофагів у клубочках, поділена на кількість клубочків) сліпим способом при 40-кратному збільшенні та усереднювали, як описано раніше (Morris et al., 2011; Wetzel et al., 2019; You et al., 2013, 2014).

2.3 Гістопатологія нирок і серця

Нирки та серця фіксували в 4-відсотковому параформальдегіді, заливали в парафін і вирізали 5- мкм зрізи. Зрізи фарбували трихромом Массона або періодичною кислотою-Шиффом (PAS), досліджували сліпим способом і оцінки усереднювали. Щоб визначити відсоток площі фіброзу, трихромні зображення Массона були отримані в 10 разів і проаналізовані в ImageJ для вимірювання відсотка площі фіброзу. Репрезентативні зображення були зроблені за допомогою мікроскопа Olympus BX60 і цифрової камери Olympus Q-Color3 за допомогою програмного забезпечення для зображень Q-capture Pro 7. Характеристики клубочків вимірювали за допомогою програмного забезпечення Bioquant Osteo (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN), і індекс відсотка пошкодження розраховували, як описано раніше (Mohan et al., 2008). Для кожної нирки ми отримали 12 зображень і проаналізували клубочок для кожного поля, щоб усереднити для кожної тварини для статистичного аналізу.

2.4 Аналітична методологія

Концентрацію альбуміну в сечі вимірювали методом ELISA з використанням набору Albuwell M (Excell, Philadelphia, PA), як описано раніше (Awad, You, Gao, Gvritishvili та ін., 2015). Креатинін сечі вимірювали за допомогою аналізу креатиніну Diazyme (Diazyme Laboratories, Poway, CA) (Awad та ін., 2011; Awad, You, Gao, Cooper та ін., 2015). Азот сечовини крові (BUN) визначали за допомогою набору для аналізу сечовини QuantiChrom (BioAssay Systems, Hayward, CA), як описано раніше (You et al., 2017). Систолічний тиск миші вимірювали за допомогою системи неінвазивного артеріального тиску CODA (Kent Scientific Corporation, Torrington CT), як описано раніше (Awad, You, Gao, Gvritishvili та ін., 2015). Мишей акліматизували протягом 10 хвилин при 26 градусах перед початком вимірювання. Показання брали в один і той же час доби для всіх груп, щоб запобігти будь-яким добовим коливанням.

2.5 Вимірювання функції серця

Послідовну ехокардіографію в B-режимі та M-режимі проводили за допомогою платформи візуалізації Vevo 2100 (VisualSonics, Торонто, Канада) з використанням лінійного датчика 30- МГц для точного моніторингу гемодинамічних параметрів серця та оцінки структури серця мишей через 22 тижні лікування гомоаргініном. Фракція викиду лівого шлуночка (ФВ) і фракційне скорочення лівого шлуночка (ФС) були кількісно визначені за допомогою М-режиму, як описано раніше (lorga та ін., 2016, 2018).

2.6 Виділення РНК і ПЛР у реальному часі

РНК виділяли за допомогою тризольної екстракції з цілих зрізів нирок і зворотно транскрибували в кДНК за допомогою набору для синтезу ДНК Bio-Rad (Hercules, CA). ПЛР у реальному часі проводили на системі реального часу CFX384 (Bio-Rad, Hercules, CA) з використанням праймерів Tagman для MCU миші (Mm0116873_m1), фібронектину (Mm01256744_m1), росту пухлини фактор (TGF, Mm01178820_m1), NOS1(Mm00435175_m1), NOS2(Mm00440502_m1) і Rn18S (Mm03928990_gl) (Thermo Fisher, Waltham, MA). Значення Ct нормалізували до 18S і порівнювали зі зразками NOS3. Праймери для гладком’язового актину (FW:5’-CTGCCGTTTTCCCCCTTCCTG-3’, RV:5’-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3’), E-кадгерину (FW: 5'-TGAGTGTGTGGGTGCTGA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3') і -актин (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGAGG-3) були отримані від Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Зразки кДНК аналізували за допомогою SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Rockford IL), як описано раніше (Morris et al., 2011), і нормалізували до -актину для порівняння зі зразками NOS3-/-.

2.7 Вестерн-блот

Тканина нирок була гомогенізована в буфері RIPA, що містив {{0}}.1% Triton X-100 з додаванням інгібіторів протеази (Roche Diagnostics, Індіанаполіс, Індіана) та очищена центрифугуванням при 10,{{4} } g протягом 10 хвилин при 4 градусах, і супернатант збирали. Концентрацію білка визначали методом біцинхонової кислоти (BCA) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Зразок 50 мкг ниркового лізату відокремили на 4-12% біс-трис-гелю (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія) і перенесли на мембрани PVDF перед блокуванням 5% сухим молоком. Вестерн-блоти проводили з використанням таких антитіл: MiCU1 (0,4 мкг/мл; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Миссурі) та -актину (1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA) антитіла. Вестерн-блоти кількісно оцінювали за допомогою програмного забезпечення ImageJ (NIH, Bethesda, MD) і нормалізували експресію білка -актину.

2.8 Статистичний аналіз

Порівняння між усіма групами проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (версія 7.04, Сан-Дієго, Каліфорнія). Результати виражені як середнє значення ± SEM. Для порівняння значущості між групами використовували однофакторний дисперсійний аналіз із подальшим тестом Фішера на різницю найменшої значущості. Значення p<0.05 represented="" a="" significant="">