ЧАСТИНАⅠ: Вплив і молекулярний механізм пахімінової кислоти на ниркову ішемію, реперфузійне пошкодження
Mar 25, 2022
Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG & XIAO-HUI LIAO
вступ
Гостре ураження нирок (ГНН)це поширене клінічне захворювання, яке спричинене кількома етіологіями та має складний патофізіологічний процес (1). Рівні захворюваності та смертності від ГПН є високими серед дорослих і дітей, що призводить до значних витрат на госпіталізацію (2,3). Мета-аналіз глобальної захворюваності на ГПН показав, що рівень захворюваності на ГПН становив 21,6 відсотка серед дорослих і 33,7 відсотка у дітей, а показники пов’язаної з ГПН смертності становили 23,9 відсотка серед дорослих і 13,8 відсотка у дітей (4). ГПН зустрічається приблизно у 20 відсотків госпіталізованих пацієнтів, 10 відсотків з яких потребують замісної ниркової терапії, а також у 50 відсотків пацієнтів у відділеннях інтенсивної терапії, що значно збільшує тривалість і вартість госпіталізації (5). ГПН характеризується різке короткочасне зниження швидкості клубочкової фільтрації, що супроводжується підвищенням креатиніну сироватки крові, олігурією або тим і іншим; ці зміни можуть призвести до хронічної хвороби нирок або термінальної стадії ниркової недостатності (6). Через варіабельність ураження нирок, відсутність надійних ранніх біомаркерів і неоднорідність шляхів, залучених до патофізіології, наразі немає ефективних засобів профілактики та втручання, окрім консервативного лікування та замісної ниркової терапії (7). Таким чином, виявлення нових схем лікування та препаратів для ГПН є особливо важливим. За останнє десятиліття було проведено безліч досліджень, що розширюють традиційний погляд на некроз. Останні дослідження поставили під сумнів традиційні погляди на загибель клітин, визначивши нові шляхи, у яких клітини гинуть регульованим чином, але мають морфологічні ознаки некрозу (7-9). Цей регульований некроз приймає кілька форм: некроптоз, фероптоз, піроптоз, некроз, зумовлений переходом мітохондріальної проникності, і партанатоз (10). Некроптоз і фероптоз є найбільш вивченими формами регульованого некрозу нирок (11). Попереднє дослідження продемонструвало, що інгібування фероптозу ефективно полегшує ГПН (12).
cistanche pharma specialдлянирка
Ферроптоз — це новий тип регулятивної загибелі клітин, який вперше був запропонований Діксоном та ін. у 2012 році (13). Цей тип клітинної смерті є залізозалежним і супроводжується масивним накопиченням заліза та перекисним окисленням ліпідів під час клітинної смерті (13). Ферроптоз відіграє важливу регуляторну роль у виникненні та розвитку кількох захворювань, включаючи пухлини, неврологічні захворювання та AKI (14). У дослідженні in vivo ферростатин 1 або 16-86 вводили за 15 хвилин до ішемії мишей з сильнийішемічно-реперфузійне пошкодження(IRI)-AKI, пошкодження ниркової тканини, сироватковий креатинін і сечовина зменшилися у мишей через 48 годин після ішемії, таким чином, припускаючи, що фероптоз відіграє вирішальну роль у патогенезі IRI (ішемічно-реперфузійне пошкодження)(15). Таким чином, регуляція гомеостазу заліза, опір перекисному окисленню ліпідів і інгібування фероптозу можуть забезпечити багатообіцяючу терапевтичну стратегію для ГПН.
