Частина 4: Відображення епігеномної та транскриптомної взаємодії під час формування та пригадування пам’яті в ансамблі енграм гіпокампу
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Натисніть тут, щоб перейти до частини 3
Натисніть тут, щоб перейти до частини 5
РНК-послідовність
ul води, вільної від нуклеази), протягом 30 хв при 37°C з легким погойдуванням. Доповнені фрагменти ДНК ампліфікували та штрихкодували за допомогою реакції ПЛР (1 цикл; 5 хв – 72c, 30 с – 98c, 10 циклів; 15 с – 98c, 30 с – 60c, 3 хв – 72c). Дотримуючись протоколу виробника, ампліфіковану ДНК очищали та очищали за допомогою 1,8x кульок AMPure (кульки AmpureXP, Beckman Coulter, A63880). Після контролю якості біоаналізатора для визначення розміру та розподілу бібліотеки, бібліотеки секвенували на платформі Illumina Nextseq 550 у Центрі MIT BioMicro.
Цистанхе і цистанчі для поліпшення пам'яті
Аналіз ATAC-seq. Необроблені дані fastq 40-зчитування секвенування парних кінців п.н. були вирівняні з еталонним геномом mm9 миші за допомогою Bowtie 2.0 у режимі парних кінців50. Колекція Samtools51 використовувалася для сортування, видалення дублікатів ПЛР (rmdup), індексування файлів BAM (індекс) і обчислення статистики бібліотеки (флагстат, див. Додаткову таблицю 13). Файли BAM були зменшені з правильно вирівняних, парних і унікальних читань до 50M. Відкриті піки хроматину аналізували за допомогою програмного забезпечення MACS252. Диференціально доступні області (DAR) ідентифікували за допомогою Diffbind v1.16.353 із параметрами за замовчуванням і налаштуваннями для використання DESeq2 (відсічення; FDR < 0,01;="" кратні="" зміни=""> 1,5). Повну матрицю нормалізованих підрахунків (RPKM54) було отримано пакетом DiffBind. Для покоління великих треків файли сигналів нагромадження (нагромадження фрагментів на мільйон читань) у форматі біографії були створені за допомогою функції піку виклику MACS2 з прапорцями -B –SPMR. Потім було створено нормалізоване кратне збагачення (FE) над вхідними лямбда-доріжками за допомогою функції bdgcmp MACS2 із налаштуванням - m FE. Потім файли bedGraph були перетворені у формат bigwig.
Для візуалізації великих файлів використовувалися інструменти IGV55. ChromHMM56 використовувався для встановлення моделі стану хроматину з двох незалежних досліджень, у яких використовувалась маса тканини гіпокампу до та після удару стопи21,22, а також для визначення кратного збагачення DAR порівняно з моделлю стану. Аналіз збагачення мотивів57,58 та анотацію піків виконували інструментами HOMER59. Усі коди доступні у файлі додаткового програмного забезпечення. Екстракція РНК і підготовка бібліотеки — одразу після фіксації та сортування (див. підготовку тканини), 4 мкл протеази було додано до буфера для травлення (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Life Technologies, AM1975) . Зразки інкубували в теплових блоках протягом 15 хвилин при 50 градусах, потім 15 хвилин при 80 градусах. Потім до кожного зразка додавали 0,75 мл Trizol LS (реагент TRIzol™ LS, Thermo Fisher Scientific, 10296028) і 0,2 мл розчину фенол: хлороформ (фенол: хлороформ: ізоаміловий спирт, 1 фаза, VWR International, K169). інтенсивне струшування протягом 5 хв при кімнатній температурі (RT). Суспензію поміщали у важкі пробірки Phase lock gel (PLG, 5 Prime, 2302830) і обертали при 13000об/хв протягом 5 хв. Водну фазу з нуклеїновими кислотами екстрагували з пробірок у свіжу пробірку Епендорфа рівною кількістю 100% етанолу. Очищення РНК проводили за допомогою набору Direct-zol™ RNA MicroPrep (Zymo Research, R2060) для очищення РНК, згідно з інструкцією виробника. РНК елюювали (10 мкл, DEPC) і потім зберігали при -80 градусах. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) використовувався для підготовки та ампліфікації бібліотеки. Для підготовки бібліотеки використовували 3 біологічні повтори (N=3). Бібліотеки готували згідно з інструкціями виробника без додаткової стадії фрагментації (FFPE, варіант 2, див. інструкцію), з виснаженням рибосомальної кДНК і остаточною ПЛР-ампліфікацією (15 циклів). Бібліотеки були секвеновані на платформі Illumina HiSeq 2000 в MIT BioMicro Center.
