ЧАСТИНАⅠ: Нові захисні ефекти екстракту Cistanche Tubulosa проти дегенеративної ретинопатії, спричиненої синім світлом низької яскравості

Контактна особа: Одрі Хуaudrey.hu@wecistanche.com

Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng

Фармацевтична школа, Фармацевтичний коледж, Тайбейський медичний університет, Тайбей, Кафедра офтальмології, Тайбейський медичний університет, Тайбей, Факультет фармакології, Медична школа, Медичний коледж, Тайбейський медичний університет, Тайбей, Вища школа медичних наук, Коледж Медицина, Тайбейський медичний університет, Тайбей, Ph.D. Програма досліджень і розробок у галузі біотехнології, Фармацевтичний коледж, Тайбейський медичний університет, Тайбей, Тайвань

Анотація

Передумови/Цілі:Фототоксичність, викликана синім світлодіодним світлом (BLL), відіграє важливу роль в очних захворюваннях і викликає дегенерацію сітківки та апоптоз у клітинах пігментного епітелію сітківки (RPE) людини.Екстракт цистанхи трубчастої (CTE)є традиційною китайською медициною з багатьма корисними захисними властивостями; однак мало досліджень вивчали захисну роль CTE для очей. У цьому дослідженні ми досліджували механізми, що лежать в основі впливу CTE на індукований BLL апоптоз in vitro та in vivo. Методи: у поточному дослідженні in vitro застосовували клітини RPE, а життєздатність клітин визначали 3-(4,5-диметилтіазол- 2-іл)-2,{{6} }аналіз дифенілтетразолію броміду. Експресію білка, пов'язану з апоптозом, визначали за допомогою вестерн-блот аналізу та імунофлуоресцентного фарбування. Коричневі норвезькі щури були використані для дослідження впливу комерційно доступного BLL in vivo. Для дослідження морфологічної деформації сітківки використовували фарбування гематоксиліном та еозином, мітку кінцевої дезоксинуклеотидилтрансферази dUTP (TUNEL) і вестерн-блот. Результати: CTE істотно пригнічує пошкодження RPE, спричинені перекисом водню, третбутилгідропероксидом, азидом натрію та BLL. Крім того, CTE знижував експресію апоптотичних маркерів, таких як розщеплена каспаза-3 та фарбування TUNEL після впливу BLL шляхом інактивації апоптотичних шляхів, як показано за допомогою імунофлуоресцентного фарбування. Крім того, CTE інгібував BLL-індуковане фосфорилювання N-кінцевої кінази c-Jun, кінази 1/2, пов’язаної з додатковим сигналом, і p38 у клітинах RPE. In vivo пероральне введення CTE позбавило від 60--денного періодичного впливу BLL зменшення товщини сітківки та зменшило кількість TUNEL-позитивних клітин у моделі коричневих норвезьких щурів. Висновок: CTE є потенційним профілактичним засобом проти фототоксичності, спричиненої BLL