Пахидермовая кислота(PA), тритерпеноїд ланостанового типу з Poria cocos, має кілька фармакологічних ефектів, таких як протипухлинна, протизапальна, антиоксидантна, гіпоглікемічна, седативна та снодійна дії (16-20). Попереднє дослідження показало, що PA(Пахімінова кислота)може покращити пошкодження нирок під час сепсису у щурів шляхом інгібування запальних реакцій та активації ядерного фактора еритроїдного походження 2, такого як шлях 2(NRF2)/гемоксигенази 1(HO-1) через антиоксидантний стрес (21). Крім того, порикоєва кислота А ефективно посилює інгібування мелатоніну при переході від ГПН до хронічної хвороби нирок після ниркової ішемії/реперфузійного ушкодження (22). PA(Пахімінова кислота)захищає від AKI, однак цей захисний механізм ще належить дослідити далі. PA(Пахімінова кислота)повідомлялося про активацію NRF2 у дослідженні ураження нирок при сепсисі (21). Примітно, що перші два агенти, що індукують фероптоз (RSL-3 та еластин), ідентифіковані в дослідженнях фероптозу, ініціюють каскад фероптозу через інгібування глутатіонпероксидази 4 (GPX4) і транспортної системи цистин/глутамат (xC-/xCT), відповідно, обидва з яких є нижчими цілями NRF2 (23). PA(Пахімінова кислота)передбачається, що він регулює свої нижчі білки, GPX4 і xCT, активуючи NRF2 і перешкоджаючи фероптозу при ГПН. Це дослідження мало на меті дослідити вплив ПА(Пахімінова кислота)на ферроптоз у мишей з ішемічно-реперфузійним ураженням нирок і визначити його молекулярний механізм дії, щоб надати нові ідеї для лікування клінічного ГПН.
Матеріали та методи
Реактиви і тварини.
PA(Пахімінова кислота)(білий кристалічний порошок із чистотою більше або дорівнює 99,9 відсотка) був придбаний у MedChemExpress (номер за кат. HY-N0371) і зберігався подалі від світла при 4C. Загалом 30 самців мишей C57BL/6 (8-10 тижнів; 20-25 г маси тіла) були придбані в Чунцінському медичному університеті (Чонгкін, Китай). Умови утримання були такими: 12 годин світла/12 годин темряви, ~60 відсотків вологості, 25 градусів, вільний доступ до питної води та їжі та заміна постелі кожні 3 дні; питну воду та підстилку перед використанням дезінфікували. Усі досліди на тваринах проводили відповідно до Посібника з догляду та використання лабораторних тварин, виданого Національним інститутом охорони здоров’я в 1996 році (24). Це дослідження було схвалено Інституційним комітетом з догляду за тваринами та їх використанням Медичного університету Чунціна (Чунцін, Китай; номер дозволу.2018-019).
Ішемічно-реперфузійне пошкодження- Модель AKI.
Мишей годували в тих самих умовах протягом 1 тижня для отримання моделі нирокішемічно-реперфузійне пошкодження, як описано раніше (25). Мишей анестезували 50-60 мг/кг пентобарбіталу натрію (кат. № P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції; шкіру в області операції протерли 70% спиртом. Розріз був розташований зліва та справа від хребта (0,5 см), а довжина розрізу становила 1-1,5 см уздовж спини. Згодом нирки витягли з розрізу, щоб відкрити ниркову ніжку. Зажим для мікроаневризми використовувався для затискання ніжки, щоб блокувати кровотік до нирки та викликати ішемію нирки. Повна ішемія, про що свідчить зміна кольору нирки з червоного на темно-фіолетовий протягом кількох секунд. Після 40 хвилин ішемії кліпси мікроаневризми були звільнені, щоб кожна нирка могла почати реперфузію, на що вказувала зміна кольору нирок на червоний. Після нормалізації кольору нирки шкіру м’язів зашивали. Усю процедуру ішемії нирки проводили на термостаті, а температуру тіла мишей підтримували на рівні 36.{11}} градусів. Загалом 0,8 мл теплого стерильного фізіологічного розчину вводили внутрішньочеревно кожній миші. Кожну тварину клали на грілку, поки вона не прийшла до повної свідомості, а потім повертали в клітку. Мишей умертвляли через цервікальну дислокацію через 24 години після операції, а кров збирали з орбітального синуса. Одну третину ниркової тканини використовували для гістопатологічного аналізу, а решта дві третини швидко зберігали при -80 градусах.
Групи тварин.
Мишей C57BL/6 розділили на п’ять груп (n=6/група) відповідно до таблиці випадкових чисел, як показано нижче: фіктивна група (Sham), модельна група (IRI), група з низькою дозою (IRI плюс PA)) , група середньої дози (IRI плюс PAw) і група високої дози (IRI плюс PAg). Тварини в трьох експериментальних групах отримували внутрішньоочеревинну ін'єкцію ПА(Пахімінова кислота)в дозах 5, 10 і 20 мг/кг. але протягом 3 днів, до того, як була індукована модель. Обман і IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження) групам вводили однаковий об'єм диметилсульфоксиду протягом 3 днів перед індукцією моделі. Метод моделювання було виконано, як описано раніше (25). Двосторонні ниркові ніжки мишей у фіктивній групі оголювали та обробляли, як зазначено вище, але не затискали. Хірургічний розріз зашивають через 40 хв.
