Частина 2: ехінакозид індукує смерть апоптотичних ракових клітин шляхом інгібування нуклеотидного пулу, що дезінфікує фермент MTh1

ехінакозид індукує апоптотичну загибель ракових клітин, пригнічуючи нуклеотидний пул, дезінфікуючий фермент MTh1

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche ехінакозидМаєпротиракові засоби,іантиапоптотичні засобиЕфекти

Pls Натисніть тут до частини 3

Pls Натисніть тут до частини 1

Результатів

Ідентифікація ехінакозиду як інгібітора MTh 1

Для пошуку природних сполук, здатних інгібувати MTH1, ми використовували ферментативну реакцію MTH1-каталізованої як високу пропускну здатність у скринінговому аналізі vitro. Крім окислених нуклеотидів пурину, MTH1 також може гідролізувати нормальний дезоксигуанозинтрифосфат для отримання дезоксигуанозинмонофосфату і пірофосфату. У присутності надлишкової неорганічної пірофосфатази всі пірофосфати перетворюються в неорганічні фосфати, які можна кількісно оцінити за допомогою аналізу абсорбції на основі малахіту зеленого,41, що дозволяє проводити непряме вимірювання активності MTH1.32 Щоб перевірити пробірну систему, ми спочатку виміряли ефект(S)-кризотинібу, сполуки з доведеною потенцією як інгібітора MTH1.33 Результат показав, що (S)-кризотиніб дійсно сильно інгібуєтьсяMTH1 (рисунок 1A) з IC50 of500 nM, що було в сім разів вище, ніж повідомлялося Хубером та ін (72 нМ).33 Це, ймовірно, було пов'язано з відмінностями в методах виявлення або джерелах хімічних речовин і ферментів. Ми застосували менш чутливий хромогенний підхід, тоді як Хубер та інші використовували високочутливий біолюмінесцентний метод.33 Пам'ятаючи про це, ми відсівали 12 комерційно доступних природних сполук (таблиця S1), кожна з яких є основним інгредієнтом традиційних трав з потенційною протипухлинною активністю.Ехінакозид, з'єднання, очищене від паразитичної лікарської рослини Cistanche salsa (рис. 1С), значно пригнічувало реакцію (рис. 1В), з IC50 7.01±2.13 мкМ (рис. 1Д). Додавання в 50 разів більше піро- фосфатази не вплинуло на результат, при додаванні в п'ять разів більше МТХ1протеїну значно знизило ступінь інгібування, припускаючи, щоЕхінакозидспеціально гальмується активністьMTH1 в ферментативному аналізі in vitro.

Ехінакозид інгібував клітинний MTh 1 для збільшення внутрішньоклітинного 8-оксога

Далі ми запитали, чиЕхінакозидможе пригнічувати внутрішньоклітинну активність MTH1. Інгібування клітинного MTH1 призведе до збільшення внутрішньоклітинних 8-оксоГ. Було показано, що Авідін зв'язується з 8-оксоГ з високою специфічністю;42 тому ми використовували імунофлюоресцентне фарбування з Cy3-кон'югованим авидином для порівняння внутрішньоклітинних рівнів 8-оксог в різних ракових клітинних лініях до і післяЕхінакозидЛікування. Остеосаркома МГ-63 людини, СК-ГЕП-1гепатокарцинома, МКФ-7 рак молочної залози та клітини раку SW480 лікувалися 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ або 80 мкМ Ехінакозидом протягом 5 годин, 12 годин або 24 годин. Фарбування за допомогою Cy3-кон'югованого авідину показало, що лікування ехінакозидом 60 мкМ протягом 24 годин чітко і значно підвищило рівень клітинних 8-оксоГ (реактивної речовини Cy3-avidin) в цих ракових клітинах (рис. 2А і В). Більш висока концентрація (80 мкМ)Ехінакозидпризвело до більш сильного клітинного фарбування 8-оксоГ (рис. 2В), що свідчить про зв'язок доза-відповідь. Аналогічні результати були отримані

шляхом імунофлюоресцентного фарбування мишачим моноклональним анти-8-оксоГ антитілом (рис. S1A).43 КонцентраціяЕхінакозид(60 мкМ), необхідних для значного збільшення клітинного 8-оксог, було набагато вище, ніж IC50 (7,01 мкМ) від аналізу in vitro. Ймовірно, це було пов'язано з різницею в чутливості двох аналізів. Імунофлюоресцентне фарбування набагато менш чутливе, ніж ферментативний аналіз in vitro; крім того, на кількість молекул-інгібіторів, які можуть досягати і взаємодіяти з клітинними MTH1, впливають складні біологічні процеси; крім того, в аналізі in vitro в якості субстрату використовується менш улюблений dGTP, а отже, може бути легше (взяти менше інгібіторів) для інгібування MTH1, що призводить до зниження IC50 в аналізі in vitro.

