Частина 1: Інтегрована мережева фармакологія та модель даніо для дослідження компонентів подвійної дії Cistanche tubulosa для лікування як остеопорозу, так і хвороби Альцгеймера
Mar 30, 2022
Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * і Fei Li 1, 2, *
АНОТАЦІЯ
Етнофармакологічна значимість:Остеопороз (ОП) і хвороба Альцгеймера (БА) є поширеними геріатричними супутніми захворюваннями, багато досліджень вказують на зв'язок їх патогенезу. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) — це широко використовувана традиційна китайська медицина, яка широко використовується для лікування ОП та БА відповідно. Однак активні інгредієнти як для супутніх захворювань одночасно, так і для основних механізмів обмежені.
Мета дослідження:Ця робота була спрямована на створення ефективного та надійного методу скринінгу мережі для пошуку сполук подвійної дії в КТ, які можуть одночасно захищати AD та OP. І це забезпечить нові перспективи зв’язку між OP і AD щодо молекулярних механізмів.
Матеріал і методи:Подвійний ефект КТ систематично аналізувався шляхом інтеграції багатьох баз даних і широкого аналізу на рівні мережевої фармакології. Для виявлення відмінностей у ефектах між різними типами сполук було створено класифіковану мережу взаємодії лікарського засобу та мішені. Щоб підтвердити ефективність цієї мережі, деякі сполуки були вибрані для перевірки в попередньо індукованій OP моделі та AlCl3-індукованій AD моделі рибок даніо відповідно до топологічних параметрів.
Ключові слова:мережева фармакологія; остеопороз;хвороба Альцгеймера; цистанка трубчаста; рибка даніо.
Цистанхе має дію проти хвороби Альцгеймера.
1. Введення
Тенденція до старіння населення призводить до збільшення поширеності остеопорозу (ОП) і хвороби Альцгеймера (БА) з роками (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Нині як ОП, так і БА визнані серйозними загрозами для громадського здоров’я, оскільки вони можуть прогресувати без симптомів і становити величезний соціальний тягар (Erkkinen та ін., 2018; Йонссон та ін., 2018). Як захворювання, пов’язані з віком, у клінічній практиці вони часто зустрічаються разом із високим рівнем інвалідності та смертності (Dengler-Crish and Elefteriou, 2019). ОП — це системне захворювання скелета, що характеризується низькою кістковою масою та порушенням мікроархітектури кісткової тканини, з підвищеною крихкістю кісток і підвищеним ризиком переломів (Rizzoli, 2018). AD є найпоширенішою дегенерацією мозку, що характеризується прогресуючою втратою пам’яті та інших когнітивних функцій (Bondi et al., 2017). Досі не існує достатньо потужних засобів для запобігання або лікування двох захворювань їх складної етіології та патогенезу. І що ще гірше, у пацієнта частіше виникають побічні ефекти (Brown, 2017; Huang and Mucke, 2012).
На теоретичній основі диференціації синдрому (Sucher, 2013), традиційні китайські ліки (ТКМ) з кількома компонентами, націленими на більш ніж один патофізіологічний механізм, мають унікальну перевагу в лікуванні деяких відомих комплексних захворювань. Традиційними китайськими лікарями Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) як тонізуюча трава для нирок широко використовується проти втрати пам’яті та атрофічної слабкості кісток (Fu et al., 2018). Окрім традиційної ефективності, значні дослідження показали, що він має різні фармакологічні дії, такі як полегшення когнітивних і поведінкових дефіцитів (Wu та ін., 2014), протизапальну дію (Fu та ін., 2018), сприяння формуванню кісткової тканини та пригнічення кісткової тканини. резорбції (Li et al., 2013; Li et al., 2012), а також антиоксидантну активність (Zhang et al., 2016). Але складність його активних інгредієнтів і метаболічного процесу викликала труднощі як у дослідженні мішеней у тканинах людини, так і в поясненні механізму дії.
Перш за все, необхідне достовірне обговорення терапевтичних цілей ОП/АД. Особливо ґрунтуючись на думці про «однакове лікування різних захворювань» у ТКМ та методології «багатокомпонентної терапії, біологічної мережі» у мережевій фармакології, спроби пошуку значущих спільних цілей для обох захворювань можуть мати особливо практичну користь значення в наданні вказівок щодо профілактики та контролю OP та AD. Фізіологія скелета рибок даніо дуже подібна до ссавців і дуже гомологічні гени до людей. Це доступна та приваблива тваринна модель in vivo для досліджень OP та AD (Bergen та ін., 2019; Ньюман та ін., 2014). Таким чином, це мережеве фармакологічне дослідження було спрямоване на скринінг активних компонентів ХТ з подвійною дією, вивчення загальних потенційних мішеней ОП та БА, а також виявлення можливості використання ХТ для лікування двох захворювань одночасно. У цьому дослідженні цільова інформація про активні інгредієнти КТ, геноми та інформацію про протеоміку ОП та БА були відповідно зібрані з різних баз даних для створення інтерактивної мережі, а аналіз збагачення був побудований для виявлення синергічних механізмів КТ для лікування ОП та АД. . Крім того, ми індукували моделі рибок даніо OP та AD відповідно та захопили ключові сполуки в мережі, щоб перевірити їхню ефективність та мішені для двох захворювань.
Цистанхе прискорює ріст склеротину.
