Частина 1: Вплив ізорхамнетину на діабет та пов’язані з ним ускладнення: огляд досліджень in vitro та in vivo та аналітичний транскриптомний аналіз залучених молекулярних шляхів

Для отримання додаткової інформації. контактtina.xiang@wecistanche.com

Анотація: Цукровий діабетцукровий діабет, особливо типу 2 (ЦД 2), є серйозною проблемою охорони здоров’я в усьому світі. ЦД характеризується високими рівнями глікемії та інсулінемії внаслідок порушення секреції інсуліну та чутливості клітин до інсуліну, відомого як інсулінорезистентність. СД2 викликає численні та серйозні ускладнення, такі як нефропатія, нейропатія та ретинопатія, що спричиняє окислювальне пошкодження клітин у різних внутрішніх тканинах, зокрема підшлунковій залозі, серці, жировій тканині, печінці та нирках. Рослинні екстракти та їх біологічно активні фітохімічні речовини набувають інтересу як нові терапевтичні та профілактичні альтернативи ЦД2 та пов’язаних з ним ускладнень. У зв'язку з цим ізорамнетин, рослинафлавоноїд, вже давно досліджено його потенційні протидіабетичні ефекти. У цьому огляді описано його вплив на зменшення розладів, пов’язаних з діабетом, шляхом зниження рівня глюкози, покращення окисного статусу, полегшення запалення та модуляції метаболізму ліпідів і диференціації адипоцитів шляхом регулювання залучених сигнальних шляхів, про які повідомлялося в дослідженнях in vitro та in vivo. Крім того, ми включаємо аналітичний транскриптомний аналіз повного генома біологічної активності ізорамнетину за допомогою інструменту на основі стовбурових клітин.

Ключові слова: ізорамнетин; кверцетин; біологічна активність; діабет; молекулярні шляхи; мікрочіп

Натисніть тут, щоб дізнатися більше контактів

1. Введення

З давніх часів рослини використовувалися як традиційні ліки майже на всіх континентах світу. Наукові дослідження причин їх використання в медичних цілях привели до дослідження біоактивних молекул. Екстремофільні рослини, які ростуть в екстремальних умовах навколишнього середовища, вважаються хорошим потенційним джерелом цікавих біологічно активних молекул. Насправді ці обмеження навколишнього середовища є причиною дисфункціонального метаболізму кисню, що призводить до окислювального стресу через збільшення активних форм кисню (АФК) [1,2]. Деякі рослини, наприклад галофіти, мають потужнуантиоксидантсистема усунення цих шкідливих сполук. Серед біоактивних молекул, що представляють інтерес, є фенольні сполуки. Кілька досліджень оцінювали рослини, багаті поліфенолами, з обмежувальними умовами в лабораторії або без них [3-10]. Екстрактам, багатим на поліфеноли, приписують кілька біологічних ефектів, наприклад, протизапальну та протипухлинну дію [11-13]. Інші дослідження показали антиоксидантний, протимікробний [8,14-16], а також проти ожиріння, протидіабетичного та протипечінкового стеатозу [17-19] ефект ізорамнетину. Серед цих поліфенолів,флавоноїдивиділяються. Ця група включає кілька підгруп, наприклад флавоноли. Ізорамнетин є однією з основних сполук флавонолів. Ізорамнетин є монометоксифлавоном або O-метильованим флавонолом з класу флавоноїдів. це єкверцетинв якому метоксигрупа заміщає гідроксигрупу в положенні 3'. Деякі похідні ізорамнетину присутні в природі, наприклад ізорамнетин 3-O- -d-глюкопіранозид, ізорамнетин 3-O-неогесперидозид та ізорамнетин 3-O-рутинозид з Calendula officinalis L [20]. Ізорамнетин має значні біологічні властивості, такі як антиоксидант [21], протираковий [22], протимікробний [23], противірусний [24], протизапальний і протидіабетичний ефекти [21,25-33].

