ЧАСТИНА Ⅰ: Роль SIK1 у переході гострого ураження нирок у хронічну хворобу нирок
Mar 25, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 та ін.
Фон
Гостре ураження нирок(ГПН), поширене захворювання, що характеризується зниженням швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ) і підвищенням рівня креатиніну сироватки [1], розглядається як фактор ризику розвитку та прогресування ХХН [2,3]. Нещодавно AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок) перехід став однією з гарячих точок у вивченні захворювань нирок. Хоча повідомляється, що запалення, ЕМТ і фіброз відіграють життєво важливу роль у прогресуванні ГПН-ХНН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід [4,5], точний молекулярний механізм AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід досі незрозумілий.
цистанхе лікує захворювання нирок і запобігає нирковій недостатності
Кіназа, індукована сіллю 1(SIK1) є членом сімейства AMP-активованих протеїнкіназ (AMPK), які відіграють ключову роль у регулюванні метаболізму, виживання клітин і росту [6, 7]. Дослідження показали, що інгібування SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)сприяє ЕМТ, що призводить до міграції та метастазування пухлин [8-10]. Крім того, повідомлялося, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)негативно регулює TLR{0}}індуковану активацію NF-kB і послаблює експресію прозапальних цитокінів [11]. Крім того, нові докази показали зв'язок між SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)та захворювання нирок [6,12]. Наприклад, посилення SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)скасував індуковану глюкозою проліферацію мезангіальних клітин і накопичення позаклітинного матриксу (ECM), пригнічуючи експресію FN і PAI-1, обидва з яких беруть участь у фіброзних захворюваннях, таких як гломерулосклероз [6,13]. Таким чином, ми припускаємо, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)може брати участь у прогресуванні ГПН-ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід, який характеризується ЕМТ, запаленням і фіброзом нирок.
Шлях WNT/-catenin є складним, висококонсервативним сигнальним шляхом, який регулює різні біологічні процеси, такі як розвиток органів, гомеостаз тканин і канцерогенез [14, 15]. Незважаючи на те, що в нормальній дорослій нирці він не протікає, він реактивується при різних захворюваннях нирок, включаючи гостре ураження нирок, діабетичну нефропатію, інтерстиціальний фіброз і кістозні захворювання нирок [16]. Крім того, повідомляється, що придушення шляху WNT/-катеніну полегшує нирковий фіброз, затримуючи прогресування AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)при I/R-індукованій травмі [17]. Але чи SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)міг брати участь в AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід шляхом модуляції шляху WNT/-катеніну ще потребує подальшого уточнення.
Нові дані показали, що Snail і Twistl, фактори транскрипції EMT, відіграють важливу роль у патогенезі фіброзу нирок[18-20]. Повідомлялося, що умовна делеція Twistl або Snail в епітеліальних клітинах проксимальних канальців інгібувала ЕМТ, послаблюючи інтерстиціальний фіброз при експериментально індукованому фіброзі нирок у мишей [21]. Враховуючи, що Snail і Twist1 є важливими молекулами, розташованими нижче за течією шляху WNT/-catenin, ми припустили, що вони також можуть відігравати важливу роль у SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)опосередкована ГПН-ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід.
Таким чином, у цьому дослідженні ми мали на меті з’ясувати роль і механізм SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1) при AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехідний період, який забезпечить нову терапевтичну ціль для клінічної профілактики та лікування фіброзу нирок і забезпечить новий спосіб затримки прогресування AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід.
цистанхе лікування захворювань нирок
Матеріали та методи
Пацієнти та зразки тканин
Дослідження було схвалено Комітетом з етики клінічних досліджень провінційної лікарні Шаньдун, афілійованої при Шаньдунському університеті. Зразки людських нирок були зібрані у пацієнтів з ГПН (Гостре ураження нирок) діагностували на підставі біопсії нирки, а зразки нирок у контрольних групах отримували з параканцерогенної тканини пацієнтів з пухлинами нирки, які перенесли хірургічну резекцію. Зразки тканин зберігалися в рідкому азоті, і всі пацієнти підписували інформовану згоду відповідно до Гельсінської декларації.
Конструкція AAV9-Sik1(Кіназа, індукована сіллю 1)
Рекомбінантний аденоасоційований вірус (AAV9-Sik1) і аденоасоційований вірус-негативний контроль (AAV9-NC) були сконструйовані GENECHEM (Шанхай, Китай). Рекомбінантний AAV9-Sik1 аденоасоційований вірусний вектор GV467 включає промотор, область кодування антитіла, область кодування зеленого флуоресцентного білка EGFP і область кодування білка 3FLAG. Перевірено здатність вектора AAV9 трансдукувати нирки (додатковий файл 1).
