для отримання додаткової інформації:ali.ma@wecistanche.com

Обговорення

Молекулярні основи формування енграми викликають великий інтерес. Тут ми використовуємо модель миші TRAP, щоб з’ясувати динаміку доступності хроматину, геномної архітектури 3-D та експресії генів протягом життя клітини інграми. По-перше, ми прямо показуємо цепам'ятькодування має величезний і тривалий вплив на доступність хроматину. Як тільки цей стан хроматину встановлено, наступні події, такі якпам'ятьконсолідація та відкликання, здається, мають незначний вплив на ландшафт хроматину. Цілком можливо, що вибраний момент часу для відкликання може не повністю охопити події хроматину реактивованих клітин, і подальші зміни хроматину можуть бути пов’язані зпам'ятьповторна консолідація або зникнення8. Важливо, що згідно з попередніми публікаціями12, 13,23 наші дані свідчать про цепам'ятьформування в основному є явищем, керованим енхансером.

Натисніть на Cistanche UK для пам'яті

По-друге, наше дослідження надає перший комплексний ландшафт архітектури 3D-генома на різних етапахпам'ятьформування, оскільки ми показали повторну локалізацію великих сегментів хроматину та специфічні динамічні взаємодії промотор-енхансер у цих компартментах, що дозволяє тонко налаштовувати різні транскрипційні програми. Крім того, ми показуємо, що промотори генів зі зниженою регуляцією частіше взаємодіють з енхансерами, які містять репресори транскрипції, і навпаки.

Нарешті, наша робота надає перші докази функціональної події праймінгу, яка характеризується початковим збільшенням доступності енхансера під час кодування, без очікуваних транскрипційних змін. Наш аналіз показав, що при реактивації нейрони енграми використовують підмножину взаємодій деновопромотер-енхансер, де праймовані енхансери вступають у контакт з відповідними промоторами для посилення регуляції генів, залучених до транспорту мРНК і локальної трансляції білка в синаптичних компартментах. Ці зміни відповідали очікуваним морфологічним і функціональним змінам. У сукупності виявляється, що клітини енграми позначені на епігенетичному рівні, а взаємодія між доступністю хроматину, архітектурою 3D-генома та взаємодією промотор-енхансер описує добре скоординовану систему, яка призводить до відстроченого сплеску транскрипції під час реактивації енграми.

Як і в будь-якій іншій роботі, у дослідження було кілька обмежень. Використання тамоксифен-залежних мишей TRAP дозволяє досягти тимчасового дозволу, але відкриває вікно мічення приблизно на 12 годин, що може призвести до неспецифічного мічення нейронів, які не є частиною досвіду CFC. Крім того, як було запропоновано раніше37, нейрони, позначені дугою, можуть бути неоднорідними і включати різні ансамблі, які регулюють якпам'ятьрозрізнення та узагальнення. Крім того, будь-який момент часу до 1,5–2 годин (раніше) буде недостатнім для захоплення транскрипційних і трансляційних подій, спричинених рекомбінацією ДНК, тобто експресії рекомбінази Cre та остаточної експресії гена eYFP5. Таким чином, ми вважаємо, що багато ранніх перехідних кластерів DEG були пропущені, оскільки раніше було показано, що багато IEG повертаються до вихідного рівня через 2 години (крім Arc46). Нарешті, хоча наше дослідження було зосереджено на гіпокампі, структурна та синаптична пластичність була пов’язана з тривалим зберіганням інформації в інших областях мозку, таких як префронтальна кора, мигдалина2. Майбутні дослідження мають визначити, чи можуть ці епігенетичні зміни являти собою глобальний критичний процес, пов’язаний із довгостроковим формуванням і збереженням спогадів, чи це унікально для контурів гіпокампу.

