Частина 2: Актеозид пригнічує остеокластогенез, опосередкований RANKL, інгібуючи індукцію C-Fos і шлях NF-kB і послаблюючи вироблення АФК

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Натисніть тут, щоб повернутися до частини 1

АктеозидПригнічує резорбцію кісткової тканини макрофагами Актеозид також запобігав опосередкованій RANKL резорбції кісткової тканини залежно від дози, як було визначено за допомогою модельної системи in vitro (рис. 3A). Резорбція кістки значно пригнічувалася, коли BMM інкубували з 1 мМ актеозидом (рис. 3B). Обробка 10 мМ актеозидом майже повністю послабила RANKL-індуковане утворення ямок BMM. Подібним чином актеозид знижував резорбцію кісткової тканини в клітинах RAW264.7, стимульованих RANKL (рис. S2A і B). Здатність актеозиду пригнічувати резорбцію кісткової тканини залежала від часу лікування відносно стимуляції RANKL. Актеозид (10 мМ), доданий через 4 дні після стимуляції RANKL, не зменшував утворення ямок у BMM, тоді як він пригнічував кількість утворених остеокластів (рис. 3C). Цей різний результат був частково пов’язаний з тим, що площа ямки вже сформувалася після 4 днів утворення стимуляції RANKL (рис. 3D).

ЕКСТРАКТ ЦИСТАНШИ

АктеозидНижче регулює ранні сигнальні шляхи RANKL

RANKL індукує активацію 3 добре відомих MAPK і NF-kB у попередниках остеокластів, і ця активація необхідна для ранньої диференціації остеокластів. Щоб зрозуміти можливі механізми, за допомогою якихактеозидпригнічує остеокластогенез, ми досліджували ефектактеозидна MAPK та активацію NF-kB у макрофагах. Клітини BMM і RAW264.7 попередньо обробляли 10 мМ актеозидом протягом 2 годин, а потім стимулювали 100 нг/мл RANKL протягом 30 хвилин. Фосфорилювання MAPK перевіряли за допомогою вестерн-блоттингу та імунометричного аналізу. RANKL індукував фосфорилювання p38, ERK і JNK в клітинах BMM (рис. 4A) і RAW264.7 (рис. 4B). Актеозид запобігав цим індукованим RANKL збільшенням p-p38, p-ERK і p-JNK. Цей результат був підтверджений імунометричним аналізом, який показав, що попередня обробка 10 мМ актеозидом значно пригнічувала рівні фосфорильованих MAPK у цих макрофагах (рис. 4C). Лікування RANKL збільшило зв’язування ДНК NF-kB, тоді як актеозид інгібував індуковану RANKL активацію зв’язування NF-kB-ДНК (рис. 5A). Це інгібування було більш помітним у BMM, ніж у клітинах RAW264.7. Актеозид також зменшив RANKL-стимульоване фосфорилювання p65 і IkBa в клітинах BMM і RAW264.7 (рис. 5B і C). Додавання 10 мМ актеозиду майже повністю пригнічувало як деградацію, так і активацію IkBa в BMM (рис. 5B). Для подальшого підтвердження того, що активація NF-kB бере участь у дії актеозиду, конструкції промотора kB-люциферази були тимчасово трансфіковані в клітини RAW264.7. Клітини, інкубовані з 100 нг/мл RANKL, мали 3-рази вищу активність промотора kB, яка була значно послаблена 10 мМ актеозидом (рис. 5D).