Тварини та методи моделювання
Моделювання та подальші експериментальні програми були схвалені Комітетом з догляду та використання тварин Шаньдунського університету. Миші C57BL/6 віком 4-6 тижнів і вагою 15-20 г були надані Центром експериментальних тварин Шаньдунського університету та були випадковим чином розподілені на 4 групи: контрольна група (контроль), нормальні миші, які отримували групу AA ( AA), миші AA, які отримували групу AAV9-Sik1 (AAV9-Sik1 плюс AA), миші AA, які отримували групу AAV9-NC (AAV9-NC плюс AA) . Мишам у групі AA внутрішньоочеревинно вводили AA (10 мг/кг), тоді як мишам у контрольній групі вводили PBS. 3-го, 7-го, 14-го та 28-го числа після ін’єкції AA 24-годинну сечу мишей збирали в метаболічну клітку, а супернатант зберігали при -20° C після центрифугування. Кров центрифугували при 3000 об.р. протягом 10 хв, а супернатант зберігали при -20 градусі. Автоматичним біохімічним аналізатором вимірювали білок сечі, креатинін сироватки (Scr) і азот сечовини крові (BUN) за 24 години. IL-1 і TNF- в сироватці були виявлені методом ELSA. Потім мишей умертвляли і зважували. Після цього нирки вирізали і зважували. Усі зразки нирок розділили на дві частини, одну з яких фіксували в 4-відсотковому параформальдегіді для гістологічного фарбування, а іншу зберігали при -80 градусах для ПЛР у реальному часі та вестерн-блоттингу.
Гістологія та імуногістохімія
Після фіксації в 4% параформальдегіді зразки нирок були зневоднені, прозорі, залиті в парафін і розділені на шматочки товщиною 4 мкм. Згодом предметні скла депарафінували, зволожили та пофарбували. Для гістологічного аналізу нирок використовували фарбування HE, фарбування PAS та трихромне фарбування за Массоном відповідно до інструкцій виробника. Для імуногістохімічного аналізу зрізи інкубували з первинним антитілом проти SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)(51045-1-AP, Proteintech, США), E-кадгерин (20874-1-AP, Proteintech, США), -SMA (ab32575, Abcam, США), COL1(bs-10423R, Bioss , Пекін, Китай) при 4 градусах вночі. Після інкубації з вторинним антитілом додавали DAB з наступним ядерним контрастним фарбуванням гематоксиліном. Нарешті зображення спостерігали під мікроскопом (Leica, Німеччина). Відсоток позитивного фарбування для SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1), E-cadherin, -SMA та COLl вимірювали за допомогою кількісного програмного забезпечення Image-Pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].
Культивування клітин і лікування
Клітини проксимального тубулярного епітелію людини (HK2) культивували в середовищі DMEM (Gibco, США), доповненому 10 відсотками фетальної бичачої сироватки (FBS) (Gibco, США) і 1 відсотком пеніциліну-стрептоміцину (Sigma, США) при 37 °C у зволожена атмосфера, що містить 5 відсотків CO,. Аристолохієву кислоту (AA) (Sigma, США) розчиняли в ДМСО до 1 мг/мл і клітини обробляли кінцевою концентрацією 10 мкмоль/л, 20 мкмоль/л, 40 мкмоль/л і 60 мкмоль/л, і контрольну групу вводили такою ж кількістю ДМСО.
