Частина Ⅰ: Тубулярна мітохондріальна AKT1 активується під час ішемічної реперфузійної травми та відіграє вирішальну роль у схильності до хронічної хвороби нирок.
Apr 03, 2023
Анотація
Порушення функції ниркових канальців може призвести до гострого ураження нирок і трансформації в хронічне захворювання нирок. Хоча тубулярні мітохондрії пов’язані з патофізіологією ниркової недостатності, механізм неясний. Тут ми демонструємо, що ішемічно-реперфузійне пошкодження викликає гостру транслокацію та активацію мітохондріальної протеїнкінази B (також відомої як AKT1) у ниркових канальцях. Ми припустили, що мітохондріальна передача сигналів AKT1 може запобігти розвитку гострого ураження нирок і подальшого хронічного захворювання нирок. Щоб перевірити це передбачення, ми використали стратегію Cre-Lox для створення двох нових трансгенних штамів мишей, специфічних для ниркових канальців, які індукували експресію або націленого на мітохондрії домінантно-негативного AKT1, або конститутивно активного AKT1. у мітохондріально-націлених домінантних AKT1-негативних мишей інгібування мітохондріальної AKT1 погіршувало азотемію, пошкодження канальців, фіброз нирок, гломерулосклероз і негативно виживало після ішемічно-реперфузійного ушкодження. Навпаки, у конститутивно активних мишей AKT1, націлених на мітохондрії, посилена канальцева мітохондріальна сигналізація AKT1 послаблювала пошкодження нирок, захищала функцію нирок і значно покращувала виживаність після ішемічно-реперфузійного пошкодження (76,9% проти 20,8% відповідно). Коли мітохондріальний AKT1 пригнічувався, було виявлено збільшення незв’язаного мітохондріального дихання та окисного стресу в ниркових канальцях, що підтверджує роль мітохондріальної дисфункції в патофізіології ниркової недостатності. Таким чином, наше дослідження показує, що канальцевий мітохондріальний сигнальний шлях AKT1 може бути новою мішенню для розробки нових стратегій для кращої профілактики та лікування пошкодження нирок.
Заява про переклад
Гостре ураження нирок (ГНН) і наступний розвиток хронічної хвороби нирок (ХНН) є серйозними проблемами для здоров’я. Ми розробили модель трансгенної миші та визначили роль активації AKT проксимальних мітохондрій ниркових канальців при ГПН та ХХН. Цей рятівний механізм захисту нирок може бути новою мішенню для розробки нових стратегій для кращої профілактики та лікування ГПН та ХХН. Майбутні дослідження повинні підтвердити участь мітохондріального сигнального шляху AKT в пошкодженні нирок людини та вивчити лікарські мішені мітохондріального шляху AKT1.
Ключові слова
Мітохондріальний Akt1; Ішемічна відмова травма; гостре ураження нирок; Хронічна хвороба нирок;Екстракт цистанхи.
Натисніть тут, щоб отриматиЦистанхея корисна для нирок
вступ
Гостре ураження нирок (ГНН) і наступний розвиток хронічної хвороби нирок (ХНН) є серйозними проблемами для здоров’я. Наразі специфічні методи лікування цих хвороб обмежені, частково через відсутність розуміння молекулярних механізмів, що лежать в основі ураження нирок. Нирки є одним із найбільш енергоспоживаючих органів в організмі, а мітохондрії, які необхідні для сприяння активному транспорту, підтримки відповідних електрохімічних градієнтів і регуляції гомеостазу рідини, є основним джерелом виробництва клітинного АТФ шляхом окисного фосфорилювання. Порушення у виробництві АТФ і мітохондріальна дисфункція можуть призвести до збільшення виробництва активних форм кисню (АФК), що, у свою чергу, порушує функцію ниркових клітин і викликає загибель клітин. Хоча повідомлялося про пошкодження та дисфункцію мітохондрій у пацієнтів із захворюваннями нирок і на тваринних моделях гострого та хронічного ураження нирок, знання про патофізіологічну роль мітохондрій у ураженнях нирок залишаються неповними.