У цьому огляді основна увага зосереджена на походженні, хімічній структурі, методах виділення та екстракції, а також на фітохімічному аспекті ізорамнетину. Потім, у другій частині, ми зосереджуємось на описі потенційних антидіабетичних ефектів цього флавонолу шляхом зменшення розладів, пов’язаних з діабетом, шляхом зниження рівня глюкози, покращення окисного статусу, полегшення запалення та модуляції метаболізму ліпідів і диференціювання адипоцитів. Нарешті, ми провели вторинний аналіз наших раніше опублікованих даних повного генома мікрочіпів, щоб дослідити пов’язану з діабетом біоактивність ізорамнетину в інструменті на основі стовбурових клітин. Ми також прагнемо підкреслити вплив цієї молекули на регуляцію залучених сигнальних шляхів, повідомляючи про дослідження in vitro та in vivo, які використовуються в цій галузі досліджень. У цьому огляді ми розкрили особливості протидіабетичної активності ізорамнетину в порівнянні зкверцетинякий вважається метаболітом ізорамнетину та важливим джерелом природного лікування діабету.

2. Загальний огляд біоактивних молекул, зокрема поліфенолів і флавоноїдів

2.1. Окислювальний стрес як джерело біоактивних молекул у рослинах

Кілька рослин можуть піддаватися впливу різних умов навколишнього середовища (засолення, посуха, УФ-промені, важкі метали, екстремальні температури, дефіцит поживних речовин, забруднення повітря та атаки патогенів). Ці обмеження є джерелом дисфункцій кисневого метаболізму, які генерують окислювальний стрес шляхом збільшення активних форм кисню (АФК). Молекула кисню (O2) відіграє важливу роль у фотосинтезуючих організмах. Спочатку у вищих рослин і водоростей газообмін за участю електронів відбувається в хлоропластах шляхом захоплення вуглекислого газу протягом дня та виробництва кисню. У цьому газообміні беруть участь електрони. Дійсно, у разі суворих екологічних обмежень велика частина кисню не відновлюється і, таким чином, може генерувати АФК у деяких органелах рослинних клітин [1,2] через дисбаланс у належному функціонуванні хлоропластів і передачі електронів [ 1]. Крім того, за умов навколишнього середовища, згаданих вище, утворюється багато АФК, таких як гідроксильний радикал (OH), супероксидний аніонний радикал (O,-), алкоксильний і пероксильний радикали (RO: і RO2 відповідно), перекис водню (H2O2, ), гіпохлоритний радикал (-OCl), синглетний кисень (O2), радикал оксиду азоту (NO) та інші пероксиди ліпідів (такі як малоновий діальдегід і 4-гідроксиноненал) [2,34,35]. Іноді АФК можуть відігравати роль у передачі клітинних сигналів у фізіологічній поведінці рослин, наприклад, у процесі росту та розвитку насіння, розвитку тканин та переході від клітинної проліферації до клітинної елонгації на ранніх стадіях диференціювання [36] . На високому рівні ці молекули викликають молекулярні пошкодження, такі як перекисне окислення ліпідів мембран, зміна білків і ДНК і загибель клітин [1,35,37]. Деякі рослини, такі як галофіти, мають здатність добре адаптуватися до цих умов завдяки потужній антиоксидантній системі. Відомо, що галофіти є джерелом вторинних метаболітів, таких як поліфеноли [3-10]. Ці автори показують, що в суворих умовах синтезуються поліфеноли, які відіграють важливу роль у захисті від окисного пошкодження, спричиненого стресом. Біосинтез, вміст і активність цих фенольних сполук є функцією кількох зовнішніх (світло, температура, солоність і сухість) і внутрішніх (генотип, орган і стадія розвитку) параметрів, що впливають на їх вміст і розподіл у рослинах [ 8,38,39]. Наприклад, у Pyracantha coccinea деякі флавоноїди, такі як флаванони, флавони та флавоноли, присутні в пагонах під час вегетативної фази та в коренях виключно під час репродуктивної 40]. З іншого боку, кілька авторів показали, що ці фенольні сполуки мають інші біологічні властивості, такі як протизапальна та протипухлинна активність [11-13]. Інші дослідження показали антиоксидантну, протимікробну [8,14-16], а також протидіабетичну [18,41,42] дію фенольних екстрактів.