методи

Миші та поведінка

Як описано раніше6, мишей ArcCreERT2(plus) розвели з гомозиготною лінією R26R-STOP-floxed-жовтий флуоресцентний білок (eYFP). ~140 наступних нащадків чоловічої статі були генотиповані за допомогою протоколу генотипування лабораторії Джексона. Мишей містили по чотири-п’ять на клітку в 12-годинному (06:00–18:00) світло-темному приміщенні колонії при 22 градусах і вологості 40–60 відсотків. Їжу та воду надавали ad libitum. Поведінкове тестування проводилося під час світлової фази. За 1 годину до поведінкового тесту миші отримали одну дозу 4-гідрокситамоксифену (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), що відкриває ~12-годинне вікно мічення5. Щоб звести до мінімуму неспецифічну мітку eYFP, за день до поведінкового завдання (наприклад, CFC) мишей окремо помістили в 24-годинну темну/темну кімнату. Крім того, щоб знизити рівень тривоги, до клітки додали трубу для укриття та гніздування. На наступний день мишам вводили TAM за 1 годину до CFC. Після виконання поведінкового завдання мишей або піддавали евтаназії через 1,5–2 години, а мозок збирали. або поміщають назад у темну кімнату на наступні 48 год. Після того як мишей вивели з темряви, їх повернули до нормального 12-годинного (06:00–18:00) циклу світло-темрява в тій самій кімнаті. Через 3 дні (загалом через 5 днів після CFC) половину когорти мишей піддали евтаназії та зібрали мозок, тоді як іншу половину повернули до кімнати для тестування, де вони були піддані сигналу, що викликає страх (тон і контекст). . Усі роботи з мишами були схвалені Комітетом із догляду за тваринами Відділу порівняльної медицини Массачусетського технологічного інституту. Cistanche може покращитисяпам'ять.

Цистанхе може покращити пам'ять

Контекстуальне обумовлення страху

Апарат контекстного формування страху (CFC) і програма збору були від TSE-Systems. Мишей вводили в камеру CFC, після 3 хвилин початкового звикання тон 3 кілоГц з інтенсивністю 80 ДБ подавався протягом 30 секунд і був припинений ударом ноги 0,7 мА протягом 1 секунди. Між експериментами для очищення клітин використовували 70-відсотковий ізопропанол. Через 5 днів мишей вводили в початковий кондиціонований контекст у поєднанні з тонусом, і рівні заморожування вимірювали протягом 3 хвилин (параметри програмного забезпечення TSE за замовчуванням, що використовуються для моніторингу поведінки заморожування), щоб оцінити контекстпам'ять. Контекст B був модифікованим контекстом A. Рейки з нержавіючої сталі були покриті білою пластиковою вставкою, зовнішні стінки камер були покриті фігурами клейкої стрічки, щоб змінити зовнішній вигляд камери. Камера була ароматизована ваніллю, освітлення в кімнаті було набагато яскравішим, і мишей транспортували до пристрою в іншому візку, ніж у контексті А.

наркотики

Рекомбінацію у трансгенних мишей ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP індукували за допомогою 4-гідрокситамоксифену (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-OHT розчиняли в 2,5 мл EtOH/100 відсотків і струшували на шейкері протягом 30 хв. Потім додавали 5 мл кукурудзяної олії та струшували на шейкері протягом 1 години. Нарешті, пробірки помістили на 30 хвилин при 60 градусах, щоб забезпечити повне випаровування EtOH. Одноразову ін'єкцію 50 мг/кг вводили внутрішньоочеревинно (ip).

Імуногістохімія (IHC)

Мишей транскардіально перфузували 25 мл охолодженого фосфатно-сольового буферного розчину (PBS), а потім 40 мл 4% параформальдегіду в PBS. Мозок видаляли і фіксували в 4% PFA протягом ночі при 4 градусах і переносили в PBS до розділення. Мозок встановлювали на столик вібратома (Leica VT1000S) за допомогою суперклею та розрізали зрізами товщиною 40 мкм. Зрізи промивали PBS і блокували за допомогою 1% бичачого сироваткового альбуміну (BSA), приготованого в PBS, що містить 0,1% Triton-X100 (PBST), протягом 2 годин при кімнатній температурі. Блокуючий буфер відсмоктували, а зрізи інкубували з відповідним первинним антитілом (додаткова таблиця 11) протягом ночі при 4 градусах на шейкері. Потім зрізи промивали три рази по 15 хвилин блокуючим буфером, а потім інкубували з кон’югованими вторинними антитілами Alexa Fluor 488, 594 або 647 протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після трьох промивань по 15 хвилин блокуючим буфером і однієї остаточної промивки PBS протягом 10 хвилин зрізи монтували за допомогою fluromount-G (Electron microscopic Sciences). Cistanche може покращитисяпам'ять.