Цистанка трубчаста

вступ

Дослідження вікової дегенерації жовтої плями (ВМД) показали, що 8,7% населення світу страждає від цього захворювання [1]. AMD є нейродегенеративним захворюванням, яке викликає деформацію фоторецепторів, атрофію пігментного епітелію сітківки (RPE), апоптоз гангліозних клітин і центральну втрату зору у людей похилого віку, і стає глобальним соціальним тягарем. ВМД поділяють на суху або вологу форму [2, 3]. Удосконалення технологій призвело до того, що люди проводять більше часу, використовуючи сучасні цифрові пристрої, і, отже, люди піддаються впливу синього світла (BL) протягом тривалого часу. Однак проблема фототоксичності сітківки, спричиненої BL, недостатньо вивчена. Надмірне опромінення короткохвильовим BL (450–495 нм) призводить до утворення активних форм кисню (АФК), таких як супероксид і гідроксильні радикали, які викликають збільшення споживання кисню та індукують пошкодження мітохондріальної ДНК. Накопичення ROS призводить до окислювального стресу та екстенсивного накопичення ретиноїдних аддуктів, які ще більше пошкоджують сітківку [4]. Дослідження показали, що оксидативний стрес є провідним фактором у патогенезі сухої ВМД [5]. Крім того, BL-опромінення знижує експресію антиоксидантних ферментів сітківки, таких як супероксиддисмутаза та каталаза, опосередковуючи взаємодії білка Bax/Bcl-2 і сприяючи ендогенному виробленню АФК. Таким чином, клітини RPE та мітохондрії зовнішнього сегмента фоторецепторів страждають від пошкодження, спричиненого опроміненням BL [6, 7]. На додаток до генерації ROS, опромінення BL активує мітоген-активовані протеїнкінази (MAPK), які відіграють важливу роль у виживанні та апоптозі клітин. мітохондріально-залежні проапоптотичні білки, пов’язані з апоптозом, такі як Bax і каспаза -3, активуються світлодіодним опроміненням BL-emitting light (BLL) через N-кінцеву кіназу c-Jun (JNK) і шляхи p38 у РПЕ та гангліозні клітини сітківки [8]. Крім того, фосфатидилінозитол 3-кіназа (PI3K)/Akt і ядерний фактор еритроїдного 2-пов’язаного фактора 2 (Nrf2) залежні антиоксидантні шляхи є компонентами захисної системи клітин RPE [{{34} }].

Екстракт цистанхи трубчастої (CTE)містить похідні фенілетаноїдних глікозидів і десятиліттями використовується як традиційна китайська медицина. Ехінакозид, актеозид та ізоактеозид є трьома основними активними сполуками CTE, які характеризуються як такі, що мають нейропротекторні, покращуючі пам’ять, імунорегуляційні та протифіброзні властивості печінки [13, 14]. Ехінакозид є поглиначем АФК і захищає від апоптозу, викликаного 1-метил-4-фенілпіридінієвим іоном (MPP plus ), у тваринних моделях хвороби Паркінсона [15, 16]. Актеозид захищає від нейротоксичності, - -спричиненої амілоїдом, і зменшує запалення, стимульоване ліпополісахаридами, яке можна віднести до транслокації Nrf2 із цитоплазми в ядро ​​та зв’язування з елементами антиоксидантної реакції. Наразі доступні методи лікування вологої ВМД, такі як пегаптаніб, ранібізумаб, бевацизумаб і афліберсепт, використовуються для інгібування надмірного ангіогенезу [17, 18]. Однак не існує ефективних методів лікування сухої ВМД через численні патологічні ускладнення цього захворювання.

У цьому дослідженні ми демонструємо захисні ефекти CTE в клітинах RPE і щурах Brown Norway (BN). Крім того, ми застосовували тривалий вплив BLL низької яскравості як на моделі in vitro, так і in vivo, щоб оцінити захисні ефекти CTE. Ми виявили, що CTE знижує експресію пов'язаних з апоптозом білків після впливу BLL. Крім того, CTE зменшив кількість позитивних клітин термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази dUTP nick end marking (TUNEL) у сітківці щурів BN після тривалого впливу BLL низької яскравості. Це дослідження надає подальше розуміння нових антиапоптичних ефектів CTE та інформацію щодо нової стратегії лікування дегенерації сітківки.

Екстракт Cistanche tubulosa (CTE): фенілетаноїдний глікозид

Матеріали та методи

Хімічні речовини та продукти

CTE був щедро наданий Sinphar Pharmaceutical Company (Ілань, Тайвань). Набори для виявлення загибелі клітин in situ (Кат. № 11-684-817-910) були придбані у Roche (Мангейм, Німеччина).