Біохімічний аналіз сироватки крові.
Мишей умертвляли через 24 години після операції, і 0.8-1 мл крові збирали з орбітального синуса, давали відпочити протягом 30 хвилин і центрифугували при 900xg протягом 10 хвилин при 4C. Верхній шар сироватки збирали, упаковували та зберігали при -80 градусах. Креатинін сироватки (Scr; cat.no.c011-2-1) та азот сечовини крові (BUN: cat.no.cO13-2-1) оцінювали за допомогою наборів реагентів відповідно до інструкцій виробника (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute ).
Патогістологічне дослідження.
Через 24 години після ІРІ(ішемічно-реперфузійне пошкодження), частини ниркових тканин фіксували в 10-відсотковому формаліні з нейтральним буфером протягом 24-48 год при кімнатній температурі, обробляли рутинно шляхом заливання в парафін. Фіксовані парафіном зразки тканини нарізали на зрізи товщиною 4 мкм, які встановлювали на предметне скло та фарбували гематоксиліном протягом 10 хвилин при кімнатній температурі та еозином протягом 3 хвилин при кімнатній температурі. Світловий мікроскоп BX51 (Olympus Corporation) використовувався для виявлення гістопатологічних змін нирок (збільшення, х200 і х400). Шкала Паллера була використана для оцінки некрозу ниркових канальців при ІРІ нирок(ішемічно-реперфузійне пошкодження)(26). Загалом 10 ділянок, що не перекриваються, були випадковим чином обрані під великим збільшенням за допомогою оптичного світлового мікроскопа (збільшення, x400), і 10 ниркових канальців були випадковим чином обрані в кожному полі зору. Зрізи ниркової патології трьох мишей у кожній експериментальній групі були випадковим чином відібрані для спостереження. Загалом 10 полів зору були випадковим чином обрані для кожного патологічного розділу, і 10 ниркових канальців були оцінені в кожному полі зору. Загалом спостерігали 100 канальців для кожної миші, що дало загалом 300 ниркових канальців, спостережених у кожній групі. Чим вищий бал, тим серйозніший ступінь ураження ниркових канальців.
Просвічуюча електронна мікроскопія (ТЕМ).
Ниркову тканину збирали через 24 години після операції. Після анестезії 1 мм² ниркової тканини видаляли in vivo та замочували у розчині для фіксації тканин, що складається з 2,5% глутарового альдегіду та буферного розчину фосфорної кислоти (кат. № G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) протягом 2 годин при 4 градусах, зневоднювали в поступовий етанол (50-100 відсотків) і пропіленоксид, вбудовані в Epon 812 (номер за кат. GP18{{20}}10; Bejing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. протягом 1 години при 35 градусах і затверділи протягом 24 годин при 60 градусах. Ультратонкі зрізи (товщиною 50-70 нм) помістили на 200-сітчасту мідну сітку та пофарбували 2% уранілацетату протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та 0,04% цитрату свинцю протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Зразки розглядали під електронним мікроскопом (JEM-1400 plus, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; збільшення, x5,000 та x10,{{27} }). Зображення були отримані за допомогою камери пристрою із зарядовим зв’язком SlowScan і програмного забезпечення TEM analySIS5.0 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Антиоксидантний глутатіон (GSH) і виявлення перекисного окислення ліпідів малонового діальдегіду (MDA).
Було зібрано ниркову тканину (50-100 мг) і фізіологічний сольовий розчин (кат. № B020; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) був доданий до тканини у співвідношенні вага (г): об’єм (мл) 1:9. Тканина була гомогенізована, щоб отримати 10 відсотків гомогенату тканини, який центрифугували при 13800 x g протягом 15 хвилин при 4 градусах. Супернатант видаляли і загальний вміст білка в супернатанті визначали за допомогою методу біцинхонінової кислоти (21). GSH(номер по кат.A006-2-1) і MDA(номер по кат.A003-2-2) оцінювали за допомогою наборів реагентів відповідно до інструкцій виробника (Інститут біоінженерії Nanjing Jiancheng).
Вестерн-блот.
