ЧАСТИНА Ⅰ: Запальний процес змінює експресію та локалізацію WT1 у подоцитах, що призводить до пошкодження нирок
Mar 23, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
МАРІЕЛА АРЕЛЛАНО-РОДРІГЕС, ПАБЛО САПАТА-БЕНАВІДЕС ТА ІН.
вступ
Ген пухлини Вільма-1(WTI) є одним з основних генів, які беруть участь у виживанні подоцитів і неефективній нирковій фільтрації. Запальні процеси призводять донирканевдачаі це може статися через модуляцію WT1(Ген пухлини Вільма-1). WT1(Ген пухлини Вільма-1) кодує фактор транскрипції, білок цинкового пальця, який має чотири основні ізоформи шляхом альтернативного сплайсингу в екзоні 5 (17AA±) та екзоні 9 (KTS±) (1). KTS-ізоформа має вищу спорідненість з ДНК, KTS плюс локалізується спільно з білками сплайсосоми в цитоплазмі (2, 3).WT1(Ген пухлини Вільма-1) відіграє вирішальну роль в ембріогенезі, насамперед у статевих залозахниркарозвиток; у дорослих його експресія обмежена спеціалізованими вісцеральними клітинами внирка(подоцити) і необхідний для підтримки та модуляції кількох генів, таких як подокаліксин, нефрин (NPHS1) і парний транскрипційний фактор (4-6). Мутації або зниження експресії WTl можуть призвести до зниження експресії нефрину та подокаліксину та пов’язані з такими нефропатіями, як гломерулосклероз (5, 7-10).
Нефротичний синдром є найчастішим нирковим синдромом у дитячому віці, його гістологічна класифікація: мінімальні нефротичні зміни, фокальний сегментарний гломерулосклероз і дифузний мезангіальний склероз, і відповідно до ступеня відповіді на стероїди класифікується як чутливий і резистентний нефротичний синдром (11). .
ефекти цистанхи: протизапальні
Мутація WT1(Ген пухлини Вільма-1) зазвичай повідомляється у дітей із стероїдно-резистентним нефротичним синдромом, рідкісним захворюванням, яке вражає 10-15 відсотків пацієнтів із нефротичним синдромом (12,13). Близько 80 відсотків усіх дітей із спорадичним нефротичним синдромом реагують на лікування стероїдами, однак жодних мутацій у WT1 не виявлено (Ген пухлини Вільма-1) у великому когортному дослідженні (14). Зменшення експресії стероїд-резистентного нефротичного синдрому та меншою мірою у пацієнтів із стероїдно-чутливим нефротичним синдромом (15). У мишачій моделі системного запалення, індукованого ліпополісахаридом (LPS), 24 години після введення ЛПС, WT1(Ген пухлини Вільма-1) був переміщений до цитоплазми та був пов’язаний зі зниженням експресії нефрину, ключового компонента для підтримки щілинної діафрагми в подоцитах і необхідного для правильної клубочкової фільтрації, таким чином демонструючи WT1(Ген пухлини Вільма-1) діє як фактор транскрипції для посилення регуляції гена нефрину (16).
У клітинах раку легенів A459, оброблених фактором некрозу пухлини-альфа (TNFa), транслокація WT1(Ген пухлини Вільма-1) білка до цитоплазми спостерігалося, що свідчить про те, що запальний стимул може змінити його внутрішньоклітинну локалізацію та транскрипційну функцію (17). Фосфорилювання може відігравати певну роль у модулюванні транскрипційної регуляторної активності WT1(Ген пухлини Вільма-1) через втручання в ядерну транслокацію, а також через інгібування WT1(Ген пухлини Вільма-1) Зв’язування ДНК (18) шляхом опосередкованого цАМФ-залежним протеїнкіназою фосфорилювання Ser-365 і Ser-393 у домені «цинкового пальця» (19).
Сепсис є результатом системної запальної відповіді та характеризується вивільненням про- та протизапальних цитокінів, індукованим інфекцією. Гостре ураження нирок часто зустрічається у важкохворих пацієнтів за наявності гострого запалення та має сильний зв’язок із прогресуванням хронічного ураження нирок (20, 21). Є дані, що запалення відіграє важливу роль в пошкодженні різних органів, в т.чнирки(22). У цій роботі ми оцінили вплив прозапальних цитокінів на модуляцію WT1(Ген пухлини Вільма-1) експресія та її транслокація в цитоплазму.