Покращена мітохондріальна функція може запобігти ішемічно-реперфузійному пошкодженню (IRI). Під час ішемічної фази IRI дефіцит кисню пригнічує перенесення електронів у мітохондріальному дихальному ланцюзі та зменшує виробництво АТФ. Подальший приплив іонів натрію та вихід протонів допомагає відновити нормальний рН і може сприяти виживанню клітин шляхом відновлення внутрішньоклітинного об’єму. Під час реперфузії відновлення кровотоку пов’язане зі збільшенням активних форм кисню (АФК), Ca2 плюс внутрішній потік до мітохондрій, втрата мітохондріальні трансмембранні електрохімічні градієнти та активація апоптичних шляхів Ці внутрішньоклітинні зміни можуть бути шкідливими для клітин, які вижили після початкового ішемічного пошкодження.
ГПН частіше зустрічається у госпіталізованих пацієнтів і може прискорювати появу нової ХХН, загострювати існуючу ХХН і призводити до ниркової смерті. Механізми переходу від ГПН до ХХН неясні. Останні дослідження на тваринах свідчать про те, що дисфункція ниркових канальців відіграє важливу роль у прогресуванні ГПН до ХХН, віддзеркалюючи перехід від ГПН до ХХН у людей. Розуміння сигнальних шляхів, які регулюють ураження нирок, дозволить нам визначити нові терапевтичні цілі для пом’якшення ураження нирок і запобігання прогресуванню ГПН до ХХН.
Зв’язок між цитоплазматичними сигнальними шляхами та функцією мітохондрій під час ушкодження нирок здебільшого невідомий. Функція мітохондрій тісно пов’язана з цитоплазматичним сигналом, іншими органелами та ядерними шляхами. Наша лабораторія визначила активацію та транслокацію AKT1 до мітохондрій як ключовий крок у захисті кардіоміоцитів від пошкодження IRI шляхом регулювання комплексів окисного фосфорилювання, підвищення ефективності окисного фосфорилювання та зниження ROS. Однак, чи може IRI викликати транслокацію активованого AKT1 з цитоплазми в мітохондрії в ниркових канальцях, невідомо. Якщо мітохондріальний AKT1 може бути активований у ниркових канальцях у відповідь на пошкодження нирок, було б важливо оцінити патофізіологічну роль мітохондріального AKT1 у розвитку гострого ураження нирок (ГПН) і хронічної хвороби нирок (ХНН). Тут ми використали дві моделі трансгенних мишей, специфічні для індуцибельних ниркових канальців, які модулюють передачу сигналів мітохондріальних AKT1 in vivo, і продемонстрували захисну роль активації мітохондріальних AKT1 ниркових канальців під час IRI проти AKI та подальшого розвитку ХХН.
Цистанхе добавки
Результати
Активація мітохондріального AKT1 у ниркових канальцях після IRI
Спочатку ми дослідили, чи активує IRI AKT1 у ниркових мітохондріях. З цією метою ми створили модель ниркової IRI шляхом перев’язки лівої ниркової артерії на 30 хвилин з подальшою контралатеральною нефректомією (Nx). Перев'язку лівої ниркової артерії було скасовано для завершення ішемічної фази, проведено реперфузію та ліву нирку вилучено через зазначений інтервал часу.
Кору нирок, збагачену нирковими канальцями, виділяли, а мітохондрії отримували субфракціонуванням. Після реперфузії кількість мітохондріальних pAKT1 і AKT1 була збільшена, що свідчить про транслокацію активованого AKT1 в мітохондрії (рис. 1A). Це подібно до того, що ми спостерігали в міокарді порівняно з контрольною групою з фіктивною операцією або контрольною групою нирки з резекцією, де мітохондріальний AKT1 був значно підвищений 30-60 хвилин після реперфузії (рис. 1A і B) (n= 11-15). Мітохондріальний pAKT1 також був збільшений. Ці результати свідчать про те, що IRI-індукована активація та транслокація AKT1 до ниркових мітохондрій. Фарбування iHC підтвердило фосфорилювання AKT1 у ниркових канальцях після IRI (рис. 1C). Фонове фарбування для pAKT1 було мінімальним у ниркових канальцях контрольної групи з імітаційною операцією, тоді як pAKT1 було різко підвищено в ниркових канальцях після IRI (рис. 1C і 1D). pAKT1 не було виявлено ні в одній нирковій області, за винятком канальців. щоб підтвердити субклітинну локалізацію pAKT1 в канальцях, pAKT1 фарбували в комбінації з мітохондріальними маркерами. значна спільна локалізація pAKT1 і мітохондрій спостерігалася в клітинах ниркових канальців при IRI (рис. 1E). Разом ці результати свідчать про транслокацію IRI та активацію AKT1 до мітохондрій.