Загальний білок екстрагували з тканин нирок миші за допомогою буфера для лізису клітин RIPA (номер кат. WO{{0}}; Інститут біоінженерії Nanjing Jiancheng), а концентрації білка визначали за допомогою аналізу BCA (номер кат. A{ {1}}; Нанкінський інститут біоінженерії Цзяньчен）. Рівні кількості білків （50мкг）були розділені за допомогою SDS-PAGE(Cox-2,10.0 ;NRF2,10.0;xCT,12,5;HO-1, 12,5; GPx4,15,0 відсотка ) і перенесли на мембрани PVDF (GE Healthcare Life Sciences). Згодом мембрани блокували 5 відсотками знежирене сухе молоко протягом 1 години при кімнатній температурі та інкубують з первинними антитілами проти: циклооксигенази 2 (ЦОГ-2; 1:1, 000; кат. № ab179800; Abcam), GPX4( 1:5,000;кат.но.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;кат.но.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 , 000 кат. № 101147; Gentex) і NRF2 (1:1, 000; кат. № D1Z9C; CST) протягом ночі при 4 градусах. Згодом мембрани промивали TBST (0,1 відсотка Tween -20)тричі. Після основного вкл після інкубації мембрани інкубували з вторинними антитілами, кон’югованими пероксидазою хрону (1:10, 000; 40295G; BIOSS) протягом 1 години при кімнатній температурі. Мембрани повторно промивали три рази за допомогою TBST і візуалізували за допомогою BeyoECLPlus (номер по каталогу P00185; Beyotime Institute of Biotechnology), використовуючи систему обробки зображень Chemi Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Інтенсивність білкових смуг визначали за допомогою Програмне забезпечення ImageJ v1.8.0 (Національний інститут здоров’я). Усі досліди проводили в трьох повторах.
Обратна транскрипція-кількісна (RT-g)ПЛР.
Загальну РНК екстрагували з нирок мишей у різних групах за допомогою реагенту TRIzol (Takara Bio, Inc.), а кДНК синтезували за допомогою набору PrimeScript RT Reagent kit з gDNA Eraser (кат. № RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) Відносні рівні цільових генів визначали за допомогою КПЦР з використанням суміші Ultra SYBR (Takara Biotechnology Co., Ltd.). RT-qPCR проводили в об’ємі 25 мкл з 2 мкл кДНК, 400 нМ кожного смислового і антисмислового праймерів і 12,5 мкл Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. на системі ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems; Thermo Fisher) Scientific, Inc.).Реакцію проводили протягом 40 циклів денатурації при 95 градусах протягом 30 секунд, відпалу при 53 градусах протягом 30 секунд і розширення при 72 градусах протягом 10 секунд. Наступні послідовності праймерів використовували для qPCR:GPX4 forward ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' і назад,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 вперед,5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' і назад,5'-GTTGAAACTGAGCGAAAA AGGC{ {28}}';xCT вперед, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' і назад,5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 вперед,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'і назад,5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3';HO-1 вперед.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' і назад,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; і -актин вперед, 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' і назад, 5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3'.
Середнє значення експресії генів після нормалізації -актину використовували як калібратор для визначення відносних рівнів цільових генів. Відносні рівні експресії цільових генів розраховували за допомогою методу 2-△C (27).
Статистичний аналіз.
Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism 7.{1}}(GraphPad Software, Inc.) і програмного забезпечення SPSS 23 (IBM Corp.. Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення трьох незалежних повторів, якщо не зазначено інше. Односторонній Для порівняння відмінностей між декількома групами використовували дисперсійний аналіз, а потім тест Tukey<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Результати
PA(Пахімінова кислота)зменшує ураження нирок у мишей з IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження). Scr і BUN є двома важливими показниками функції нирок (5). Рівні Scr і BUN були значно вищими в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)групі порівняно з групою фіктивних (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Пахімінова кислота)суттєво пом’якшив підвищення рівня креатиніну та сечовини в сироватці порівняно з IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група (П<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Пахімінова кислота)групи лікування та IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження) group (P>0.05; Рис. 1A і B).
Як показано на рис. 1D, фарбування H&E тканини нирок у фіктивній групі не продемонструвало значних змін у структурі ниркової тканини. І навпаки, IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група продемонструвала набряк і втрату епітеліальних клітин ниркових канальців, розширення канальців, інтерстиціальне запалення, інфільтрацію запальних клітин, відкладення колагену та відкладення матеріалу некрозу трубки (рис. 1D). Шкала Паллера, показник ураження ниркової тканини (26), була значно вищою в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)групи порівняно з фіктивною групою (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Пахімінова кислота)терапія значно полегшила ці ураження, а бал за Паллером був значно нижчим порівняно з показником IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група (П<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(ішемічно-реперфузійне пошкодження) model group and the low-dose group (P>0.05; рис. 1C).