Переваги cistanche tubulosa: проти раку та проти ракупухлина
Матеріали та методи
Модель тварин. Самки мишей BALB/c (віком 8-10 тижнів) були отримані з Harland Mexico (Мехіко, Мексика). Мишей тримали в клітці при контрольованій кімнатній температурі, вологості та освітленні (12/12 годинний цикл світло-темрява) з водою та їжею ad libitum. LPS Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mexico City, Mexico) та один ін'єкцію ЛПС вводили в дозі 8 мг/кг внутрішньоочеревинно (16); фізіологічний розчин використовували для контрольних необроблених мишей. Мишей умертвляли за допомогою внутрішньочеревної ін’єкції 200 мг/кг розчину пентобарбіталу натрію через 12, 24, 36, 48 та 72 години, з n=5 у кожну точку часу, а потімниркабули зібрані тканини та кров. Сечу збирали перед умертвінням тварин.
Дві мишки дляниркаексплантатам вводили 1 мг/кг ЛПС кожні 2 дні, щоб індукувати хронічнийнирка травмаяк позитивний контроль (21). Усі експерименти проводилися відповідно до попереднього схвалення від Інституційного комітету з догляду та використання тварин Факультету біологічних наук (CEIBA-2016-034).
ниркаекспланти. Відниркамишей BALB/c, скибочки тканини товщиною 250-300 мкм були підготовлені за допомогою пристрою для нарізання тканини Krumdieck (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) при 4 градусах з постійним потоком буфера бікарбонату Krebs Henseleit (KB) який був аерований 5 відсотками CO2. Зрізи збирали в буфері KB при 4 градусах.ниркаекспланти поміщали в 12-лункові планшети з модифікованим Дульбекко середовищем Ігла/середовищем F12, доповненим 10 відсотками фетальної сироватки великої рогатої худоби та 5 відсотками антибіотика та протигрибкового агента, і інкубували при 37 градусах C, 5 відсотках CO та перемішуванні при 25 об/хв. Експланти обробляли 10 нг/мл TNFa (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США), 20 нг/мл інтерлейкіну 1 (IL1; R&D Systems) і 100 нг/мл LPS і аналізували на 6, 12 і через 24 год.
Білок сечі. Зразки сечі збирали в кожну вищезазначену часову точку. Концентрацію білка вимірювали за допомогою набору DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, США), а альбумінурію оцінювали за допомогою електрофорезу в додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі та на основі розміру смуги бичачого сироваткового альбуміну (16).
Прозапальні цитокіни. Рівні IL6, IL1 та TNFa вимірювали за допомогою сендвіч-наборів для імуноферментного аналізу (PeproTech, Мехіко, Мексика).
Кількісна полімеразна ланцюгова реакція (КПЦР). Тотальну РНК виділяли з ниркової тканини за допомогою реагенту Trizolw (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) відповідно до інструкцій виробника. Одноланцюгову кДНК синтезували шляхом зворотної транскрипції з використанням набору для зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Applied Biosystems, Фостер Сіті, Каліфорнія, США) відповідно до інструкцій виробника. ПЛР у реальному часі проводили за допомогою системи 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) з аналізами експресії генів TaqMan. Порівняльні аналізи ПЛР у реальному часі проводили для кожного зразка в трьох примірниках. Праймери для WT1(Ген пухлини Вільма-1) були передані:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; реверс:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';та датчик FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;протокол було виконано для 95 градусів протягом 10 хвилин і 40 циклів при 94 градусах протягом 30 с і 64 градуси С протягом 30 с. Відносний вираз WT1(Ген пухлини Вільма-1) було розраховано за рівнянням 2-AACT(23) із використанням для нормалізації гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) (Applied Biosystems).
лікують захворювання нирок екстрактом цистанки
Експресію мРНК нефрину визначали за допомогою 3 мкг кДНК і наступних праймерів: прямого: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'і зворотного: 5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'при 94 градусах протягом 30 с, 60 градус протягом 30 с і 72 градуси протягом 30 с протягом 30 циклів (372 bp) (16). Для експресії GAPDH використовували такі праймери: вперед: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', зворотний: 5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', з такими умовами реакції: 94 градуси протягом 40 с, 60 градуси протягом 30 с і 72 градуси протягом 40 с протягом 35 циклів (452 bp). Експресія WT1(Ген пухлини Вільма-1):Вперед 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', у зворотному напрямку 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3'на 94 градуси протягом 40 с, 64 градуси на 30 с і 72 градуси на 30 с протягом 35 циклів (160 bp). Вираз WT1(Ген пухлини Вільма-1) ізоформ KTS±і 17 AA±(F2-R2 праймери для виявлення 17 AA плюс /- і F3-R3 для виявлення KTS плюс /-сплайсингових ізоформ) проводили за допомогою звичайної ПЛР згідно з Oji et. .al.(24). Визначення експресії -актину проводили згідно з Lauxet al. (25). Продукти спостерігали за допомогою електрофорезу в 10% поліакриламідному гелі для KTS±ізоформи та 2% агарозного гелю для 17AA±ізоформи.