2.2. Класифікація природних антиоксидантів

Антиоксидантну систему можна класифікувати відповідно до природи цих компонентів на ферментативні та неферментативні сполуки. До перших належать супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ), аскорбатпероксидаза та глутатіонредуктаза [1,3542-44]. Гени, пов’язані з цими ферментами, показали їхню важливість під час післязбирального фізіологічного погіршення запасного кореня та у відповідь на осмотичний стрес і абсцизову кислоту, а також інфекцію Xanthomonas axonopodis [44]. Друга група містить переважно фенольні сполуки, каротиноїди, вітаміни та осмоліти [1]. Фенольні сполуки характеризуються наявністю одного або кількох бензольних кілець і відрізняються складністю основної молекули, кількістю і розташуванням гідроксилу, ступенем полімеризації. Ці сполуки є вторинними метаболітами, які поділяються на три великі групи: фенольні кислоти (похідні бензойної та коричної кислот), флавоноїди (флавоноли, флавоноли, флаванони, флавони, антоціани) та таніни (гідролізовані таніни та проантоціанідини). Крім цих молекул, виділяють стильбени, лігнани, кумарини [45].

2.3. Походження та біохімічна структура флавоноїдів, зокрема ізорамнетину

Фенольні сполуки є вторинними метаболітами, поширеними в рослинах. Ці сполуки мають ароматичне кільце з однією або декількома гідроксильними групами (OH) і містять молекули від простих фенольних кислот до полімеризованих сполук, таких як дубильні речовини. Синтез фенольних сполук — складний процес, який проходить у декілька стадій. Фенольні сполуки є біологічно активними молекулами з двома шляхами походження: з одного боку - шикімова кислота, а з іншого боку - молекули фенілпропаноїдів. Біосинтез флавоноїдів, таких як ізорамнетин, базується на цих шляхах. Фактично, з одного боку, шикімат дає основний скелет поліфенолів, які мають одне або більше бензольних кілець (C6), що несуть одну або більше гідроксильних функцій. З іншого боку, існує синтез основи C6-C3, утвореної конденсацією фенілаланіну до коричної кислоти (рис. 1)[46].

Точніше, шикімовая кислота лежить в основі кількох реакцій, представляючи каркас ароматичних амінокислот, які є ініціаторами фенольних сполук. Перший етап складається з поєднання двох молекул: фосфоенолпірувату та еритрозо{0}}фосфату, які після чотирьох реакцій призводять до формування першого скелета фенольних сполук: шикімату або шикімової кислоти (CHoOs). Пізніше це представляє перше кільце, яке характеризує фенольні сполуки з двома гідроксильними групами. Шикімат проходить шість реакцій, які закінчуються першою амінокислотою: фенілаланіном. Завдяки двом ключовим ферментам, фенілаланін-аміаковій ліазі (PAL) і циннамат-4-гідроксилазі (C4H), фенілаланін послідовно утворює циннамат і п-кумарат. На цьому етапі рівень активності PAL може кількісно регулювати накопичення фенольні сполуки. Молекула р-кумарату лежить в основі похідних кумарину. Шлях синтезу молекул фенілпропаноїдів характеризується присутністю ключового ферменту під назвою 4-кумарат-КоА-лігаза (4CL), який каталізує у присутності тіолової функції коензиму А(КоА) р-кумарин кислоти в 4-кумароїл CoA(C30Ha2N-O18P, S). Ароматичне А-кільце флавоноїдів утворюється в результаті конденсації трьох молекул малоніл-КоА (-С6).

Згодом 4-кумароїл КоА утворив халкон нарингеніну, що пояснює зв’язок між ароматичним B-кільцем і 3C кільцем халкону (C6-C3-). Халкон є ключовим елементом у цій темі, оскільки він є попередником усіх флавоноїдів, заснованих на скелеті з п’ятнадцяти вуглеців, що складається з двох бензольних кілець. Після цього халкон перетворюється на нарингенін (також званий флаванон або тригідроксифлавон) під дією халконізомерази (CHI). З одного боку, флавони, такі як апігенін, акацетин, хризин або лютеолін, синтезуються з нарингеніну в присутності флавону. синтаза (FNS). З іншого боку, різні флавоноли та сполуки янтарної кислоти виробляються з нарингеніну в присутності двох ферментів; флаванон 3-діоксигеназа (F3D) і флавонолсинтаза (FS). Крім похідних флавонолу, отримують також інші сполуки, такі як кемпферол, мірицетин, кверцетин. Шляхом перенесення метильної групи від S-аденозил-L-метіоніну ізорамнетин утворюється в присутності флавон-3'-O-метилтрансферази (FMT) [47,48]. Тоді ізорамнетин є монометоксифлавоном або O-метильованим флавонолом із класу флавоноїдів. Це кверцетин (попередник), у якому гідроксильна група в положенні 3' замінена метоксигрупою. Деякі похідні ізорамнетину присутні в природі, наприклад ізорамнетин 3-O- -d-глюкопіранозид, ізорамнетин 3-O-неогесперидозид та ізорамнетин 3-O-рутинозид з Calendula officinalis L [20].