Малюнок 1. PA(Пахімінова кислота)полегшує пошкодження нирок після ішемії-реперфузії.(A) BUN і (B) сироватковий креатинін вимірювали у мишей у Sham, IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження), IRI плюс PAL, IRI плюс PAM і IRI плюс групи PAH (40 хв ниркової ішемії з подальшою 24 год реперфузією; n=6/група). (C) Бали за Паллером використовували для класифікації пошкодження ниркових канальців у групах Sham, IRI, IRI плюс PAL, IRI плюс PAM і IRI плюс PAH (n=3/група). (D) Зображення гематоксиліну та еозину нирок мишей у Sham, IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження), IRI плюс PAL, IRI плюс PAM і IRI плюс група PAH. Масштабна шкала, 50 мкм. Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення. * П<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Пахімінова кислота), пахідермової кислоти; BUN, азот сечовини крові; IRI,ішемічно-реперфузійне пошкодження; L, група низьких доз; М, група середньої дози; H, група високої дози.
Наслідки ПА(Пахімінова кислота)про морфологічні зміни в мітохондріях ниркової тканини мишей після ниркової ІРІ(ішемічно-реперфузійне пошкодження). ТЕМ не продемонструвала значущих змін у мітохондріальній структурі ниркової тканини у плацкартній групі. У модельній групі мітохондріальні зміни, пов’язані з фероптозом, такі як зменшення об’єму мітохондрій, збільшення щільності мембрани та зменшення або відсутність мітохондріальних крист, спостерігалися в нирковій тканині (рис. 2A). Порівняно з тими в модельній групі, мітохондрії групи середньої дози в основному демонстрували набряк, а специфічні зміни, характерні для фероптозу, були рідкісними (рис. 2A). Однак у високих дозах ПА(Пахімінова кислота)У групі не спостерігалося характерних змін фероптозу в мітохондріях ниркової тканини, а був лише легкий набряк (рис. 2A). Зміни в мітохондріях у групі низьких доз були такими ж, як і в модельній групі (рис. 2A).
Наслідки ПА(Пахімінова кислота)на експресію GSH і MDA в ІРІ нирок(ішемічно-реперфузійне пошкодження). GSH є необхідним кофактором для функції GPX4. Синтез GSH безпосередньо впливає на активність GPX4. MDA є продуктом окислення ліпідів, який відображає ступінь внутрішньоклітинного перекисного окислення ліпідів і опосередковано відображає виникнення фероптозу (28, 29). Як показано на рис. 2B, тканини нирок мали значно нижчі рівні GSH в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)групу порівняно з групою фіктивних. Серед груп медикаментозного лікування експресія GSH була значно вищою в групах IRI плюс PA та IRI плюс PAn порівняно з IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)модельна група (P<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). І навпаки, як показано на рис. 2C, перекисне окислення ліпідів тканини було більшим (на основі рівнів MDA) в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)групу порівняно з групою фіктивних. Серед груп медикаментозного лікування рівні MDA були значно нижчими в групах IRI плюс PA та IRI плюс PAu порівняно з IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група (П<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
Малюнок 2. PA(Пахімінова кислота)зменшує ферроптоз при ІРІ(ішемічно-реперфузійне пошкодження)- гостре ураження нирок.(A) Зображення трансмісійної електронної мікроскопії в Шем, IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)групи IRI плюс PAL, IRI плюс PAM та IRI плюс PAH (40 хв ниркової ішемії з наступною 24 год реперфузією). Збільшення, х20,000; шкала, 1 мкм. Чорні стрілки вказують на те, що в нирковій тканині спостерігалося зменшення об’єму мітохондрій, збільшення та зменшення щільності мембрани або зникнення мітохондріальних крист. Сині стрілки вказують на мітохондріальний набряк. Оцінювали рівні (B) GSH і (C) MDA в тканинах нирок (n=6/групу). Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення. * П<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група. PA(Пахімінова кислота), пахідермової кислоти; IRI,ішемічно-реперфузійне пошкодження; L, група низьких доз; М, група середньої дози; H, група високої дози; GSH, глутатіон; MDA, малоновий діальдегід.