Імунофлюоресценція. Theниркивід мишей, які отримували LPS, і контрольних мишей фіксували в 10% формаліні та обробляли для фарбування гематоксиліном і еозином, імуногістохімії та імунофлуоресценції.
Щоб визначити розташування WT1(Ген пухлини Вільма-1) у мишей, які отримували ЛПС, використовували{{0}}зрізи ниркової тканини товщиною в мкм, закріплені на предметних стеклах мікроскопа. Зразки депарафінізували, пермеабілізували Triton X-100 [0,1 відсотка тритону з 1 відсотком цитрату натрію у фосфатно-сольовому буфері (PBS)] і тричі промивали PBS. Тканини блокували 20% фетальної бичачої сироватки в PBS протягом 30 хвилин та інкубували при 4 градусах протягом ночі з моноклональним антитілом до WT1 (Ген пухлини Вільма-1) sc{{0}}(F-6) (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Каліфорнія, США), розведений 1:100 у 10% фетальної бичачої сироватки в PBS. Після промивання PBS наявність зв’язаних антитіл ідентифікували шляхом фарбування козячим антимишачим IgG Texas Red sc-2979(Santa Cruz Biotechnology). Предметні скла контрастно пофарбували 4',6-діамідіно-2-феніліндолом. Нарешті, слайди були встановлені та якісно досліджені за допомогою конфокального мікроскопа Olympus BX61W1 з об’єктивом занурення у воду 40 × і програмного забезпечення Fluoview 4.0a (Olympus, Токіо, Японія).
Імуногістохімія. Для визначення фосфорильованого (p)-WT1(Ген пухлини Вільма-1) у подоцитах мишей, які отримували LPS, поліклональні антитіла до p-WT1(Ген пухлини Вільма-1) використовували серин 393,sc-12933 і 363,sc-12934-R (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, штат Техас, США). Предметні скла, що містять 4-мкм зрізи ниркової тканини, депарафінізували та пермеабілізували Імуногістохімію проводили за допомогою універсального швидкого набору (Vector Laboratories, Берлінгейм, Каліфорнія, США) відповідно до протоколу виробника.Скела досліджували за допомогою світлового мікроскопа з масляним імерсійним об’єктивом 100× (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Німеччина) .
Вестерн-блот. Загальний білок виділяли за допомогою 200 мкл буфера для лізису (1 відсоток тритону, 150 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, рН 7,6), і концентрацію вимірювали за допомогою набору для аналізу білка DC (Bio-Rad). Білок (50 мкг) відокремлювали за допомогою електрофорезу в 12-відсотковому додецилсульфаті натрію-поліакриламідному гелі та аналізували Вестерн-блоттингом з WT1(Ген пухлини Вільма-1) [F6] антитіло sc-7585(Santa Cruz Biotechnology). Зразки нормалізували за допомогою анти-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA). Білки візуалізували за допомогою системи Lumi-Light Western Blotting sc-2048(Santa Cruz Biotechnology).
користь цистанхи: захист нирок
Результати
Індукціяниркапошкодженняу мишей BALB/c за допомогою LPS. Добре встановлено, що пошкодження подоцитів пов’язане зі збільшенням протеїнурії. Альбумін і загальний білок у сечі визначали за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі додецилсульфату натрію та набору DC Protein Assay (Bio-Rad). Значне підвищення (p=0.001) альбуміну в сечі спостерігалося через 12 годин після лікування ЛПС, з максимальним збільшенням через 24 години (215,87±1,41 мкг/мл) порівняно з контролем (15,53). ±5,0 мкг/мл） (Малюнок 1A). Концентрація загального білка в сечі досягла піку через 36 годин (26,02±2,43 мг/мл) і була значно вищою порівняно з контролем (p=0.01) як показано на малюнку 1. Пошкодження нирок, спричинене LPS, аналізували за допомогою гістології. Через 24 години після лікування спостерігався вогнищевий гломерулонефрит у нирковій тканині, причому найбільше пошкодження було виявлено через 36 годин, збільшення розміру клубочка з мезангіальним Через 48 годин спостерігалося поступове відновлення клубочка до 72 годин, як показано на малюнку 1C.