Насправді флавоноїди вважаються однією з найважливіших груп родини поліфенолів. Вони мають структуру на основі дифенілпропанового типу з двома бензольними кільцями (кільце A і B, див. рис. 2), з’єднаними ланцюгом із трьох вуглеців, який утворює замкнуте піранове кільце (кільце C). Тому їх структура називається C6-C3-C6. Позиції О-глікозилювання є С7 у флавонах, ізофлавонах, флаванонах і флавонолах, і С3 у флавонолах і антоціанідинах. Позиції С-глікозилювання є С6 і С8 у флавонах [49]. Крім того, важливість антиоксидантної ролі фенольних сполук пов'язана зі ступенем гідроксилювання молекули. Флавоноїди включають ізофлавони, флавони, флаванони та їх глікозиди та флавоноли, такі як ізорамнетин, який також називають 3'-метоксикверцетином і 3-метилкверцетином [50]. У рослинах фермент, UDP-залежна глікозилтрансфераза, відповідає за глікозидну форму ізорамнетину (ізорамнетин 3-O-глюкозид). Цей фермент використовує нуклеотидні дифосфатні цукру, як правило, уридиндифосфатні (UDP)-цукри, щоб перенести метильну групу в цикл і зв’язати глікозидну функцію з ізорамнетином [51].

2.4. Виділення та аналіз ільзорамнетину, отриманого з лікарських рослин

Розподіл ізорамнетину в лікарських рослинах дуже широкий, а методи екстракції та аналізу різноманітні. Похідні ізорамнетину є особливо затребуваними. Гідроксильна та метильна групи допомагають у їх характеристиці. Деякі методи використовуються для вилучення ізорамнетину, серед них засновані на фракціонуванні, з використанням хемометричних підходів, ферменту та надкритичної рідинної екстракції (SFE-CO2). По-перше, фракціонування можна використовувати для спрощення екстракції шляхом видалення всіх масел і ліпофільних пігментів із зразків, що містять ліпіди. Знежирений зразок також обробляють ультразвуком перед мацерацією в суміші метанолу та води. Потім хроматографію можна використовувати для аналізу фенольних сполук, особливо флавоноїдів [49]. Для цих останніх сполук використовується РХ-МС, і часто застосовують іонізацію електророзпиленням (ESI) і хімічну іонізацію при атмосферному тиску, і найкраща чутливість до флавоноїдів зазвичай досягається в режимі негативних іонів [49]. Наприклад, було оцінено фітохімію рослинних фракцій Calligonum Azel Maire, зібраних у туніській пустелі, і для ідентифікації фенольних сполук, серед яких флавони, було використано рідинну хроматографію надвисокої ефективності в поєднанні з чотириразовою часопрольотною мас-спектрометрією UHPLC-ESI-QTOF. і флаваноли, які були найпоширенішими фенольними сполуками, ідентифікованими [52]. Зокрема, за допомогою технології LC/ESI-MS/MS було підтверджено присутність ізорамнетин глюкозиду та ізорамнетин глюкозилрамнозиду як основних сполук у листі їстівного галофіту Mesembryanthemum edule [3]. За цією роботою послідували інші, які використовували LC-ESI-TOF-MS для характеристики багатьох поліфенолів; серед них флавоноїди були ідентифіковані з надземних частин фази повного цвітіння галофітів, таких як Arthrocnemum indicum [5], Tamarix gallica [16], Glaucium flavum [13] і Salsola kali [8]. Подібно до останніх робіт, LC-ESI-TOF-MS та GC-MS профілювання трави Artemisia було виконано для ідентифікації фенольних сполук, таких як флавони, флавоноли та флавоноїдні алкалоїди [7]. Інша робота була проведена на Pancratium maritimum, і аналіз за допомогою ВЕРХ-DAD-ESI/MS виявив присутність флавоноїдів, включаючи флавонол, як ізорамнетин, з їхніми пентоксидними та гексозидними кон’югатами, такими як ізорамнетин ди-гексозид [53].