Гібридизація in situ (RNAscope®)

Зразки були підготовлені на основі інструкцій виробника для мультиплексного флуоресцентного аналізу RNAscope® v2 (Advanced cell diagnostics, США), з деякими модифікаціями та в поєднанні з протоколом Immunohistochemistry (IHC). Спочатку зразки пофарбували на наявність первинних (Arc і GFP) і вторинних (Alexa Fluor 488 і 594 відповідно) антитіл (як описано в протоколі IHC вище). Зрізи мозку помістили на предметне скло і

зневоднюють протягом 30 хв при кімнатній температурі. Потім навколо кожного зрізу було нанесено бар’єр за допомогою гідрофобної ручки Immedge™, а зразки обробляли перекисом водню RNAscope® протягом 10 хвилин при кімнатній температурі (вилучення мішені та обробка протеазою не застосовувалися). Відповідно до інструкцій виробника зрізи піддавали гібридизації зонда (RNAscope® Probe-Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), ампліфікації та розвитку сигналу HRP-C1 за допомогою каналу TSA® Plus Cyanine 5. Цистанхе може покращити пам'ять.

Аналіз зображення

Зображення отримували за допомогою конфокальних мікроскопів LSM 710 або LSM 880 (Zeiss) з об’єктивами 10×, 20×, 40× або 63× при однакових налаштуваннях для всіх умов. Зображення кількісно оцінювали за допомогою ImageJ 1.42q або Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Цюріх, Швейцарія). Для кожної експериментальної умови для кількісного визначення використовували п'ять корональних зрізів принаймні п'яти тварин. Цистанхе може покращити пам'ять.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6 мкМ), щоб видалити неспецифічне маркування, кількісне визначення подвійних позитивних клітин проводилося в CA1, CA3 і DG. Цистанхе може покращити пам'ять.

Кількісне визначення білків Eif і Gria1/мРНК. Модуль поверхонь використовувався для виявлення та 3D-візуалізації аксонів нейронів на основі сигналу GFP. Потім було підраховано позитивні точки EiF2a, Eif4E, Eif3E та Gria1 - за допомогою модуля плям. Нарешті, був запущений модуль Spots Close-To-Surface Xtension, щоб знайти підмножину плям, які знаходяться ближче до поверхневих об’єктів, ніж визначений поріг 1 мкм, і виключити плями, які виходять за межі цього діапазону.

Морфологія хребта — хребти були класифіковані на три типи на основі довжини хребта (L), діаметра голови (Dh) і діаметра шиї (Dn). Короткі шипи – Dn=L, Тонкі шипи – L > Dn і Dh Більше або дорівнює Dn, Грибоподібні шипи – Dh Більше або дорівнює 2Dn, Збільшені грибоподібні шипи – Dh Більше або дорівнює 2Dn.Cistanche може покращити пам'ять.