УпротипухлиннийіАнтиоксидантнаслідкиехінакозидвідCistancheдезертикула

Клітинний 8-оксог генерується АФК, який антагонізується антиоксидантами. Таким чином, збільшення клітинного АФК або придушення активності антиоксидантів також призведе до підвищення рівня клітин 8-оксог.Ехінакозидсам по собі є потужним антиоксидантом44,45 і, таким чином, повинен посилювати, а не пригнічувати активність антиоксидантів. Щоб перевірити, чи був змінений рівень клітинного ROSЕхінакозидлікування, ті ж ракові клітини оброблялися 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ або 80 мкМ Ехінакозидом протягом 5 годин, 12 годин або 24 годин, а потім аналізувалися проточною цитометрією після фарбування флуоресцентним зондом 2′,7′-дихлорфлуоресцеїновим діацетатом. Результати показали, що жодне з цих методів лікування не змінило рівня клітинної АФК (рис. 2С і D). Таким чином, підвищений рівень клітин 8-оксог, швидше за все, був результатом інгібування MTH1 ехінакозидом.

ехінакозидспричинив великі пошкодження ДНК саме в ракових клітинах Включення 8-оксогів в ДНК буде стимулювати БЕР і ММР, які генерують одноланцюгові розриви ДНК (SSB) і розриви.16,17 Зазвичай ці розриви, і зазори заклеюються механізмами відновлення, що включають заповнення прогалин і лігування ДНК-полімеразами і лігазами.46,47 Однак швидке збільшення клітинної ССБ може насичувати клітинну ремонтну здатність, призводять до утворення численних дволанцюгових розривів ДНК (DSB)18 і сигналізації DDR. Дослідити, чиЕхінакозид-індуковане збільшення клітинного 8-оксогу викликало пошкодження ДНК, ми дослідили один з ранніх маркерів пошкодження ДНК, 53BP1, який зв'язується з ділянкамиDSB як найбільш ранньої клітинної відповіді на DSB.48 MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 і SW480 ракові клітинні лінії і неракові клітинні лінії людини нормальна печінка L-O2,49 ембріональна нирка людини HEK 293, а фібробласт миші NIH/3T3 лікувалися 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ або 80 мкМ Ехінакозид протягом 5 годин, 12 годин або 24 годин. Флуоресцентний імуностабілізуючий аналіз показав, що лікування ехінакозидом 60 мкМ протягом 24 годин спеціально збільшило кількість клітин з п'ятьма і більше сильно забарвленими ядерними вогнищами 53BP1 при всьому раку, але не в жодній з неракових клітинних ліній (рис. 2Е і F). Значне збільшення кількості клітин 53BP1+ спостерігалося вже через 5 годин після початку лікування ехінакозидом (рис. 2Ф). Більш висока концентрація (80 мкМ) ехінакозиду або довший час лікування (12 годин і 24 години) призвели до більшого збільшення як кількості клітин 53BP1+ (рис. 2F), так і кількості клітинних вогнищ 53BP1. Разом ці результати свідчать про те, що інгібування MTH1 Ехінакозидом спричинило накопичення 8-оксоG та великі пошкодження ДНК при раку, але не в неракових клітинах.

ехінакозид пригнічував проліферацію ракових клітин

У велосипедних клітинах неремонтовані розриви ниток ДНК викличе колапс реплікаційних вилок ДНК, що потім призведе до блокування проліферації клітин індукцією зупинки клітинного циклу і апоптозу.50 Перевірити наслідкиЕхінакозидщодо росту клітин та проліферації, ми вперше проаналізували ріст ракових клітин, оброблених Ехінакозидом MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 та SW480, методом аналізу формування колонії. Результати показали, що ракові клітини лікувалися 60 мкМ або 80 мкМЕхінакозидутворилося значно менше колоній, а колонії, що утворилися, були значно меншими (рис. 3А і В), що свідчить про сильно придушений потенціал зростання. Далі ми проаналізували проліферацію цих ракових клітин разом з нераковими клітинами L-O2, HEK 293 та NIH/3T3 за допомогою аналізу MTT. Результати показали, що доза ехінакозидузалежно гальмувала проліферацію раку, але не неракових клітин (рис. 3С). Часове курсове дослідження ракових клітин, оброблених ехінакозидом 60 мкМ, показало, що через 5 годин не було суттєвої різниці між нелікуванням і групами лікування, але через 12 годин проліферація ракових клітин була значно загальмована на 60 мкМЕхінакозид(Рисунок 3D).