Рисунок 1. Гостра транслокація, спричинена ішемією, реперфузією та активація AKT1 у ниркових мітохондріях.
Генерація трансгенних мишей з індукованою специфічною для ниркових канальців експресією домінантної негативної AKT у мітохондріях
Щоб перевірити гіпотезу про те, що активація мітохондріального AKT1 ниркових канальців під час ІРІ захищає нирки від ГПН і подальшого розвитку ХХН, ми створили модель трансгенної миші, яка дозволяє індуковану тамоксифеном (TAM) експресію тубулярно-специфічного мітохондріального націлювання домінантно-негативного AKT1. До N-кінця були додані домінантні негативні послідовності AKT1 (mdnAKT) і націлювання на мітохондрії. Умовну експресію тамоксифену трансгенів AKT1 опосередковували за допомогою pCALNL (див. Матеріали та методи). Щоб виключити змішування ефектів, пов’язаних із випадковою інтеграцією масивів трансгенів у геном, одну копію трансгену ввели шляхом гомологічної рекомбінації в ES-клітини з цільовими трансгенами в локусі Gt(ROSA) 26or на хромосомі. Двогенні миші (KMDAKT) були отримані шляхом схрещування tam-індукованих мишей mdnAKT з гемізиготними мишами KSP-CreERT2, де tam-індукована активність Cre керувалася промоторами кальмодуліну 16, специфічними для клітин ниркових канальців. ін'єкція tam індукувала активність Cre, ізолювала мітохондрії та SDS-PAGE розділяла мітохондріальні білки для імуноблоттингу. Результати показали, що TAM успішно індукував експресію мутантного AKT1. Мутантний білок не виявлявся у мишей KMDAKT, мишей KSPCreERT2 і мишей дикого типу (ін’єкція кукурудзяної олії).
Щоб перевірити експресію, специфічну для нирок, мітохондріальні білки екстрагували з різних тканин після ін’єкції TAM. his-мічений мутант AKT1 експресувався тільки в нирці. Зрізи нирок фарбували антитілами проти his-tag і мітохондріальним мітотрекером для імунофлуоресцентної візуалізації. Результати показали, що всі мутанти AKT1 були пофарбовані антитілом до His-tag і локалізовані в мітохондріях. У клубочках не виявлено мутацій AKT1. Ферментативну активність мітохондріального AKT1 аналізували за допомогою рекомбінантного GSK3, щоб підтвердити основну негативну роль у мітохондріях канальців KMDAKT, оброблених tam. Оскільки мітохондріальний AKT1 ниркових канальців активується IRI, ми порівняли ферментативну активність AKT1 у мітохондріях, виділених у мишей, які отримували tam, і мишей, які отримували кукурудзяну олію, після IRI. Результати показали, що ниркова мітохондріальна активність AKT1 була значно пригнічена у мишей KMDAKT, які отримували TAM. Таким чином, ця лінія трансгенних мишей є хорошою моделлю для вивчення ролі AKT1 у трубчастих мітохондріях.