Аналіз RNA-seq — необроблені дані fastq були узгоджені з еталонним mm9 миші
генома за допомогою Bowtie 2.0. Картовані зчитування з тіл генів (включаючи зчитування екзонів і інтронів) були оброблені Cufflinks 2.260 і DEseq261 з анотацією еталонного гена UCSC mm9 для оцінки кількості транскриптів. Диференціальну експресію генів і подальший аналіз проводили з використанням DEseq2 і спеціальних R-скриптів. Відносну кількість транскриптів вимірювали фрагментами на килобазу екзону на мільйон картованих фрагментів (FPKM).
Для аналізу транскрипційних програм експресію кожного гена оцінювали по-різномупам'ятьфази (Активована - рання, Активована - пізня, Реактивована) за їх кратною зміною log2 (log2FC) від основного стану. 1095 диференціально експресованих генів (DEG) пройшли критерії відсікання, в яких ми спостерігали принаймні в одному порівнянні P-значення< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Цистанхе може покращити пам'ять
Захоплення конформації хромосоми (Hi-C)
Ядра з фіксованих клітин (див. Підготовку тканини) сортували в 1,5 мл пробірки Eppendorf, що містили 500 мкл свіжого крижаного буфера для лізису (10мМ Tris pH=8, 10мМ NaCl, 0,2% Igepal CA{{ 9}}, вода класу Pi та ПЛР) і заморожували на сухому льоду та зберігали при -80C до використання. Бібліотеки Hi-C готували зі 100 000 клітин/на групу (зібраних у двох тварин) у двох біологічних повторах, використовуючи інструкцію з набору Dovetail™ Hi-C (версія 1.03, Dovetail Genomics, Чикаго, США). Шість бібліотек Hi-C секвенували (парний кінець) на платформі Illumina Nextseq 500. Конвеєр HOMER Hi-C використовувався для фільтрації експериментальних артефактів, таких як циркулярізація, самолігування та ПЛР-дублікати. Відфільтровані зчитування були вирівняні з еталонним геномом миші (mm9) і далі оброблені за допомогою конвеєра HOMER HI-C.
Інструменти Hi-C від HOMER були використані для виконання аналізу головних компонентів (PCA) даних Hi-C для ідентифікації субядерних компартментів (A і B) з роздільною здатністю 50 Кб (див. додаткове програмне забезпечення). Для аналізу перемикача відсіку ми спочатку відняли значення PC1 між групами. Далі ми визначили найвищі переходи BtoA як регіони зі зміною PC1 вище 90-го процентиля, а найвищі переходи AtoB як регіони зі зміною PC1 нижче 10-го процентиля. Оскільки суб’ядерні відсіки регулюються як одиниці в кілька сотень кілобаз, ми консолідували послідовні сегменти AtoB або BtoA по 50 Кб, які перебували на відстані 100 Кб один від одного. Консолідовані домени, загальний розмір яких був менше 200 Кб, ми відхилили. Перемикач відсіку розглядався, лише якщо від’ємне значення було перетворено на додатне (і навпаки). Нарешті, позитивні та негативні значення першого компонента порівнювали між усіма трьома популяціями нейронів (базальним, активованим - раннім та активованим - пізнім).