етапи клітинного циклу методом проточної цитометрії виявили, щоЕхінакозиддоза лікування залежать від зниження відсотка клітин як у фазах S, так і G2/M, тоді як відсоток клітин у фазі G1 збільшився (рис. 4С і D). Після 80 мкМ лікування ехінакозидом клітин МГ-63 протягом 24 годин клітини у фазі G2/M знизилися з 15% до майже нуля, а клітини у фазі S знизилися з 37% до 17%, тоді як клітини у фазі G0/1 збільшилися з 43% до 80% (рис. 4Е). Ці результати свідчать про те, що лікування за допомогоюЕхінакозидіндукована зупинка клітинного циклу і блокування ракових клітин у фазі G1.

Ехінакозид індукував апоптоз в ракових клітинах

Відповідно до спостережень за проліферацією клітин, Вестерн-блот-аналіз показав, що лікування 60 мкМ і 80 мкМЕхінакозидпротягом 24 годин підвищувалися рівні активної каспази-3 і розщеплюються полі (АДФ-рибози) білків полімерази в ракових клітинах (рис. 5А і В), що свідчить про індукцію каспазозалежного апоптозу. Потім ми розглянули кілька клітинних маркерів апоптозу. По-перше, ядерна морфологіяЕхінакозид-оброблені ракові клітини були виявлені шляхом фарбування ДНК-барвником DAPI, який показав, що 24 години лікування 60 мкМ і 80 мкМЕхінакозидзбільшилася кількість ознак апоптозу, в тому числі пікнозу і конденсованого хроматину (більш яскравих ядер) (рис. 5С). По-друге, ДНК, витягнута з аналогічно оброблених ракових клітин, була проаналізована електрофорезом на агарозному гелі, який виявив типову апоптотичний малюнок драбини (рис. S1B). Нарешті, клітинна активна каспаза-3 була виявлена імунофлюоресцентним фарбуванням, яке виявило сильні активовані сигнали каспази-3 вЕхінакозид-оброблені ракові клітини (рис. S1C).

Далі відсоток апоптотичних клітин вимірювали за допомогою анексину V-FITC і PI подвійного фарбування і проточної цитометрії. Аналіз клітин, оброблених 0 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ, 80 мкМ або 160 мкМЕхінакозидпротягом 2 годин, 5 годин, 12 годин або 24 годин показали, що концентрація 60 мкМ або вищеЕхінакозидіндукував значний апоптоз в ракових клітинах MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 і SW480 (рис. 6А), але не в неракових клітинах L-O2, HEK 293 і NIH/3T3 (рисунок S2). Після обробки мг-63 клітин 60 мкМ, 80 мкМ або 160 мкМЕхінакозидза 24 години відсоток апоптотичних клітин збільшився з 8,89% до 33,72%, 39,01% і 48,12% відповідно (рис. 6А). Дослідження курсу часу показало, що через 5 годин не було суттєвої різниці між групами нелікування та лікування, але значний апоптоз спостерігався після лікування 60 мкМ або більш високими концентраціями ехінакозиду протягом 12 годин (рис. 6В і S3).

Нарешті, вимірювання потенціалу мітохондріальної мембрани флуоресцентним барвником JC-1 наочно показало помітну втрату потенціалу мітохондріальної мембрани після лікування 60 мкМЕхінакозидпротягом 12 годин (рис. 6С), але не через 5 годин, що свідчить про активацію внутрішнього шляху апоптозу після пошкоджень ДНК, викликаних підвищеним 8-оксодГ.

Упротиракові засоби,і протизапальну діюcistanche ехінакозид

Обговорення

Ехінакозидє природним з'єднанням, виділеним з лікарських рослин Cistanche та ехінацеї.51,52 Було показано, що він має універсальні рекламні та профілактичні властивості для здоров'я, включаючи нейронний захист, гепатопротекторію, проти запалення, антифатіг, антисенесценцію, протидіабет та протипухлинну діяльність.53–58 Найвідоміша та прийнята біоактивністьЕхінакозидє його антиокислювальну та АФК-падальцинуючу дію;44,45 однак було показано, що він також викликає окислювальні пошкодження ДНК у ракових клітинах, при цьому основні механізми залишаються неясними.58 У цьому дослідженні, використовуючи високу пропускну здатність у скринінговому аналізі a vitro, ми виявили, щоЕхінакозидефективно пригнічував ферментативну реакцію MTH1-каталізованої. Збільшення кількості ферменту MTH1 зменшило ступінь інгібування, одночасно збільшуючи кількість неорганічної пірофосфатази, не вплинуло на інгібування, що свідчить про те, що ехінакозид спеціально пригнічував активність MTH1 в аналізі in vitro. Лікування різних ракових клітинних ліній людини ехінакозидом спричинило значне підвищення рівня клітин 8-оксог без зміни рівня клітинного АФК. Враховуючи, що Ехінакозид сам по собі є потужним антиоксидантом, ці результати свідчать про те, що підвищений внутрішньоклітинний рівень 8-оксог, ймовірно, був результатом інгібування клітинного MTH1 Ехінакозидом.