Культура клітин RPE

Клітини RPE (ARPE{{0}} та ATCC® CRL-2302™) були придбані в Американській колекції типових культур (Манассас, Вірджинія) і культивовані в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (Gibco, Grand Island, NY) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки у зволоженій атмосфері з 5% CO2 при 37 градусах. Клітини ARPE-19 на пасажах 19–30 зберігалися на чашках для культур клітин 10-см (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Бельгія). Після пасування з 0,05% трипсин-етилендіамінтетраоцтової кислоти (Gibco) клітини пересівали у співвідношенні 1:4. Перед тестуванням клітини ARPE-19 висівали на 48-лункові планшети (Orange Scientific) для аналізу життєздатності клітин за щільності 1,0 × 105 клітин/мл і на 6-см чашки (Orange Scientific) ) для аналізу вестерн-блоттингу при щільності 2,0 × 105 клітин/мл протягом 24 годин. Після того, як клітини ARPE-19 досягли 80 відсотків конфлюентності, були проведені наступні експерименти.

Медикаментозне лікування та визначення життєздатності клітин

Клітини RPE на пасажі 19–30 висівали на 48-планшети з лунками та спільно обробляли протягом 24 годин різними концентраціями КТР, перекису водню (H2O2), трет-бутилгідропероксиду (t-BHP) та азиду натрію ( NaN3). Потім клітини культивували з 3-(4, 5-диметилтіазол-2-іл)-2, 5-дифенілтетразолію бромідом (МТТ) у кінцевій концентрації 1 мг /мл та інкубували протягом 30 хв. Потім до кожної лунки додавали диметилсульфоксид (200 мкл) для розчинення клітин. Поглинання вимірювали при 570 нм за допомогою спектрофотометра Sunrise™ для зчитування імуноферментного аналізу (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Значення були скориговані на фонове поглинання шляхом віднімання відповідних пустих проб. Дані отримані з п’яти незалежних аналізів.

Протокол експозиції in vitro BL

Джерело світла та клітинні пластини були розміщені на відстані 25 см одна від одної, як описано в нашому попередньому дослідженні [19]. Яскравість вимірювали люксметром (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Тайбей, Тайвань). BLL досяг піку при 460 нм (60 люкс) протягом зазначеного часу (0–48 год), залежно від плану експерименту.

Вестерн-блот

Після 0–48-год спільної обробки з експозицією CTE та BLL клітини двічі промивали охолодженим фосфатним буферним розчином (PBS) і ресуспендували в буфері для лізису радіоімунопреципітаційного аналізу (1% Nonidet P-40, 50 мМ Tris-HCl рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ етиленгліколь-біс (-аміноетиловий ефір)-N,N,N′,N′-тетраоцтова кислота, 1 мМ NaF та суміш інгібіторів протеази/фосфатази). Клітинний лізат отримували шляхом центрифугування при 12, 000 × g протягом 35 хвилин, а супернатант збирали для визначення концентрації білка за допомогою реагенту Бредфорда (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Рівні кількості зразків білка розділяли електрофорезом у 10-12% додецилсульфату натрію в поліакриламідному гелі, а потім переносили на мембрану з полівінілідендифториду. Після блокування мембрани 5-відсотковим знежиреним молоком та інкубації в трис-буферному фізіологічному розчині з Tween 20 (TBST) протягом 1 години було проведено імуноблоттинг з первинними антитілами, специфічними для розщепленої каспази-3, фосфо-JNK, JNK , фосфо-p38, p38, кіназа, пов’язана з фосфо-позаклітинним сигналом (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, Fas-асоційований білок із доменом смерті (FADD), каспаза-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ліганд (Abcam, Cambridge, UK) і b-актин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Потім блоти інкубували з вторинними антитілами, кон’югованими з пероксидазою хрону (1:6000 у TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) протягом 1 години при кімнатній температурі. Використовуючи покращений хемілюмінесцентний набір (Millipore, Billerica, MA), інтенсивність смуг на кожному блоті аналізували за допомогою програмного забезпечення Image J після нормалізації до b-актину.