Трансдукція лентивірусного вектора та трансфекція siRNA Лентивірусна shRNA конструює мішень SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1), -катенін і зашифрована shRNA, а також лентивірусний вектор гіперекспресії для SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)і порожній контрольний вектор були створені Cyagen (Гуанчжоу, Китай). Цільові послідовності перераховані таким чином: SIKI shRNA:5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC-3';
Переваги пустелі: лікування хронічних захворювань нирок
Результати
SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)був знижений в AKI(Гостре ураження нирок)
Враховуючи, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)відіграє значну роль у пошкодженні нирок, ми вперше виявили експресію SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)в тканинах нирок ГПН(Гостре ураження нирок)пацієнтів та ГПН(Гостре ураження нирок)миші. Імуногістохімічне фарбування виявило, що не тільки у пацієнтів, але й у мишей SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)експресія ниркових канальців у контролі вища, ніж при ГПН(Гостре ураження нирок)групи, яка вказувала на те, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)була знижена під час ГПН(Гостре ураження нирок)(Рис. la, b). Крім того, ми провели НЕ та трихромне фарбування за Массоном для аналізу гістопатологічних змін у зразках нирок ГПН.(Гостре ураження нирок)пацієнтів (рис. 1в). Порівняно з контролем, при фарбуванні HE спостерігали набряк епітеліальних клітин ниркових канальців, вакуолярну дегенерацію та інтерстиціальний набряк у групі AKI. Більше того, порівняно з контролем, за допомогою трихромного фарбування за Массоном у групі AKI спостерігалися помітні сплощені трубчасті клітини, відокремлена щіточна облямівка та збільшені трубчасті полотна. Взяті разом, усі ці висновки показали, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)може відігравати роль у пошкодженні канальців.
Рис. 1 SIK1 знижувався при ГПН(Гостре ураження нирок).a Репрезентативні зображення імуногістохімічного фарбування SIK1 у контролі та AKI(Гостре ураження нирок)пацієнтів. Масштаб =50 мкм. На графіку показано кількісний аналіз SIK1 у імуногістохімічно пофарбованих зрізах.b Репрезентативні зображення імуногістохімічного фарбування SIK1 у контролі та ГПН(Гостре ураження нирок)миші. Масштаб =50 мкм. На графіку показано кількісний аналіз SIK1 у імуногістохімічно пофарбованих зрізах. c Репрезентативні зображення HE та трихромного фарбування за Массоном у тканинах нирок ГПН(Гостре ураження нирок)пацієнтів. Масштаб =10 мкм. Дані показані як середнє ± sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)сповільнюється при АКІ-індукованій ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехідні миші
Для отримання моделі мишей AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід, ми вводили AA внутрішньочеревно мишам. Порівняно з контролем, миші, які отримували AA, продемонстрували підвищену продукцію факторів запалення, EMT та фіброз нирок (рис. 2a-d). Крім того, нирковий індекс, сироватковий Scr, BUN і 24-годинний білок у сечі підвищувалися після лікування АА (рис. 2e). Крім того, АА порушує структуру нирок, що призводить до атрофії епітеліальних клітин ниркових канальців, збільшення вапна та різного ступеня відкладення колагенових волокон у тубулоінтерстиції (рис. 2f). Все вище вказувало на те, що АА-індукована ГПН ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)модель переходу була успішно створена. Дослідити роль SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)при АКІ-індукованій ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок) переходу, ми оцінили його експресію в зразках нирок мишей, яким вводили AA. Ми знайшли SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)і p-SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)(Thr182) зменшувалися залежно від часу після ін’єкції AA (рис. 2g), що вказує на потенційну роль SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)у регулюванні АКІ-індукованої ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід.
Рис. 2 SIK1 був знижений у AA-індукованих AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехідні миші.ELISA аналіз експресії IL-1 і TNF у різних групах мишей. b Вестерн-блот і ПЛР-аналіз експресії маркерів запалення та фіброзу (Caspase1/p20/p10, FN і COL1) у реальному часі; c Вестерн-блот і ПЛР-аналіз експресії маркерів EMT (E-cadherin, Vimentin і -SMA) у реальному часі. d Репрезентативні зображення імуногістохімічного фарбування Е-кадгерину в різних групах мишей. Масштаб =50 мкм. На графіку показано кількісний аналіз Е-кадгерину в імуногістохімічно пофарбованих зрізах. e Нирковий індекс, Scr, BUN і 24-годинний рівень білка в сечі в різних групах мишей. f Репрезентативне гістологічне фарбування (HE, PAS і трихромне фарбування за Массоном) зображення тканин нирок у різних групах мишей. Масштаб =50 мкм. g Вестерн-блот аналіз рівнів білків SIK1 і p-SIK (Thr182) у мишей C57BL/6. Дані показані як середнє ± sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Надмірна експресія SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)пом’якшена АКН-індукована ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід
Для визначення функції SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)при АКІ-індукованій ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)ми вводили AAV9-SikI у хвостову вену мишей для надмірної експресії SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1). Ми виявили, що після ін’єкції AAV9-Sik1 індукована АА ниркова дисфункція значно покращилася, про що свідчить зниження рівня ниркового індексу, Scr, BUN і 24-годинного білка в сечі (рис. 3a). ПЛР у реальному часі виявила, що AAV9-Sik1(Кіназа, індукована сіллю 1)полегшення індукованої АА запальної відповіді (рис. 3b). Крім того, AAV9-Sik1(Кіназа, індукована сіллю 1)значно покращили гістопатологічні пошкодження, спричинені AA (рис. 3c). Крім того, результати імуногістохімічного фарбування припустили, що AAV9-Sik1(Кіназа, індукована сіллю 1)полегшення інтерстиціального фіброзу та ЕМТ у процесі АКІ-індукованої ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід (рис.3d). Загалом, ці результати показали, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)відігравав захисну роль у спричиненому АА ГУН-ХНН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід.