Переваги Cistanche
Інгібування мітохондріальної АКТ ниркових канальців посилювало ІРІ in vivo
ІРІ індукували при односторонній ішемії нирок. В останній серії експериментів фосфорильований AKT1 ледве виявлявся в мітохондріях проксимальних ниркових канальців. Жодних суттєвих відмінностей у гістології нирок, азоті сечовини крові (BUN) і креатиніні сироватки крові (Cr) не спостерігалося у мишей KMDAKT, яким вводили кукурудзяну олію та там, що свідчить про те, що мітохондріальна передача сигналів AKT1 не відіграє істотної ролі в структурі та функції нирок на початковому рівні. перед індукцією ІРІ. Щоб дослідити, чи відіграє мітохондріальна AKT1 захисну роль під час IRI, односторонній IRI використовували для індукції AKI у мишей з кукурудзяним маслом або мишей TAM-KMDAKT. не було відмінностей в рівнях BUN або Cr, отриманих відразу після індукції IRI, але у мишей TAM-KMDAKT рівні BUN і Cr були значно підвищені через 45 днів. Ці результати свідчать про те, що блокована активація мітохондріальної AKT1 у ниркових канальцях під час IRI посилює пізній розвиток ниркової дисфункції. гістологічний аналіз забарвлених H&E зрізів нирок показав, що у мишей TAM-KMDAKT ураження нирок посилилося. Оцінка пошкодження ниркових канальців за Яблонським була вищою з втратою трубчастої щіткової облямівки, лізисом канальців і більшою кількістю уламків у просвіті канальців (p=0.018). Щоб виключити вплив рекомбінази TAM або Cre, ми також проаналізували мишей KSP/CreERT2, яким вводили TAM, і показники за Яблонським були подібними у мишей KMdakt і TAM-KSP/CreERT2 з кукурудзяною олією на 7-й день після IRI (рис. 3D) (p{{ 19}}.7613). Ці дані свідчать про те, що наші висновки не були збентежені впливом рекомбінази TAM або Cre. У мишей TAM-KMDAKT після IRI трихромне фарбування за Массоном показало вищу фіброзну площу (відсоток) (p<0,001), що супроводжується невпорядкованими трубчастими структурами з внутрішньопросвітними зліпками та уламками. Експресія col1a була збільшена, що відповідає трихромному фарбуванню за Массоном. Експресія tGF не була збільшена, що свідчить про те, що мітохондріальний AKT1 не регулював запальну відповідь. Після IRI експресія маркера пошкодження канальців - KIM -1 була збільшена в групі TAM-KMDAKT, підтверджуючи збільшення ураження нирок у групі TAM-KMDAKT (p=0,002).
Фарбування TUNEL використовували для оцінки апоптозу ниркових клітин. Кількість апоптичних клітин значно зросла в канальцях (p{{0}}.0054) і клубочках (p<0,001) мишей TAM-KMDAKT порівняно з контрольною групою. Припускають, що інгібування тубулярної мітохондріальної AKT1 під час ІРІ посилює загибель тубулярних клітин і пошкодження клубочків. Відповідно до цього, активація як каспази 9 (промотор), так і каспази 3 (виконавець) була значно збільшена в епітеліальних клітинах ниркових канальців TAM-KMDAKT. Для подальшого вивчення хронічних змін клубочків було проведено аналіз фарбування періодичної кислоти-Шиффа (PAS) на зрізах нирок для кількісного визначення гломерулосклерозу. Хоча різниці в гломерулосклерозі не спостерігалося через 7 днів після IRI (p=0.2634), більше гломерулосклерозу було виявлено у мишей TAM-KMDAKT через 45 днів після IRI (p<0,001). Цей висновок свідчить про те, що мітохондріальний сигнальний шлях АКТ ниркових канальців може регулювати утворення клубочкового рубця під час розвитку ХХН. Аналіз виживаності Каплана-Мейєра показав вплив інгібування тубулярної мітохондріальної АКТ на результат ІРІ. Виживаність після IRI у мишей TAM-KMDAKT була знижена порівняно з контролем (p=0.0013).
Ступінь виживання мишей TAM-KMDAKT був значно нижчим, ніж у контрольної групи, протягом 7 днів після IRI, але рівні BUN/Cr мишей TAM- і KMDAKT з кукурудзяною олією були подібними протягом цього періоду. Повідомлені зміни BUN/Cr у мишей, які отримували TAM, могли бути недооцінені через відсутність даних BUN/Cr для мертвих мишей. Крім того, вища смертність у мишей TAM-KMDAKT може бути спричинена дисфункцією дистальних органів (легені, серце, мозок), а не просто змінами BUN/Cr.