Імунофлюоресценція

Клітини RPE фіксували 4% параформальдегідом у PBS протягом 15 хв. Тритон X-100 у PBS (0.2 відсотка) потім додавали до клітин на 15 хвилин, а потім 5% фетальної бичачої сироватки в PBS протягом 30 хвилин; потім клітини інкубували з антитілом проти розщеплення каспази-3 у співвідношенні 1:250 протягом 24 годин (Cell Signaling Technology, Денверс, Массачусетс). Вторинне антитіло кози проти кролика IgG (Dylight 594) використовували у співвідношенні 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Клітинні ядра фарбували 4′-6-діамідіно-2-феніліндолом (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Зміни флуоресценції спостерігали за допомогою лазерної системи конфокального спектрального мікроскопа CS SP5 (Leica, Teban Gardens, Сінгапур).

Фарбування TUNEL

Фрагменти ДНК, які можна виявити за допомогою аналізу TUNEL, є важливою ознакою апоптозу. Ми використали набір для виявлення загибелі клітин In Situ (Кат. № 11-684-817-910; Roche) для вимірювання апоптотичної запрограмованої загибелі клітин RPE згідно з протоколом виробника. Коротко кажучи, ми зафіксували клітини RPE 4% параформальдегідом і позначили розриви ланцюга ДНК у ферментативній реакції для виявлення TUNEL-позитивних клітин, які мали зелену флуоресцентну пляму. Потім пофарбовані клітини сканували та аналізували за допомогою системи візуалізації Tissue FAXS-plus (TissueGnostics, Відень, Австрія). Десять тисяч подій було підраховано в закритій області RPE, і ми проаналізували зображення на кількість TUNEL-позитивних клітин за допомогою програмного забезпечення TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).

Досліди на тваринах

Самці щурів BN (маса тіла 300–350 г) були придбані в Національному лабораторному центрі тварин (Тайбей, Тайвань) і зберігалися протягом 2–3 місяців. Щурів утримували в циклі світло/темрява 12-h/12-h при температурі 26 ± 1°, відносній вологості 35–47% і вільному доступі до води та їжі. Нелікованих щурів тримали в темряві, щоб служити контролем. Протоколи дослідження були схвалені Інституційним комітетом з догляду за тваринами Тайбейського медичного університету (номер схвалення: LAC-2016-0442). Усі експериментальні процедури з використанням тварин відповідали положенням Асоціації досліджень зору та офтальмології щодо використання тварин в офтальмологічних та зорових експериментальних дослідженнях.

BLL-індукована щуряча модель дегенерації сітківки

Ми використовували періодичну модель дегенерації сітківки, спричинену довгостроковим впливом BLL із низькою яскравістю, як описано в нашому попередньому дослідженні [19]. Коротко, щури BN були розділені на три групи: контрольна група, яка утримувалася в темних умовах; групу, що опромінювала BLL, яка піддавалася періодичному впливу BLL у темряві без розширення зіниці (460 нм, 150 люкс) протягом 3 годин на день протягом 60 днів; і групу, яка отримувала лікування CTE плюс BLL, яку попередньо обробляли CTE (100 мг/кг маси тіла) протягом 14 днів, а потім спільно лікували з періодичним впливом BLL протягом 3 годин на день протягом 60 днів. Усіх щурів повернули до колоній тварин і в кінці експериментального періоду відновили нормальний цикл світло/темрява (250 люкс, 12 год/12 год).

Статистичний аналіз

Значні відмінності були розраховані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з наступним тестом Тьюкі та тестом множинних порівнянь. Статистичну значущість визначали за р-значеннями<>

Продукти Cistanche tubulosa

Результати

CTE захищає клітини RPE від пошкодження, викликаного окислювальним стресом

Щоб оцінити цитотоксичність CTE за допомогою аналізу MTT, декілька концентрацій CTE ({{{{20}}}–500 мкг/мл) були застосовані до клітин RPE. Обробка CTE не мала явного токсичного впливу на життєздатність клітин RPE при будь-якій з перевірених концентрацій (рис. 1A). Тому в наступних експериментах використовували КТР 50 і 100 мкг/мл. Щоб дослідити антиапоптотичні ефекти CTE, різні індуктори окислення (H2O2, t-BHP і NaN3) вводили разом з CTE до клітин RPE протягом 24 годин. H2O2, NaN3 і t-BHP знижували життєздатність клітин і пошкоджували клітини RPE залежно від дози (посічені стовпчики, рис. 1B, 1C і 1D); життєздатність клітин була значно нижчою в клітинах, оброблених 0,03 мМ H2O2, 0,3 мМ NaN3 і 0,3 мМ t-BHP, ніж у контрольній групі.