Користь для здоров'я Cistanche: покращує роботу нирок
SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)знижувалася в клітинах HK2, оброблених AA. Велика кількість досліджень показала, що проксимальний канальець нирки є однією з головних мішеней пошкодження при ГПН.(Гостре ураження нирок), і пошкодження проксимального канальця може відігравати важливу патофізіологічну роль у розвитку ГПН-ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід. Для подальшої оцінки SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)був знижений in vitro, ми зосередилися на клітинах HK2 у цьому дослідженні. Виконуючи аналізи CCK8, ми вибираємо 10 мкмоль/л АК як оптимальну концентрацію для наступних експериментів (додатковий файл 2). Послідовно лікування АА демонструвало посилення запалення, ЕМТ та фіброзу в клітинах HK2 (рис. 4a-c), що свідчить про індуковане АА пошкодження клітин HK2 in vitro. Згодом ми перевірили рівні білка SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)і спостерігали помітне зниження SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)та p-SIK1(Thr182) у клітинах HK2 у присутності AA (рис. 4d). Крім того, ми виявили розташування SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)білок у клітинах HK2 до та після впливу AA за допомогою імунофлуоресцентного фарбування. У нестимульованих клітинах SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)спостерігався як в ядрі, так і в цитоплазмі. При лікуванні АА спостерігається експресія SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)був знижений і SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)поступово виявлявся в ядрі (додатковий файл 3). У сукупності ці результати з'ясували, що SIK1 був залучений до AA-індукованого пошкодження клітин HK2.
Рис. 3 Надмірна експресія SIK1 полегшила АКІ-індукований ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід.a. Нирковий індекс, Scr, BUN і 24-годинний рівень білка в сечі в різних групах мишей. b ПЛР-аналіз у реальному часі рівнів мРНК каспази 1 та IL-1 у різних групах мишей. c HE, PAS і трихромне фарбування за Массоном використовували для оцінки гістологічних змін і ступеня тубулоінтерстиціального фіброзу. Масштаб =50 мкм. d Репрезентативні зображення імуногістохімічного фарбування E-кадгерину, -SMA та білка COLI у різних групах мишей. Масштаб =50 мкм. На графіках показано кількісний аналіз Е-кадгерину, -SMA та COL1 у імуногістохімічно пофарбованих зрізах. Дані представлені як середнє ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
екстракт цистанки: покращує функцію нирок
Надмірна експресія SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)покращує ураження клітин HK2, викликане AA
Для подальшого з'ясування ролі SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)при пошкодженні клітин HK2, спричиненому AA, ми сконструювали клітинні лінії, які стабільно підвищують регуляцію SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)лентивірусною інфекцією клітин HK2 (додатковий файл 4). Надмірна експресія SIK1 призвела до значного збільшення E-кадгерину та придушення Caspasel/p20/p10, Vimentin, COLI та Fspl у порівнянні з контрольними клітинами, стимульованими лише AA (рис. 4e, f). Крім того, надекспресія SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)інгібував міграційну здатність клітин HK2, індуковану AA (фіг.4g). Разом ці результати продемонстрували, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)був захисним від AA-індукованого пошкодження в клітинах HK2.