АктеозидПригнічує вироблення запальних цитокінів і експресію TNF-a, c-Fos і NFATc1 у макрофагах, стимульованих RANKL. TNF-a, IL-1b і IL-6 важливі для формування остеокластів і функцію, яка опосередкована передачею сигналу NF-kB у RANKL-стимульованих макрофагах. RANKL стимулював вироблення цих цитокінів, і це вироблення було помітно знижено при попередньому введенні 10 мМ актеозиду в BMM (рис. 6A). Подібним чином актеозид послаблював індуковане RANKL виробництво цитокінів, крім IL-6, у макрофагах RAW264.7 (рис. S3). Щоб зрозуміти молекулярні механізми дії актеозиду в остеокластогенезі, ми додатково дослідили вплив актеозиду на експресію TNF-a, c-Fos і NFATc1. RANKL посилював експресію мРНК цих факторів у клітинах BMM і RAW264.7 (рис. 6B і C). Попередня обробка 10 мМ актеозидом значно пригнічувала індуковану RANKL експресію цих факторів в обох

BMM і клітинки RAW264.7. Попередня обробка актеозидом також значно знизила рівні білка c-Fos і NFATc1 у BMM, стимульованих RANKL (рис. 6D). Ці результати свідчать про те, що актеозид знижує регуляцію RANKL, індукуючи медіатори утворення остеокластів на генному та білковому рівнях.

ЕКСТРАКТ ЦИСТАНШИ: АКТЕОЗИД

Актеозид зменшує внутрішньоклітинну генерацію ROS у BMM залежно від дози

Оскільки відомо, що внутрішньоклітинна продукція АФК корелює з RANKL-стимульованим остеокластогенезом, ми дослідили, чи актеозид інгібує вироблення АФК під час опосередкованої RANKL диференціювання остеокластів, використовуючи проникний для клітин барвник, чутливий до окислення, DCFH-DA. Аналіз проточної цитометрії показав, що середній сигнал флуоресценції, специфічний для DCF у BMM, був очевидно зміщений вправо після стимуляції RANKL порівняно з необробленими контрольними клітинами (рис. 7A). Цей зсув був подібний до випадку, коли макрофаги RAW264.7 спостерігалися після стимуляції RANKL (дані не показані). Обробка BMMs актеозидом зменшувала інтенсивність сигналу DCF залежно від дози. Попередня обробка 10 мМ актеозидом майже повністю знизила рівні внутрішньоклітинних АФК, що утворюються під час диференціювання остеокластів, до контрольних рівнів без лікування (рис. 7B).

Пероральне введення актеозиду пригнічує зміну остеопоротичних біохімічних маркерів і втрату кісткової тканини у мишей з оваріектомією

Щоб дослідити вплив актеозиду на втрату кісткової маси, ми підготували модель тварини з остеопорозом шляхом оваріектомії. Не було істотної різниці у масі тіла між мишами OVX і Sham протягом експериментального періоду (дані не показані). Група OVX мала значно вищі рівні IL-1b та IL-6 у сироватці крові, ніж група Шам (рис. 8). Індуковане оваріоектомією збільшення цих запальних цитокінів було послаблено пероральним прийомом актеозиду (група АС). Сироваткові рівні маркерів обміну кісткової тканини, таких як ALP, кальцій, TRAP5b і ​​OC, були значно підвищені в групі OVX. З цих остеопоротичних маркерів підвищені рівні кальцію, TRAP5b і ​​OC у мишей OVX, очевидно, пригнічувалися лікуванням актеозидом, тоді як рівень ALP у сироватці крові не змінювався лікуванням. Середнє максимальне навантаження на перелом до середини діафіза правої стегнової кістки було значно нижчим у групі OVX, ніж у групі Sham (рис. 9A). Лікування актеозидом підвищило максимальний перелом до рівня групи Шам. Коли кортикальну кістку стегнової кістки розрізали та спостерігали за допомогою оптичної мікроскопії, остеопоротичні ознаки, виявлені в групі OVX, майже повністю зникли у мишей AC (рис. 9B). Щоб перевірити вплив актеозиду на модель остеопорозу, індукованого OVX, МЩКТ і морфологічні параметри кісток у трабекулі світлого проксимального відділу стегнової кістки аналізували за допомогою мікро-КТ. Як показано на рис. 9C, у мишей OVX було виявлено зміну стегнової трабекулярної архітектури, тоді як ця зміна була зменшена лікуванням актеозидом. Результати аналізу мікро-КТ показали, що МЩКТ, міра міцності кісток, була різко знижена у мишей OVX (рис. 9D). Порівняно з групою Sham миші OVX також показали значні зміни BV/TV, Tb. Sp і Tb. N, але не в Tb.Th. Пероральне лікування актеозидом мишей OVX значною мірою запобігало зміні МЩКТ, а також BV/TV і Tb.N.