Рисунок 1. Вплив системного запалення на нирки.Концентрації альбуміну (А) і білка в сечі (В) як маркери пошкодження нирок у мишей, які отримували ліпополісахарид. C: Репрезентативне зображення гістології нирок миші (фарбування гематоксиліном і еозином) у різний час (12, 24, 36, 48 і 72 години) після ін’єкції ліпополісахариду, з порівнянням моделі хронічного запалення, збільшення 100×. Істотно відрізняється при: *n<><0,0]><0.00>
Виробництво прозапальних цитокінів TNFa та IL1 у сироватці мишей, які отримували LPS. Щоб підтвердити, що пошкодження нирок було викликано LPS, рівні прозапальних цитокінів вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу. Збільшення TNFa та I1 спостерігалося через 12 годин (3,6±0,9 нг/мл, 11,9±5 нг/мл) і до 36 годин (4,44±0,1 нг/мл,18 ±0.9 нг/мл відповідно) лікування LPS, починаючи згодом знижуватися (Мал. 2A і B). Експресія IL6 була підвищена через 12 год (49,5 нг/мл) і 36 год (23,5 нг/мл) після лікування, що було значно вище, ніж у контролі (рис. 2C).
Рисунок 2. Хід зміни рівнів прозапальних цитокінів фактора некрозу пухлини-альфа (TNFa).(A), інтерлейкін 1 (LL1) (B) і IL6 (C) у сироватці мишей після внутрішньочеревного введення ліпополісахариду. Значно відрізняється при: *p Менше або дорівнює 0.05,**p Менше або дорівнює 0.01 і ***p Менше або дорівнює 0,001 .
Експресія гена WTI в тканині нирок мишей, які отримували LPS. Щоб відповісти на наше головне питання про те, чи WT1(Ген пухлини Вільма-1) модулювався запальним процесом, і це мало вплив на нирки, загальна експресія WT1(Ген пухлини Вільма-1) ген визначали в ниркових зразках мишей із системним запаленням у різний час протягом запалення. WT1(Ген пухлини Вільма-1) мРНК була нижчою за весь час аналізу порівняно з контролем, з найнижчою відносною експресією через 36 годин і найвищою через 12 годин після індукції системного запалення, як показано на малюнку 3A. Крім того, було визначено, чи лікування ЛП індукована модифікація експресії екзону 5 (17 AA±) ізоформи та KTS± WTI за допомогою ПЛР. Дані показали, що не було дерегуляції експресії цих ізоформ, оскільки спостерігалася така ж поведінка, як і в контрольній групі без лікування протягом системного запального процесу, індукованого LPS (рис. 3B). Вестерн-блоттинг показав, що білок WT1 зменшувався протягом запального процесу з невеликим відновленням через 36 годин після лікування, однак кількість WT1 була меншою, ніж у необробленому контролі (рис. 3C і D).
Рисунок 3. Вплив ліпополісахариду (ЛПС) на експресію гена пухлини Вільмса I (WT1) у тканині нирок мишей із системним запаленням.A: Відносна експресія мРНК WTI. B: Відносна експресія ізоформ KTS± і 17IAA± WT1. C: Рівні білка WTI за імуноблоттингом після лікування LPS і D: Щільність імуноблоттингу для WT1. Значно відрізняється при:**p Менше ніж або дорівнює 0.01 і ***p менше або дорівнює 0,001,
Фосфорилювання та локалізація WTI в біоптатах нирок мишей, які отримували LPS. Важливою подією в посттрансляційній модуляції білка WTI є фосфорилювання амінокислоти 393, яке індукує витіснення білка в цитоплазму. Було визначено фосфорилювання та локалізацію WT1 у зразках нирок мишей, які отримували LPS. Фосфорилювання WT1 аналізували за допомогою гістохімії, що вказує на присутність фосфорильованого WT1 у цитоплазмі клітин у зрізах ниркової тканини, починаючи з 12 годин після індукції системного запалення та зберігаючи до 72 годин. WT1 фосфорилювали за амінокислотами 393 і 363 як показано на малюнку 4A. Розташування білка WT1 аналізували за допомогою імунофлуоресценції. Розташування WT1 у подоцитах у зразках нирок мишей, які отримували LPS, було переважно цитоплазматичним, тоді як у подоцитах з контрольних зразків розташування було неясним (рис. 4B).