Рис. 4 SIK1 знижувався в клітинах HK2, оброблених AA, і надмірна експресія SIK1 покращувала індуковане AA пошкодження клітин HK2.a. ІФА-виявлення рівнів IL{{0}} і TNF- у супернатанті клітин HK2, оброблених 10 мкмоль/л АК протягом 0 год, 24 год, 48 год і 72 год. b Вестерн-блот аналіз рівнів білка каспази 1/p20/p10, E-кадгерину, ZO-1, віментину та -SMA в клітинах HK2, оброблених 10 мкмоль/л АК протягом 0 год, 24 год, 48 год, і 72 год, з найбільшим ефектом після 72 год лікування. -актин використовували як контроль. c ПЛР-аналіз у реальному часі індикаторів раннього фіброзу (COLI, PAI-1 і MMP9) рівнів мРНК у клітинах HK2, оброблених 10 мкмоль/л АК протягом 72 годин. d Вестерн-блот аналіз рівнів p-SIK1(Thr182) і SIK1 у клітинах HK2, оброблених 10 мкмоль/л АК протягом 0 год, 24 год, 48 год і 72 год. e Вестерн-блот аналіз каспази1/p20/p10, E-кадгерину, віментину, Fsp1 та COL1 у клітинах HK2, оброблених вектором SIK1 (вектор надекспресії лентивірусу SIK1) у присутності 10 мкмоль/л АК або оброблених 10 мкмоль /L AA окремо протягом 72 год. f Репрезентативні імунофлуоресцентні зображення E-кадгерину та віментину в клітинах HK2. Масштаб =50 мкм. g Репрезентативні результати міграції клітин HK2. Масштаб =50 мкм. Дані показані як середнє ± sd *P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Екстракт цистанки пустирної: лікування захворювань нирок
SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)регульований сигнальний шлях WNT/-катеніну in vivo та in vitro
Розгляд критичної ролі WNT/-катенінового шляху при ГПН-ХХН(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)перехід, ми досліджували, чи SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)регулював шлях WNT/-катеніну. В експериментах in vivo ми спостерігали, що надекспресія SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)пригнічує рівні білка WNT1, p- -катеніну (Y654) і ядерного -катеніну в AA-індукованих AKI-CKD(Гостре ураження нирок переходить у хронічну хворобу нирок)мишей (рис.5а). Щоб додатково дослідити, чи SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)регулював шлях WNT/-катеніну in vitro, ми заглушили експресію SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)за допомогою shRNA у клітинах HK2 (додатковий файл 5). Відповідно до результатів in vivo, глушіння SIK1 призвело до помітного підвищення рівнів мРНК -катеніну, TCF4 і LEF1 (рис. 5b). Крім того, нокдаун SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)підвищив рівень білка -катеніну та p- -катеніну (Y654) (рис. 5c). Крім того, нокдаун SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)сприяв ядерній транслокації -катеніну (рис. 5d). У сукупності ці дані свідчать про те, що SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)регулював шлях WNT/-катеніну in vivo та in vitro.
Рис. 5 SIK1 регулює шлях WNT/-катеніну in vivo та in vitro.a. Вестерн-блот аналіз рівнів білка SIK1, WNT1, p- -catenin (Y654) і ядерного катеніну в різних групах мишей. b ПЛР-аналіз у реальному часі -катеніну, TCF4 і LEF1 у клітинах HK2, оброблених SIK1 shRNA або Scramble shRNA. c Вестерн-блот аналіз -катеніну та p- -катеніну (Y654) у клітинах HK2, оброблених SIK1 shRNA або Scramble shRNA.d Репрезентативні імунофлуоресцентні зображення -катеніну в клітинах HK2. Масштаб =50 um. Дані показані як середнє ± sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Сигнальний шлях WNT/-catenin бере участь у пошкодженні клітин HK2, викликаному AA
Щоб дослідити, чи відіграє шлях WNT/-катеніну роль у пошкодженні клітин HK2, викликаному AA, ми перевірили рівні експресії WNT1, ядерного катеніну та p- -catenin (Y654) після лікування AA. Результати вестерн-блоту показали, що WNT1, ядерний -катенін і p- -катенін (Y654) значно зросли після стимуляції АА (додатковий файл 6a). Крім того, імунофлуоресцентне фарбування виявило ядерну транслокацію -катеніну (додатковий файл 6b), що свідчить про те, що стимуляція АА може активувати сигнальний шлях WNT/-катеніну. Враховуючи, що -катенін є центральним компонентом шляху WNT/-катеніну, нам цікаво, чи регуляція -катеніну регулює AA-індуковане пошкодження клітин HK2. Таким чином, ми стабільно збили -катенін за допомогою shRNA лентивірусу в клітинах HK2 (додатковий файл 6c). І ми помітили, що нокдаун -катеніну порушує експресію каспасела, IL-1, віментину, PAI-1 і MMP9, спричинену AA, і сприяє експресії E-кадгерину (рис. 6a, b). Крім того, клітини shRNA -катеніну, стимульовані AA, показали значно знижену міграцію порівняно з контрольними клітинами β-катеніну, стимульованими тільки AA (рис. 6c). У сукупності ці результати свідчать про те, що шлях WNT/-катеніну бере участь у пошкодженні клітин HK2, викликаному AA.