Як нежирну сполуку флавоноли можна виділити гексаном. Потім можна використовувати полярний розчинник, такий як етанол. Дослідження Limoniastrum guyonianum за допомогою ВЕРХ показало наявність багатьох фенольних сполук, серед яких ізорамнетин-3-О-рутинозид [54].

На відміну від фенольних екстрактів, фенольні сполуки також містяться в оліях, таких як оливкова олія [55]. Ці сполуки мають здатність захищати олії від окислення та покращувати поживну цінність олії. Ізорамнетин, як фенольну сполуку, також було виявлено в олійному екстракті з насіння туніського чорного кмину (Nigella sativa L.), отриманому за допомогою зеленого розчинника, такого як 2-метилтетрагідрофуран (MeTHF), як альтернатива нафті чи гексану -розчинник для екстрагування збагачених нафтою фенольних сполук [10]. Наявність ізорамнетину підтверджено аналізом ВЕРХ. Аналіз із застосуванням рідинної хроматографії з детектором з діодною матрицею (LC-DAD) виявив високу кількість ізорамнетину в межах від 6,3 до 6,6 (мкг/г олії) після екстракції олії з чорного кмину MeTHF і гексаном відповідно. Крім того, за допомогою H ядерного магнітного резонансу (HNMR) і C ядерного магнітного резонансу (CNMR), деякі флавонолові глікозиди, такі як кемпферол-3-O-рутинозид (нікотифлорин) та ізорамнетин-3-O-рутинозид (нарцисизм) були охарактеризовані з надземних частин Peucedanum aucheri Boiss, зібраних у місті Маріван, провінція Курдистан, Іран [56]. Метод ЯМР виявляє властивість певних атомних ядер сполуки взаємодіяти з магнітним полем. Ця властивість, яка полягає у створенні магнітного резонансу на певній частоті, надає інформацію про структуру молекули. По-друге, математичні моделі вибираються для оцінки ефективності екстракції флавонолу, особливо для розуміння найкращого способу отримання ізорамнетин-3-О-рутинозиду [20]. Багатовимірний факторний аналіз проводили з використанням квіток календули лікарської. Проаналізовано лінійну, квадратичну, повну кубічну та спеціальну кубічну моделі. Остаточний повний куб був найбільш підходящим, дозволяючи підвищити ефективність вилучення ізорамнетин-3-О-рутинозиду на 60 відсотків. Для цього дослідження ферменти Rapides Maxi Fruit і Viscozyme використовувалися за деяких важливих факторів, що впливають на активність ферментів у надкритичних умовах CO2, таких як тиск, температура, pH, час і водний розчин етанолу. Нарешті, метод надкритичної рідинної екстракції використовувався для вилучення фенольних сполук, таких як флавоноли. Багато років тому на корі Eucalyptus globulus вперше була застосована процедура надкритичної рідинної екстракції з використанням чистого та модифікованого CO2 з водою, етилацетатом і етанолом [57]. Автори показали, що надкритичний CO2 у поєднанні з етанолом може витягувати значні кількості фенольних сполук, включаючи ізорамнетин. Кількісне визначення ВЕРХ-МС визначило деякі флавоноли, такі як ізорамнетин-гексозид (0,26 г-л екстракту) і простий ізорамнетин (14,29 мг:г екстракту). В якості співрозчинника використовували етанол. Кількісне визначення проводили за допомогою рідинної хроматографії високого тиску, оснащеної фотодіодним детектором. Ізорамнетин 3-О-глюкозил-рамнозил-рамнозид, ізорамнетин 3-О-глюкозил-рамнозил-пентоксид, ізорамнетин 3-О-глюкозил-рамнозид та ізорамнетин 3-О-глюкозил -пентоксид були найпоширенішими флавонолами, екстрагованими з надкритичних екстрактів O. ficus-indica. Як згадувалося раніше, рідинна хроматографія високого тиску або ВЕРХ є широко використовуваним методом аналізу фенольних сполук. У яблучному та грушевому соках виявлено ізорамнетин 3-O-глюкозид. Фактично, розділення флавонолових глікозидів в екстракті яблук «Brettacher» за допомогою ВЕРХ і мас-спектрометрії виявило наявність двох форм глікозидів, таких як ізорамнетин 3-O-глюкоза та ізорамнетин 3-O-галактозид [ 58].