Промоутер захоплення Hi-C
Після фіксації та сортування (див. підготовку тканини) клітини сортували в пробірки Eppendorf об’ємом 1,5 мл, що містили 500 мкл свіжого охолодженого буфера для лізису (10мМ Tris pH=8, 10мМ NaCl, 0,2% Igepal CA{ {9}}, Pi та PCR grade water), заморожені на сухому льоду та зберігаються при –80C до використання. Бібліотеки Hi-C готували з 10 000 клітин на групу (N=3–4), як описано раніше62, з деякими модифікаціями. Зразки центрифугували (4 градуси, 1600 г протягом 20 хв), а осад ресуспендували в 400 мкл 1,2-кратного буфера Cutsmart (New England Biolabs,
США). Перше рестрикційне розщеплення проводили, як описано в оригінальному протоколі, з 1500 U HindIII (R3104L, New England Biolabs, США), як 6-основного різака (замість BglII у оригінальному протоколі). Після мічення біотином і лігування протягом ночі (подробиці див. оригінальний протокол) зразки центрифугували (4 градуси, 1600 × g протягом 15 хвилин), а осад ресуспендували в 25 мкл PBS. Суспензію інкубували при 65°C з 3 мкл протеїнази К протягом 12–16 годин. Очищення ДНК Hi-C проводили, як описано в оригінальному протоколі, з використанням 100 мкл кульок стрептавідину (Dynabeads M-280–стрептавідін, Life Technologies, 11205D). Для другого ферменту рестрикції ми використовували 4-базовий куттер Hpych4V (10 од./на зразок, R0620S, New England Biolabs, США). Після реакції A-tailing (подробиці див. оригінальний протокол) зразки ампліфікували за допомогою ПЛР (17 циклів) і очищали кульками AMPure XP. Бібліотеки Hi-C елюювали 20 мкл 10 мМ трис-HCl (pH 8,5). Конструкція системи захоплення приманки для Promoter Capture Hi-C – список із 5000 промоторів генів миші було отримано з раніше опублікованого протоколу в Schoenfelder. Та ін.29. Список містить лише транскрипти з біотипом ділянок, що кодують білок, із сайтами фрагментів рестрикції HindIII. Було розроблено два зонди захоплення 120 bp, по одному на кожному кінці фрагмента. Зонди були синтезовані компанією Agilent Technologies за системою збагачення мішеней SureSelect (Agilent Technologies).
Підготовка та секвенування Hi-C бібліотеки захоплення промотора – Для захоплення продуктів лігування Hi-C, що містять послідовності промотора, ми використовували раніше опублікований протокол29. Коротко, блокатори гібридизації (Agilent Technologies) були додані до бібліотек Hi-C ДНК. Буфер для гібридизації та РНК захоплення приманки готували відповідно до інструкцій виробника (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Далі бібліотеку Hi-C ДНК/блокатори гібридизації нагрівали протягом 5 хвилин при 95 градусах, перш ніж знизити температуру до 65 градусів. ДНК бібліотеки Hi-C змішували з буфером для гібридизації (попередньо нагрітим протягом 5 хвилин до 65 градусів), а потім із спеціально розробленою системою приманки для захоплення (попередньо нагрітою протягом 3 хвилин до 65 градусів), що складається з 10 000 біотинільованих РНК, націлені на кінці фрагментів рестрикції HindIII 5000 промоторів генів миші (Agilent Technologies, див. Додатковий матеріал для розробки приманки для захоплення). Через 24 години при температурі 65 градусів у ПЛР-апараті було проведено скидання біотину (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) і промивання відповідно до протоколу збагачення SureSelect Target (Agilent Technologies). Після останнього промивання кульки ресуспендували в 30 мкл NEBuffer 2 без попереднього елюювання ДНК і проводили ПЛР після захоплення (чотири цикли ампліфікації з використанням універсальних праймерів illumine) на ДНК, зв’язаній з кульками через біотинільовану РНК. Бібліотеки Capture Hi-C були парно секвеновані (Nextseq 500, Illumina).
Hi-C-аналіз захоплення промоутером – конвеєр HiCUP63 використовувався для обробки необроблених зчитувань послідовності fastq. Цей конвеєр використовувався для картографування пар зчитування з геномом миші (mm9), для фільтрації експериментальних артефактів (таких як циклічні зчитування та повторні лігування) і для видалення повторюваних зчитувань. Для даних pc-HiC отримані BAM-файли були зменшені та оброблені за допомогою CHiCAGO версії 1.2.064 із дотриманням налаштувань за замовчуванням для виклику значних взаємодій. Повну інформацію про цей конвеєр можна отримати від Babraham Bioinformatics
Цистанхе може покращити пам'ять
Ін'єкція стереотаксичного аденоасоційованого вірусу
Мишей ArcCreERT2 анестезували авертином і інфузією вірусу AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (серотип 5, отриманий з ядра вірусу UNC). Спочатку в черепі над дорсальним гіпокампом зробили маленький отвір (відносно Брегми: передньо-задній −2.0 і медіолатеральний ± 1,5), опустили шприц Гамільтона з 33-голкою калібру до -1,8 DV і 500 ηl вірусу вводили зі швидкістю потоку 50 ηl за хвилину в обидва гіпокампи. Голку видаляли через 10 хвилин після ін'єкції, і мишам давали відновитися протягом 4 днів.