Актеозид не впливає на остеобластогенез у клітинах кісткового мозку

Роль актеозиду на диференціювання остеобластів була додатково досліджена з використанням клітин кісткового мозку. Як показано на фіг. 10A, обробка DAG збільшила кількість червоно-забарвлених алізарином клітин, і це не змінилося після попередньої обробки 10 мМ актеозидом. Кількість присутнього барвника вказує на те, що комбінований актеозид іОбробка DAG не змінила мінералізацію (рис. 10B). Аналогічно, DAG-індуковане підвищення вмісту внутрішньоклітинного кальцію (рис. 10C) і рівнів мРНК (рис. 10D) специфічних для кісток маркерів, таких як Runx2, osterix, BSP і OC, не зазнало впливу попередньої обробки актеозидом.

ефект актеозиду цистанхи

Обговорення

Ремоделювання кістки жорстко регулюється балансом між формуванням кістки остеобластами та резорбцією кістки остеокластами. Тривала і надмірна резорбція кістки спричиняє дисбаланс обміну скелету, що призводить до кістково-резорбтивних захворювань. Щоб дослідити вплив актеозиду на остеокластогенез, ми використали два макрофаги, первинно культивовані BMM і клітини RAW264.7.

Ці клітини стимулювали за допомогою RANKL для диференціювання в остеокласти в присутності та відсутності актеозиду. Ми вперше показали, що актеозид пригнічує диференціювання та утворення остеокластів. Сам актеозид у досліджуваних концентраціях не викликав зниження життєздатності первинно культивованих макрофагів як в умовах росту, так і в умовах диференціювання.

Лікування актеозидом також знижувало резорбційну активність зрілих остеокластів. Ці результати свідчать про те, що актеозид пригнічує утворення остеокластів з макрофагів і активність резорбції остеокластів. Результати нашої культуральної системи, яка не включала остеобласти або стромальні клітини, також свідчать про те, що актеозид запобігає утворенню остеокластів шляхом прямої дії на попередники остеокластів.

RANKL активує MAPK, включаючи p38, ERK і JNK. Ці три кінази беруть участь у ранній диференціації остеокластів, і, таким чином, їх інгібування фармакологічно або за допомогою домінантно-негативної трансфекції JNK пригнічує RANKL-індукований остеокластогенез [29]. Наші результати показали, що попередня обробка актеозидом пригнічує всі ці кінази, що вказує на неспецифічне пригнічення MAPK. Цей результат частково відрізнявся від попереднього звіту про те, що EGCG, основна протизапальна сполука в зеленому чаї, спеціально послаблював активацію JNK, не впливаючи на активацію ERK або p38 у BMM, стимульованих RANKL [7]. Паеонол, протизапальна сполука, отримана з китайської трави, також повідомляється, що пригнічує ERK і p38, але не JNK, фосфорилювання в стимульованих RANKL клітинах RAW264.7 [30]. Навпаки, силібінін, новий інгібітор у кістках, послабив RANKL-індуковану активацію p38, ERK і JNK [31]. Ці результати показують, що вплив антирезорбтивних сполук на активацію MAPK за допомогою RANKL залежить від сполуки, хоча всі три MAPK беруть участь у ранньому остеокластогенезі.