Однак спільне лікування 50 і 100 мкг/мл CTE послаблювало H2O2-, NaN3- і t-BHP-індуковане пошкодження клітин RPE і скасовувало зниження життєздатності клітин (чорні смуги, рис. 1B, 1C і 1D). Наведені вище дані свідчать про те, що CTE рятує клітини RPE від пошкодження, викликаного окислювальним стресом.

CTE пригнічує загибель клітин RPE, індуковану BLL

У нашому попередньому дослідженні ми виявили, що BLL є цитотоксичним для клітин RPE, що пояснюється змінами в експресії Bcl-2 і Bax. У цьому дослідженні ми додатково вивчили захисні ефекти CTE на BLL-індуковане пошкодження клітин RPE. Ми помістили дві сині електричні світлодіодні пластини в інкубатор для культури клітин. Відстань між джерелом світла та клітинними пластинами становила 25 см, а інтенсивність BLL становила 60 люкс, як виміряно люксметром (рис. 2A). Аналіз MTT продемонстрував, що вплив BLL протягом різних періодів часу (6–48 годин) викликав загибель клітин RPE залежно від часу (рис. 2B). Зниження життєздатності клітин, викликане BLL, через 24 і 48 годин було значно послаблене, коли клітини одночасно обробляли CTE (100 мкг/мл) (рис. 2C). Ці дані свідчать про те, що CTE захищає клітини RPE від фототоксичності, викликаної BLL.

CTE пригнічує BLL-індукований апоптоз у клітинах RPE, регулюючи шляхи Bcl-2/Bax і Fas/FasL

На основі потенційних захисних ефектів CTE в клітинах RPE ми додатково дослідили можливу участь CTE у цьому процесі. Було досліджено два апоптотичні сигнальні шляхи, тобто шляхи Bax/Bcl{{0}} та Fas/Fas ліганд (FasL), а також споріднені білки (наприклад, прокаспаза-8 та прокаспаза -3; рис. 3A і 3B). Було виявлено, що вплив BILL (6–48 годин) посилює експресію білків Bax/Bcl-2, FasL і FADD залежно від часу (рис. 3A). Крім того, BLL знижував експресію білків прокаспази-3 та прокаспази-8, що призвело до більшої кількості форм розщеплення каспаз-3 та каспази-8 після впливу BLL, що узгоджується з нашими попереднє дослідження [19]. Для подальшої оцінки захисних ефектів CTE різні концентрації CTE були застосовані до клітин RPE, підданих впливу BLL (рис. 3B). Після 48-год впливу BLL КТР (50 мкг/мл) зменшив співвідношення Bax/Bcl-2. Крім того, КТР (100 мкг/мл) знизив експресію білка FasL і FADD, але значно підвищив рівні прокаспази-8 і прокаспази-3 (рис. 3C і 3D). Дослідження показали, що активація каспази-3 є маркером апоптозу в клітинах RPE [20]. Для подальшого підтвердження захисних ефектів CTE ми провели імунофлуоресцентне фарбування розщепленої каспази -3. Встановлено, що вплив BILL протягом 48 годин індукує розщеплення каспази-3 та транслокацію в ядро, що призводить до апоптозу клітин RPE (жовті стрілки, рис. 4A). Однак, коли клітини, які зазнали впливу BLL, одночасно обробляли CTE (100 мкг/мл), індукована BLL експресія розщепленої каспази-3 пригнічувалася. Щоб краще зрозуміти антиапоптотичні ефекти CTE, ми використали фарбування TUNEL для виявлення фрагментів ДНК у клітинах RPE. Після 48-години впливу BLL TUNEL-позитивних клітин зросла з 1,78 ± 0,36 відсотка до 23,82 ± 0,33 відсотка; цей ефект був послаблений при одночасному лікуванні з CTE (23,82 ± 0,33 відсотка до 2,22 ± 0,11 відсотка; рис. 4B, 4C і 4D). Ці результати вказують на те, що лікування CTE надійно захищає клітини RPE від індукованого BLL апоптозу, опосередковуючи шляхи Bax/Bcl-2 і FasL/FADD.