Мал. 6 Сигнальний шлях WNT/B-катеніну бере участь у пошкодженні клітин HK2, викликаному AA.Клітини HK2 обробляли shRNA B-катеніну або shRNA Scramble у присутності 10 мкмоль/LAA. ПЛР-аналіз у реальному часі Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1.і Рівні мРНК MMP9 у клітинах HK2. b Репрезентативні імунофлуоресцентні зображення E-кадгерину та віментину в клітинах HK2. Масштаб =50 um.c Показові результати міграції клітин HK2. Масштаб =50 um. Дані представлені як середнє ± sd*P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Для SIK1 необхідний сигнальний шлях WNT/-catenin(Кіназа, індукована сіллю 1)опосередковане пошкодження клітин HK2, викликане AA
Щоб вивчити, чи SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)регульоване AA-індуковане пошкодження клітин HK2 через сигнальний шлях WNT/-catenin, -catenin був додатково знижений у SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)нокдаун клітин HK2. Порівняно з нокдаун-клітинами SIK1, подальше нокдаун -катеніну знизило рівні мРНК Caspasel, COL1 та Vimentin, одночасно збільшуючи рівні мРНК E-кадгерину (рис. 7a). Результати Вестерн-блоту узгоджувалися з ПЛР у реальному часі, показуючи, що глушіння -катеніну та SIK1 скасовувало пригнічення E-кадгерину, посилення каспасела/p20/p10 та віментину, індукованих SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)нокдаун (рис. 7б).
У сукупності ці результати показали, що інгібування -катеніну скасовувало запальну реакцію, ЕМТ та прогресування фіброзу, опосередкованого SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)нокдаун, який чітко показує, що шлях WNT/-катеніну був необхідний для SIK1(Кіназа, індукована сіллю 1)опосередковане пошкодження клітин HK2, викликане AA.
Рис. 7 Шлях WNT/-катеніну необхідний для опосередкованого SIK1 пошкодження клітин HK2, викликаного AA.Клітини HK-2 були спільно трансфіковані SIK1 і B-катеніновою shRNA або трансфіковані лише SIK1 або -catenin shRNA, а потім оброблені 10 мкмоль/л AA для 72 га ПЛР-аналізу Caspase1, COL1 у реальному часі. Експресія е-кадгерину та віментину. b. Вестерн-блот аналіз експресії каспази1/p20/p10, E-кадгерину та віментину. Дані наведено як середнє ± sd*P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Роль Twist1 в пошкодженні клітин HK2, викликаному AA
Діючи як EMT-TF, Twistl може сприяти EMT і фіброзу нирок. У цьому дослідженні ми виявили, що AA сприяє експресії білка та мРНК Snail і Twist1, тоді як нокдаун -catenin пригнічує експресію Snail і Twist1, індуковану AA (рис. 8a), що вказує на те, що Snail і Twist1 розташовані нижче за -catenin і грають роль у пошкодженні клітин HK2, викликаному AA. Щоб перевірити нашу гіпотезу, ми знищили Twist1 за допомогою siRNA (додатковий файл 7) і провели ПЛР у реальному часі та Вестерн-блот аналіз. Як і очікувалося, у порівнянні з контрольними клітинами, стимульованими лише AA, експресія Vimentin і COLI була знижена, тоді як ZO-1 була збільшена в клітинах miRNA Twist1 у присутності AA, що свідчить про те, що мовчання Twist1 полегшувало виникнення EMT і прогресування фіброзу нирок, індукованого AA (рис. 8b і c).
Рис.8. Роль Twist у пошкодженні клітин HK2, спричиненому AA.Вестерн-блот і ПЛР-аналіз у реальному часі рівнів Snail і Twist1 у клітинах HK2. b ПЛР-аналіз у реальному часі рівнів Twist1, COL1, ZO-1 і Vimentin у клітинах HK2, оброблених Twist1 miRNA або NC miRNA.c. Вестерн-блот аналіз рівнів Twist1, ZO-1 і віментину в клітинах HK2, оброблених Twist1 siRNA або NC siRNA. Дані представлені як середнє ± sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