Беручи до уваги спостереження, що актеозид послаблює p-JNK

рівні в BMM, стимульованих RANKL, навіть при 1 мМ, блокування JNK, а не p38 MAPK або ERK, виявилося більш специфічною подією в опосередкованому актеозидом антиостеокластогенезі в клітинах. Хоча актеозид у тій же концентрації не зменшував кількість остеокластів у BMM, спостерігалося значне зменшення утворення ямок під час лікування актеозидом. Ми також виявили, що попередня обробка SP600125, фармакологічним інгібітором, специфічним для JNK, різко запобігла утворенню остеокластів (дані не показані). У сукупності ці результати свідчать про те, що передача сигналів, опосередкована JNK, тісно пов’язана з опосередкованим актеозидом пригніченням остеокластогенезу, стимульованого RANKL.

Передача сигналів NF-kB регулює клітинні події, включаючи апоптоз, прогресування клітинного циклу, клітинну адгезію, продукцію цитокінів і виживання в макрофагах [32]. Передача сигналів NF-kB також потрібна для розвитку остеокластів, що було продемонстровано появою остеопетрозу у мишей з нокаутом NF-kB [33,34]. Таким чином, інгібування NF-kB вважається ефективною мішенню для антирезорбтивних засобів для зниження регуляції активності остеокластів і лікування остеопорозу. Посттрансляційна модифікація білків підродини NF-kB має вирішальне значення для модуляції активності NF-kB. Зокрема, фосфорилювання субодиниці p65 і кінази IkB є критичним для NF-kB для індукування остеокластогенезу [7]. Наші поточні результати показали, що стимуляція RANKL підвищила активність зв’язування ДНК NF-kB і фосфорилювання субодиниці p65 та IkBa як у BMM, так і в клітинах RAW264.7. Попередня обробка актеозидом пригнічувала ці індуковані RANKL підвищення, що призводило до зниження активності NF-kB. Отже, ці результати свідчать про те, що, окрім MAPK, передача сигналів NF-kB є основною мішенню актеозиду в інгібуванні диференціювання та утворення остеокластів із стимульованих RANKL макрофагів.

На додаток до передачі сигналу NF-kB, шлях c-Fos/c-Jun/NFATc1 відіграє ключову роль у розвитку остеокластів, тому відсутність будь-якого з цих білків може зупинити остеокластогенез [35,36]. У цьому дослідженні ми виявили, що актеозид запобігає індукованій RANKL експресії c-Fos і NFATc1 на рівнях мРНК і білка. JNK — це кіназа c-Jun, яка є передовою кіназою, яка необхідна для експресії NFATc1 і остеокластогенезу у відповідь на RANKL [29].

Блокування шляху theJNK/c-Jun інгібітором сміття зменшувало RANKL-індуковане утворення остеокластів і експресію c-Fos і NFATc1 [7]. Наші результати та попередні висновки свідчать про те, що інгібування JNK-опосередкованої передачі сигналу актеозидом тісно пов’язане із запобіганням RANKL-опосередкованої c-Fos і NFATc1експресія, яка пригнічує диференціацію остеокластів у макрофагах. Відмінності в ефектах актеозиду на клітини BMM і RAW264.7 принаймні частково пов’язані з відмінностями в чутливості до інгібування JNK.