Рисунок 4. Фосфорилювання та локалізація пухлини Вільмса I (WTI) у зразках нирок мишей, які отримували ліпополісахариди.A: Імуногістохімічне фарбування для фосфорильованого (p)-WTI показує збільшення фосфорильованого за серином 393 і 363, починаючи з 12 годин після введення LPS (збільшення 100× на світловому мікроскопі). B: Локалізація WTI методом імунофлюоресценції в нирці; приклади, що демонструють незначну ядерну локалізацію WT1 (квадрати) через 36 годин після введення ліпополісахариду (збільшення 40× на конфокальному мікроскопі). DAP1:4, 6-Діамідіно-2-феніліндол.
Модуляція експресії WTI і нефрину в нирках мишей, які отримували LPS. Розташування WT1 у клітині впливає на її біологічну активність. Повідомлялося, що цитоплазматичний WT1 не виявляє транскрипційної активності; з цієї причини експресія WT1 і мРНК нефрину була проаналізована за допомогою ПЛР у зразках нирок мишей, які отримували ЛПС (рис. 5A). ПЛР вказала на зниження мРНК нефрину від 24 до 48 годин зі збільшенням через 72 години (рис. 5B). ), в той час як експресія мРНК WTI зросла через 12 годин, а потім знизилася протягом критичних годин запалення та пошкодження нирок (24 і 36 годин) і (Рис. 5B).
Рисунок 5. Аналіз експресії мРНК нефрину (NPHS1) і пухлини Вільмса 1(WT1).A: При аналізі експресії мРНК NPHSI і WTI знизилися через 24, 36 і 48 годин після індукції системного запалення за допомогою ліпополісахариду. B: Кількісна оцінка смуг, показаних на A, за допомогою денситометрії та нормалізована за експресією до гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогенази.
Експлантати нирок, оброблені TNFa та IL1, модулюють експресію WTI та нефрину. Щоб визначити, чи модулюють цитокіни експресію WT1, ниркові експланти культивували та обробляли цитокінами TNFa та IL1 протягом 6, 12 та 24 годин для аналізу експресії WT1 та нефрину за допомогою ПЛР. Експресія мРНК нефрину зменшилася, а експресія мРНК WTI зросла через 24 години в ниркових експлантатах, оброблених TNFa та ILlb (рис. 6).
Рисунок 6. Аналіз експресії мРНК нефрину (NPHS1) і пухлини Вільмса 1 (WT1) в ниркових експлантатах.A: Рівні експресії мРНК NPHSi та WTI у різний час у ниркових експлантатах, які зазнали впливу 10 нг/мл фактора некрозу пухлини-альфа (TNF) та 20 нг/мл інтерлейкіну 16 (IL16) B: Відносна експресія, отримана за допомогою денситометричного аналізу сигнальний продукт. Смуги кількісно визначали нормалізацією до гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогенази.
Локалізація WTI в ниркових експлантатах за допомогою імунофлюоресценції. Щоб визначити, чи були TNFa та IL відповідальні за зміну локалізації білка WT1, експлантати нирки миші обробляли TNFa та L1 та LPS протягом 24 годин. В експлантатах, оброблених ILlb і LPS, була очевидна ядро/цитоплазматична локалізація білка WT1, а в експлантатах, оброблених TNFa, спостерігалася цитоплазматична локалізація білка WT1; тим часом у необроблених контрольних групах спостерігалася головним чином ядерна локалізація WT1 (рис. 7).
Малюнок 7. Локалізація білка Wilms'tumor 1 (WTI) за допомогою імунофлюоресценції з використанням Red TX (WT1) і 4',6-діамідіно-2-феніліндолу (DAPI)(ядро) у подоцитах з експлантатів нирок, оброблених з l0 нг/мл фактора некрозу пухлини-альфа (TNFa), 20 нг/мл інтерлейкіну 16 (L1B) і ліпополісахариду (LPS).Знижена ядерна локалізація WTas, показана в експлантатах, оброблених TNFa, порівняно з ядерною/цитоплазматичною локалізацією WTI під час лікування IL1 та LPS. Збільшення, 40×.