CTE пригнічує BLL-індуковане фосфорилювання білків відповіді на стрес у клітинах RPE

Попередні дослідження продемонстрували, що шляхи MAPK, такі як ERK, JNK і p38 MAP, активуються в клітинах RPE і в сітківці після впливу ультрафіолетового світла або BL [21, 22]. Таким чином, щоб дослідити регуляторний вплив CTE на шлях відповіді на стрес MAPK після впливу BLL, 100 мкг/мл CTE застосовували до клітин RPE за різного часу впливу BLL (рис. 5A). Вестерн-блот аналіз показав, що фосфорильовані ERK, JNK і p38 були активовані під час впливу BLL, але значно інгібувалися при спільному лікуванні з CTE у клітинах RPE (рис. 5B). Наведені вище результати вказують на те, що CTE пригнічує BLL-індуковане пошкодження клітин RPE, яке може бути пов’язане з інгібуванням MAPK у клітинах RPE.

CTE рятує BLL-індуковане пошкодження сітківки після тривалого періодичного впливу на моделі щурів

Щоб оцінити захисні ефекти CTE, ми піддавали щурів BN тривалому впливу BLL протягом 60 днів і оцінювали вплив CTE. Як показано на схемі, представленій на рис. 6A, щури BN були розділені на три групи: контрольна група, група, що піддавалася BLL, і група CTE плюс BLL (рис. 6A). У групі CTE плюс BLL щурам BN безперервно додавали CTE (100 мг/кг маси тіла) перорально один раз на день протягом 14 днів до впливу BLL. У день 0 щурів BN одночасно лікували CTE (100 мг/кг маси тіла) і піддавали BLL протягом 3 годин на день протягом 60 днів. Після 60 днів впливу BLL тварин умертвляли для вестерн-блот аналізу та імуногістохімічного фарбування. У групі CTE плюс BLL експресія білка прокаспази-3 в гомогенатах очей щурів була вищою після обробки CTE, ніж у групі BLL (рис. 6B і 6C). Ці дані показують, що CTE запобігає довгостроковій фототоксичності сітківки та апоптозу, спричиненому BLL низької яскравості, шляхом пригнічення активації розщепленої каспази-3. Імуногістохімічне фарбування надало більше доказів щодо захисних ефектів CTE на структуру та фізіологічні шляхи сітківки (рис. 7). Крім того, після експозиції BLL ми виявили, що внутрішній шар нейронів був зменшений і спостерігалися морфологічні деформації на зовнішньому нейронному шарі (ONL), включаючи внутрішній сегмент/зовнішній сегмент як у центральній, так і периферійній сітківці, що узгоджується з нашим попереднім дослідженням ( рис. 7B). Важливо, що CTE запобігав деформації клітин RPE, пошкодженню клітин нейронів і загальному витонченню сітківки в групі CTE плюс BLL (рис. 7C). Крім того, ми не спостерігали TUNEL-позитивних клітин у центральній і периферійній сітківці нормальних щурів (рис. 8Ab і 8Bb). Навпаки, після впливу BLL протягом 60 днів TUNEL-позитивні клітини часто виявлялися в ONL центральної та периферичної сітківки (рис. 8Ae та 8Be). Фарбування DAPI ONL центральної сітківки було помітно зменшено в групі BLL (рис. 8Ad). Однак присутність TUNEL-позитивних клітин була послаблена, а фарбування DAPI центральної та периферичної сітківки ONL збільшилося в групі CTE плюс BLL (рис. 8Ai та 8Bi).

Продукти Cistanche tubulosa

Наступна частина Ⅱ буде продовжена