TNF-a може індукувати остеокластогенез незалежно від передачі сигналів RANKL-RANK [37]. ІЛ-1 є потужним медіатором патологічного руйнування кісток, спричиненого дефіцитом естрогену або запаленням [7]. Порушення рецептора IL-1 типу I або передачі сигналів IL-1 може повернути назад втрату кісткової тканини, спричинену оваріектомією [38] або ревматоїдним артритом [39]. Це дослідження продемонструвало здатність актеозиду зменшувати продукування запальних цитокінів, таких як TNF-a, IL- 1b та IL-6 у макрофагах. Вважається, що актеозид пригнічує продукцію запальних цитокінів шляхом пригнічення кінази р38 і сигналізації ERK, оскільки активація ERK1/2, p38 MAPK або обох потрібна для індукованого ліпополісахаридом виробництва цих цитокінів у макрофагах [40,41]. Також повідомлялося, що лютеолін, запальна сполука, пригнічує вироблення медіаторів запалення шляхом інгібування активації p38 MAPK [42]. У цьому дослідженні ми також виявили, що актеозид зменшує втрату кісткової маси у мишей з оваріектомією, про що свідчить відновлення максимальної сили перелому в середній частині правої стегнової кістки та зникнення остеопоротичної кортикальної кістки. Пероральне введення актеозиду знижувало індуковане оваріектомією підвищення рівнів IL-1b та IL-6 у сироватці крові, але не ALP. Підвищення сироваткових рівнів кальцію, TRAP і OC в OVX також пригнічувалося пероральним лікуванням актеозидом, що свідчить про те, що актеозид послаблює зміну біомаркерів, специфічних для формування кісткової тканини, а також резорбції. Оскільки остеопороз характеризується зниженою щільністю маси та погіршенням мікроархітектури трабекулярної кістки, індукована OVX втрата трабекулярної кісткової тканини та зміна морфометричних параметрів були значно пригнічені пероральним введенням актеозиду. Ці результати свідчать про те, що актеозид можна використовувати як антирезорбтивний засіб для лікування остеопорозу шляхом усунення незбалансованої активації остеокластів. Однак остеобласти є основним фактором, відповідальним за формування нової кістки. Таким чином, для посилення кісткоутворення необхідний агент, здатний посилити проліферацію або диференціювання остеобластів [30]. Навпаки, ми виявили, що актеозид не впливає на диференціювання або мінералізацію остеобластів у клітинах кісткового мозку, оброблених DAG. У сукупності наші результати свідчать про те, що актеозид має антирезорбційну дію, але не впливає безпосередньо на формування кісток. Необхідні більш детальні експерименти з аналізом специфічних для кісток параметрів in vivo та in vitro, щоб з’ясувати, чи впливає актеозид на остеобластогенез.

У цьому дослідженні підкреслюється інгібуючий ефект актеозиду на диференціювання остеокластів і резорбцію кісток шляхом пригнічення MAPK і кількох факторів транскрипції, таких як NF-kB, c-Fos і NFATc1. Дані свідчать про два можливі механізми, завдяки яким актеозид має ці переваги.

ЦИСТАНХЕ ЕХІНАКОЗИД І АКТЕОЗИД МОЖУТЬ лікувати остеопороз

Список літератури

1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Остеоімунологія: взаємодія імунної та скелетної систем. Молекули та клітини 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Кістка та кістковий мозок: той самий орган. Архів біохімії Біофізика 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Остеопороз: зараз і майбутнє. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Кісткові метастази при раку простати: нові терапевтичні стратегії. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Гольцман Д. (2002) Відкриття, ліки та захворювання скелета. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.

6. Родан Г.А., Мартін Т.Дж. (2002) Терапевтичні підходи до захворювань кісток. Наука 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H та ін. (2010) Галат епігалокатехіну-3- пригнічує остеокластогенез, знижуючи експресію c-Fos і пригнічуючи сигнал ядерного фактора каппаВ. Молекулярна фармакологія 77: 17–25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K та ін. (2012) MS-275, інгібітор бензамід-гістондеацетилази, запобігає остеокластогенезу шляхом зниження експресії c-Fos і пригнічує втрату кісткової маси у мишей. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Антиостеопоротичний ефект Yijung-tang у моделі щура з оваріектомією, опосередкований інгібуванням диференціювання остеокластів. Журнал етнофармакології 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Риб’ячий жир пригнічує резорбцію кісткової тканини шляхом пригнічення остеокластогенезу через зниження експресії M-CSF, PU.1, MITF і RANK у щурів з оваріектомією. Звіти про молекулярну медицину 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Остеокласт: багатоядерна остеоімунна клітина гемопоетичного походження, що резорбує кістку. Журнал клітинної біохімії 102: 1130–1139.

12. Такахасі Н., Маеда К., Ісіхара А., Уехара С., Кобаясі Ю. (2011) Регуляторний механізм остеокластогенезу за допомогою сигналів RANKL і Wnt. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.