Цистанхе може покращити пам'ять

Підготовка тканини

Тканина гіпокампу була вилучена та швидко заморожена. Після екстракції зразки негайно гомогенізували в {{0}}.5 мл крижаного PBS з інгібіторами протеази (Pi) (11836170001, Roche ). Щоб максимально пом’якшити вплив сортування, тільки в експериментах NC-RNAseq і capture-HiC суспензію фіксували 1 відсотком (для NC-RNAseq/HiC) або 2 відсотками (pc-HiC) параформальдегідом протягом 10 хвилин, погасивши з гліцином 2,5 М протягом 5 хвилин і двічі промивали 5 мл PBS. Цей процес зберігає ландшафт транскрипції та хроматину та мінімізує зміщення сортування. Для ATACseq, RNAseq і capture-HiC суспензію центрифугували при 1200 g, 4 градуси протягом 5 хвилин, а осад ресуспендували в 5 мл гіпотонічного буфера NF-1 (0,5% Triton X-100/ 0,1М сахарози/5мМ MgCl2/1мМ EDTA/10мМ Трис-HCl, pH 8,0, Pi). Далі суспензію гомогенізували (товкачик A) 30 ударами, а товкач промивали додатковими 5 мл NF-1 буфера для загального об’єму 10 мл. Усю суспензію збирали в конічну пробірку на 15 мл, фільтрували за допомогою сітчастого фільтра 70 мкм (08–771-2, Falcon) та інкубували на льоду протягом 30 хв. Осади ядер (усі центрифуги були 4 градуси, 1600 × g протягом 15 хвилин) ресуспендували в 10 мл PBS плюс 1 відсоток BSA плюс Pi та інкубували на льоду протягом 1 години. Ядра центрифугували, а осад ресуспендували в 1 мл PBST плюс 1 відсоток BSA плюс Pi та інкубували з первинними антитілами NeuN, Arc і GFP протягом ночі при 4 градусах. Незв’язані антитіла двічі промивали 5 мл PBS і, нарешті, ресуспендували в 1 мл PBS плюс 1 відсоток BSA плюс Pi і вторинні антитіла протягом 2–4 год при 4°. Після двох промивань ядра ресуспендували в 0,5 мл (PBS плюс 1 відсоток BSA плюс Pi) і фільтрували за допомогою сітчастого фільтра 40 мкм для сортування FACS. 4′,6-Діамідин-2′-феніліндолу дигідрохлорид (DAPI) додавали безпосередньо в пробірки FACS (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche може покращитисяпам'ять.

Проточна цитометрія

Для проточної цитометрії ядра спочатку стробували з використанням параметрів площі імпульсу прямого та бічного розсіювання (FSC-A та SSC-A), за винятком уламків, з подальшим виключенням агрегатів за допомогою ширини імпульсу (FSC-W та SSC-W). Потім було використано контрольне фарбування ізотипу для встановлення воріт NEUN plus, ARC plus і GFP plus. Щоб забезпечити однорідну нейрональну популяцію, популяцію NeuN plus було закрито перед стробованими популяціями на основі флуоресценції ARC plus і GFP plus. Ми відсортували чотири різні популяції з трьох різних часових точок; Приблизно через 1,5–2 години після впливу FS i) NeuN plus /GFP plus ii) NeuN plus /GFP-. Через п'ять днів, за відсутності пошуку, ми зібрали iii) NeuN plus /GFP plus. В іншій когорті мишей повторно піддали умовному подразнику. Через 1,5–2 години після повторної експозиції ми зібрали iv) NeuN plus /ARC plus /GFP plus. Усі ядра були відсортовані в 1,5 мл пробірки Епендорфа, що містять; 500 мкл PBS плюс 1 відсоток BSA плюс Pi для ATCAseq, 200 мкл буфера для травлення (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Cat. AM1975, Invitrogen) для RNAseq, 500 мкл свіжого охолодженого лізису буфер (10 мМ Tris pH=8, 10мМ NaCl, 0,2% Igepal CA-630, Pi та вода класу ПЛР) для Hi-C/capture-HiC. Аналіз даних проводився за допомогою Flowjo (v10).