Роль тубулярного мітохондріального AKT1 також оцінювали у самок мишей KMDAKT. BUN/Cr сироватки крові та гістологія нирок були відносно вищими у самок мишей TAM-KMDAKT через 45 днів після IRI. Значного статевого ефекту не спостерігалося.
Трав'яна цистанхея
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Yang JY, Deng W, Chen Y та ін. Порушення транслокації та активації мітохондріального Akt1 пом'якшує активність комплексу V мітохондріального окисного фосфорилювання в діабетичному міокарді. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167-175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A та ін. Специфічні швидкості метаболізму основних органів і тканин у дорослому віці: оцінка за допомогою механічної моделі витрат енергії в стані спокою. Am J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Роль гамма-коактиватора 1альфа рецептора, активованого проліфератором пероксисом (PGC-1alpha) при захворюваннях нирок. Семін Нефрол. 2018;38(2):121–6.
4. Портілла Д., Дай Г., МакКлюр Т. та ін. Зміни PPARalpha та його коактиватора PGC-1 при гострій нирковій недостатності, спричиненій цисплатином. Kidney Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Форбс Дж.М. Мітохондрії - гравці влади у функції нирок? Тенденції Endocrinol Metab. 2016; 27 (7): 441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y та ін. Покращення мітохондріальної біоенергетики в умовах ішемії підвищує толерантність нирки до теплової ішемії. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308(1):F11–F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M та ін. Клітинна біологія ішемічного/реперфузійного пошкодження. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229-317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Молекулярні шляхи захисту печінки від ішемії/реперфузійного пошкодження: оновлення 2015 року. Clin Sci (Лондон). 2015;129(4):345–62.
9. Див. EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Довгостроковий ризик несприятливих наслідків після гострого ураження нирок: систематичний огляд і мета-аналіз когортних досліджень із використанням консенсусних визначень впливу. Kidney Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y та ін. Захист мітохондрій після гострої ішемії запобігає тривалій регуляції IL-1бета та IL-18 і припиняє ХХН. J Am Soc Nephrol. 2017; 28 (5): 1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH та ін. PGC1alpha керує біосинтезом NAD, пов’язуючи окислювальний метаболізм із захистом нирок. природа 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Green DR. Мітохондрії та клітинна сигналізація. J Cell Sci. 2012; 125 (Pt 4): 807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y та ін. Протеїнкіназа B (PKB/AKT1) утворювала сигнальні комплекси з мітохондріальними білками та запобігала дисфункції гліколітичної енергії в культивованих кардіоміоцитах під час ішемічно-реперфузійного пошкодження. Ендокринологія. 2014; 155 (5): 1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y та ін. Ефективна активація генів у клітинах ссавців за допомогою рекомбінантного аденовірусу, що експресує сайт-специфічну рекомбіназу Cre. Nucleic Acids Res. 1995; 23 (19): 3816–21.
15. Мацуда Т., Чепко К.Л. Контрольована експресія трансгенів, введених шляхом електропорації in vivo. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Лі С. А., Козі М., Буш Е. Л. та ін. Дисфункція віддалених органів при гострому ураженні нирок: огляд. Am J Kidney Dis. 2018;72(6):846–856.
Хьюго Й. Х. Лін1,2,3,4, Смачний Чен1, Ю-Хань Чен1, Альберт П. Та1,2, Сяо-Чен Лі1,5, Грант Р. МакГрегор6, Носратола Д. Вазірі1,2, Пінг Х. Ван1,2,7
1. Центр діабету Каліфорнійського університету в Ірвайні та Департамент медицини Каліфорнійського університету, Ірвайн, Каліфорнія
2. Кафедра фізіології та біофізики Каліфорнійського університету, Ірвайн, Каліфорнія
3. Кафедра медицини Гаосюнського медичного університету, Гаосюн, Тайвань
4. Відділення внутрішньої медицини, Гаосюнська муніципальна лікарня Та-Тунг, Тайвань
5. Кафедра пластичної хірургії Гаосюнського медичного університету, Гаосюн, Тайвань
6. Департамент розвитку та клітинної біології Каліфорнійського університету, Ірвайн, Каліфорнія
7. Відділення діабету, ендокринології та обміну речовин, Національний медичний центр City of Hope, Дуарте, Каліфорнія