PA(Пахімінова кислота)регулює експресію білків, пов’язаних із фероптозом, у ниркових ІРІ(ішемічно-реперфузійне пошкодження). У цьому дослідженні рівні експресії пов’язаних із фероптозом білків GPX4, xCT і HO-1 були виявлені за допомогою аналізів вестерн-блот (рис. 3A і B) і RT-qPCR (рис. 3C). Результати показали, що рівні білка GPX4, xCT і HO-1 були значно знижені в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)групу порівняно з фіктивною групою (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Пахімінова кислота)значно збільшив рівень експресії білка та мРНК GPX4, xCT та HO-1 порівняно з IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група (П<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(ішемічно-реперфузійне пошкодження)і низькі дози ПА(Пахімінова кислота) treatment groups (P>0.05; Рис.3B і C).
Малюнок 3. PA(Пахімінова кислота)підвищує рівень експресії білків, пов’язаних із фероптозом, GPX4, xCT і HO‑1.(A) Було проведено вестерн-блоттинг для виявлення рівнів експресії білків, пов’язаних із фероптозом, GPX4, xCT і HO‑1 в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)– миші з гострим ураженням нирок (n=3). (B) Відносне вираження значень сірого для GPX4, xCT і HO‑1. (C) Кількісний ПЛР-аналіз зворотної транскрипції проводили для виявлення рівнів експресії мРНК пов’язаних із фероптозом білків (n=3). Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення. * П<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група. PA(Пахімінова кислота), пахідермічна кислотаd; GPX4, глутатіонпероксидаза 4; xCT, транспортна система глутамату; HO‑1, гемоксигеназа 1; IRI,ішемічно-реперфузійне ушкодженняy; L, група низьких доз; М, група середньої дози; H, група високої дози.
Результати продемонстрували, що рівні білка та мРНК білка перекисного окислення ліпідів, асоційованого з фероптозом, ЦОГ-2, були значно підвищені під час IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)(Рис.4). Лікування середніми та високими дозами ПА(Пахімінова кислота)значно знизив експресію COX-2 порівняно з IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група (П<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(ішемічно-реперфузійне пошкодження)і низькі дози ПА(Пахімінова кислота) treatment groups (P>0.05; рис.4).
Малюнок 4. PA(Пахімінова кислота)знижує рівень експресії білка, пов’язаного з фероптозом, ЦОГ-2.(A) Було проведено вестерн-блоттинг для виявлення рівнів експресії білка-маркера перекисного окислення ліпідів фероптозу, ЦОГ-2, у мишей із гострим ураженням нирок IRI. (B) Відносне вираження сірих значень для COX‑2. (C) Кількісний ПЛР-аналіз зворотної транскрипції проводили для виявлення експресії мРНК ЦОГ-2 (n=3). Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення. * П<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група. PA(Пахімінова кислота), пахідермової кислоти; ЦОГ‑2, циклооксигеназа 2; IRI,ішемічно-реперфузійне пошкодження; L, група низьких доз; М, група середньої дози; H, група високої дози.
PA(Пахімінова кислота)сприяє активації сигнального шляху NRF2 при ІРІ нирок(ішемічно-реперфузійне пошкодження).Дослідити дію ПА(Пахімінова кислота)на сигнальному шляху NRF2 оцінювали рівні білка та мРНК NRF2 (рис. 5). Результати показали, що експресія NRF2 була значно нижчою в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)групу порівняно з групою фіктивних. Крім того, експресія NRF2 була значно вищою в групах IRI плюс PAw і IRI плюс PAH порівняно з IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група (П<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Крім того, лікування ПА(Пахімінова кислота)також підвищувала експресію NRF2 залежно від дози (рис. 5).
Малюнок 5. PA(Пахімінова кислота)активує сигнальний шлях NRF2.(A) Вестерн-блот був проведений для виявлення експресії білка NRF2 в IRI(ішемічно-реперфузійне пошкодження)– гостре ураження нирок мишей. (B) Відносне вираження сірих значень для NRF2 (n=3). (C) Для виявлення експресії мРНК NRF2 (n=3) проводили кількісний ПЛР-аналіз зворотної транскрипції. Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення. *П<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ішемічно-реперфузійне пошкодження)група. PA(Пахімінова кислота), пахідермової кислоти; NRF2, ядерний фактор еритроїдного походження 2, як 2; IRI,ішемічно-реперфузійне пошкодження; L, група низьких доз; М, група середньої дози; H, група високої дози.