ЧІП-кПЛР

Одразу після наступного сортування 10 000 клітин осадили при 4 градусах, 1600 × g протягом 15 хвилин і ресуспендували в буфері для лізису SDS. ChIP проводився відповідно до інструкцій виробника для набору ChIP-IT High Sensitivity® (HS) (№ за каталогом 53040, Active Motif, США) з використанням анти-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) і анти-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100) антитіла. Аналіз ChIP проводили в ПЛР-блокі Bio-Rad CFX96 connect у реальному часі з використанням суміші реагентів SsoFast™ EvaGreen® qPCR (Bio-Rad, 172–5202). Зразки аналізували в трьох примірниках і результати нормалізували до вхідних даних. Послідовності пар праймерів для аналізів ChIP–qPCR наведено в Додатковій таблиці 12.

Цистанхе може покращити пам'ять

ATAC-seq

підготовка бібліотек—Бібліотеки ATAC seq були підготовлені, як описано раніше в 49 з незначними модифікаціями. 10,000 клітини з кожної групи були взяті з 8–10 різних мишей і вважалися N=1. Для підготовки бібліотеки використовували 3–4 біологічні повтори (N=3–4). Відразу після наступного сортування клітини центрифугували (4 градуси, 1600 × g протягом 15 хвилин) і ресуспендували у свіжому 50 мкл холодного буфера для лізису (0,15 відсотка NP-40 замість Igpal) і погойдували на льоду протягом 10 хвилин . Далі була проведена реакція сегментації (набір для підготовки зразків ДНК Nextera 24 реакції, FC-121–1030, Illumina) в об’ємі 25 мкл (12,5 мкл TD, 1,25 мкл TDE1, 11,25 мкл води, вільної від нуклеази), протягом 30 хв при 37c з легким погойдуванням. Доповнені фрагменти ДНК ампліфікували та штрихкодували за допомогою реакції ПЛР (1 цикл; 5 хв – 72c, 30 с – 98c, 10 циклів; 15 с – 98c, 30 с – 60c, 3 хв – 72c). Дотримуючись протоколу виробника, ампліфіковану ДНК очищали та очищали за допомогою 1,8x кульок AMPure (кульки AmpureXP, Beckman Coulter, A63880). Після контролю якості біоаналізатора для визначення розміру та розподілу бібліотеки, бібліотеки секвенували на платформі Illumina Nextseq 550 у Центрі MIT BioMicro. Цистанхе може покращити пам'ять.

Аналіз ATAC-seq. Необроблені дані fastq 40-зчитування секвенування парних кінців п.н. були вирівняні з еталонним геномом mm9 миші за допомогою Bowtie 2.0 у режимі парних кінців50. Колекція Samtools51 була використана для сортування, видалення дублікатів ПЛР (червоним угорі), індексування файлів BAM (індекс) та обчислення статистики бібліотеки (флагстат, див. Додаткову таблицю 13). Файли BAM було зменшено з правильно вирівняних, парних і унікальних зчитувань до 50 млн. Відкриті піки хроматину аналізували за допомогою програмного забезпечення MACS252. Диференціально доступні області (DAR) ідентифікували за допомогою Diffbind v1.16.353 із параметрами за замовчуванням і налаштуваннями для використання DESeq2 (відсічення; FDR < 0,01;="" кратні="" зміни=""> 1,5). Повну матрицю нормалізованих підрахунків (RPKM54) було отримано пакетом DiffBind. Для покоління великих треків файли сигналів нагромадження (нагромадження фрагментів на мільйон читань) у форматі біографії були створені за допомогою функції піку виклику MACS2 з прапорцями -B –SPMR. Потім було створено нормалізоване кратне збагачення (FE) над вхідними лямбда-доріжками за допомогою функції bdgcmp MACS2 із налаштуванням - m FE. Потім файли bedGraph були перетворені у формат bigwig. Cistanche може покращити пам'ять

Для візуалізації великих файлів використовувалися інструменти IGV55. ChromHMM56 використовувався для встановлення моделі стану хроматину на основі двох незалежних досліджень, у яких використовувалась маса тканини гіпокампу до та після удару стопи21,22, а також для визначення пропозицій збагачення кратності порівняно з моделлю стану. Аналіз збагачення мотивів57,58 та анотацію піків виконувалися інструментами HOMER59. Усі коди доступні у файлі додаткового програмного забезпечення