Лікування за допомогоюЕхінакозидспричинив великі пошкодження ДНК та значне регулювання блокатора G1/S-CDK p21, за якими послідувала виражена апоптотична загибель клітин та пригнічення проліферації клітин саме при раку, але не в неракових клітинах. Крім того, помітна втрата потенціалу мітохондріальної мембрани після

Ехінакозидлікування показало активацію внутрішнього шляху апоптозу.Ехінакозид-індуковані пошкодження ДНК та апрегуляція р21 спостерігалися протягом 5 годин після лікування, тоді як апоптоз ракових клітин, порушення потенціалу мітохондріальної мембрани та гальмування росту спостерігалися через 12 годин після початку лікування. Ці дані підтверджують, що апоптоз ракових клітин і інгібування росту були результатами великих пошкоджень ДНК, викликаних інгібуванням MTH1. Недавні дослідження показали, що зменшення розміру пулу клітин dNTP також може викликати стрес реплікації ДНК і пошкодження ДНК.59,60 Однак на 200% збільшення рівня 8-оксог в ракових клітинах, оброблених Ехінакозидом, також стверджує проти можливості зменшення розміру пулу DNTP, а Bcl2, білок, який зменшує розмір басейну dNTP,60 був значно зменшений в ракових клітинах SW480, оброблених ехінакозидом;58 крім того, наші дані чітко показали, що Echinacoside безпосередньо інгібував MTH1, що могло принаймні частково відповідати за пошкодження ДНК та клітинні ефекти, спричинені Ехінакозидом.

Пул dNTP є критичною мішенню АФК, а окислені дНТП є важливими джерелами окислювальних пошкоджень ДНК.3,10 Репараційно-асоційовані ДНК SSBs і DSBs можуть призвести до клітинної сенесценції та апоптозу, які причетні до старіння та високого ступеня внутрішньопухлинної гетерогенності та високих показників мутацій у ракових клітинах. На відміну від цього, інгібуванняMTH1 націлене на фенотип, який відрізняє більшість ракових клітин від нормальних клітин і, отже, являє собою нову протипухлинну стратегію, яка не обмежена генетичними адаптаціями. Цікаво, що антагоністи малих молекул білка антиапоптозу Bcl266,67 і агоністи проапоптоза Bax68 були розроблені і були продемонстровані як перспективні нові протипухлинні агенти. Враховуючи їх взаємодоповнюючі механізми дії, поєднання інгібіторів MTH1 та хімічних речовин, що сприяють апоптозу, створило б захоплююче нове покоління протипухлинних препаратів.

Вперше ми продемонстрували нову функцію для Ехінакозиду як протипухлинного природного з'єднання. У аналізі in vitro ехінакозид інгібував MTH1 з IC50 7,01 мкМ. Це значення IC50 вище, ніж у інгібіторів MTH1, про які повідомлялося до цих пір.32,33,69 Використовуючи (S)-кризотиніб як позитивний контроль, ми показали, що наш аналіз в сім разів менш чутливий, ніж той, який використовується Huber et al.33 Таким чином, фактичний IC50 Ехінакозиду, ймовірно, буде нижчим. Тим не менш, щоб розвинути його як терапевтичний засіб, ефективність природної молекули ехінакозиду, ймовірно, потрібно буде поліпшити. Як натуральний продукт, який використовується як фітотерапія протягом тривалого часу, Ехінакозид міг би служити хорошим хімічним риштуванням для розробки ефективних і, ймовірно, безпечних інгібіторів MTH1.37,70 Враховуючи, що натуральні продукти були багатим джерелом нових хімічних риштування для раціональної конструкції лікарських засобів на основі структури,70 підходів, подібних до того, що ми тут використовували,

разом з величезними інтересами до натуральних продуктів для відкриття ліків, буде корисним для пошуку цільових, ефективних і безпечних нових препаратів.

CistancheехінакозидМаєпротиракові засоби,та імунопідсилювальні ефекти