2. Матеріали та методи
2.1 Реактиви
Хімічні стандарти геністеїну (GE), кверцетину (QU), абієтинової кислоти (AA), -ситостеролу (BSS) (чистота більше або дорівнює 98 відсоткам) були придбані у Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Ченду, Китай). Планшети для культур були отримані від Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Китай). Преднізолон (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Донепезил HCL (DPZ), AlCl3·6H2O було придбано в Aladdin Reagent Inc. Лужна фосфатаза рибки даніо (ALP), стійка до тартрату кисла фосфатаза (TRAP), ацетилхолінестераза (AChE) і холін набір для імуноферментного аналізу (ELISA) ацетилтрансферази (ChAT) було поставлено компанією Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Тризол був отриманий від Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Нанкін, Китай). Transtar Top Green qPCR SuperMix був придбаний у TransGen Biotech. Co., Ltd. (Пекін, Китай).
екстракт цистанки
2.2 Тварини
Дорослих рибок даніо (штам AB, віком 4 місяці) утримували при 28 градусах за циклу світла/темряви 14/10 годин в акваріумі, обладнаному системою обміну прісною водою. Їх тримали два рази на день на дієті з нововиведених соляних креветок (Chen et al., 2018). Нормально запліднені ембріони відбирали та культивували до 3 днів після запліднення (dpf) у світлому інкубаторі. Усі експерименти на тваринах проводилися відповідно до вказівок установи та уряду щодо експериментів на тваринах.
2.3 Мережевий фармакологічний процес
2.3.1 Розрахунок хімічного простору та скринінг сполук-кандидатів
Усі дані про хімічні інгредієнти КТ були зібрані з бази даних і платформи аналізу систем традиційної китайської медицини. TCMSP — це системна фармакологічна платформа китайських рослинних ліків, яка фіксує взаємозв’язки між ліками, цілями та захворюваннями (Ru et al., 2014). Водночас чотири основні параметри, пов’язані з фармакологією, у TCMSP були отримані для аналізу головних компонентів (PCA), включаючи молекулярну масу (MW), коефіцієнт розподілу між октанолом і водою (AlogP), кількість донорів водню (Hdon) і кількість акцепторів водню ( Hacc). Хімічний розподіл КТ був побудований із зазначеними вище параметрами за допомогою програмного забезпечення SIMCA (версія 14.1, Umetrics). І низькомолекулярні ліки, схвалені для AD/OP від DrugBank, були оброблені таким же курсом. Інгредієнти з КТ були відфільтровані за схожістю з наркотиками (DL). DL — це якісна концепція, яка використовується при розробці лікарських засобів для оцінки того, наскільки потенційна сполука «схожа на ліки». Ця важлива властивість використовується як критерій відбору для «лікарських» сполук у традиційних китайських травах і допомагає оптимізувати фармакокінетику та фармацевтичні властивості (Tao et al., 2013). На основі пропозицій у літературі та TCMSP ми вибрали DL більше або дорівнює 0.18 як умови фільтра. Інгредієнти, що відповідають умовам, були вивезені для подальшого аналізу. Їхні 2-вимірні (2D) і 3D структури були намальовані за допомогою програмного забезпечення ChemDraw Professional 16.0. А тривимірні структури були оптимізовані функцією мінімізації енергії в Chem3D 16.0.
2.3.2 Збір асоційованих цілей OP і AD
Усі асоціації генів для OP та AD були незалежно зібрані з DisGeNET та GeneCards. База даних DisGeNET є однією з найбільших загальнодоступних платформ для виявлення генів і варіантів, пов’язаних із захворюваннями людини (Pinero et al., 2017). GeneCards — це інтегрована база даних генів людини, яка містить геномну, транскриптомну, протеомну, генетичну, клінічну та функціональну інформацію (Safran et al., 2010).
2.3.3 Збір складених цілей і інверсне прогнозування стикування
Базу даних GeneCards і базу даних Swiss TargetPrediction об’єднали для прогнозування відповідних цілей активних інгредієнтів у КТ. GeneCards вказує на відомі активні мішені сполук, тоді як швейцарська база даних TargetPrediction може оцінити найбільш ймовірні макромолекулярні мішені малих молекул (Daina et al., 2019). Перед прогнозуванням структури молекул-кандидатів були перетворені з формату mol2 у формат SMILES за допомогою Open Babel (версія 2.4.1).
2.3.4 Аналіз білок-білкової взаємодії
Базу даних STRING було застосовано для виявлення взаємодії між групою спільних цілей CT-OP-AD. Після пошуку за шаблоном "Homo sapiens", мережа білок-білкової взаємодії (PPI) була візуалізована програмним забезпеченням Cytoscape (версія 3.7.2). STRING — це база даних відомих і прогнозованих PPI, отримана з прогнозів геномного контексту, високопродуктивних лабораторних експериментів, (збереженої) спільної експресії, автоматизованого аналізу тексту та попередніх знань у базах даних (Szklarczyk et al., 2017).
Цистанхея корисна при хворобі Альцгеймера.
2.3.5 Аналіз збагачення шляхів GO та KEGG
Аналіз збагачення Gene Ontology (GO) проводили за допомогою програмного забезпечення Funrich. FunRich (версія 3.1.3) — це функціональне програмне забезпечення, яке використовується переважно для аналізу збагачення генів і білків (Pathan et al., 2015). База даних ConsensusPathDB-людини була використана для проведення аналізу збагачення шляху. Отриманий список генів було надіслано до бази даних із встановленням «p-value cutoff» як 0,01. Після отримання результатів лише ці шляхи, пов’язані з OP та/або AD, були відібрані та розділені на групи відповідно до функціональних категорій KEGG. CPDB — це безперервна мережа взаємодії, що містить бінарні та комплексні білок-білкові, генетичні, метаболічні, сигнальні, генно-регуляторні та лікарсько-цільові взаємодії, а також біохімічні шляхи в Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Експериментальні процедури для моделі OP Zebrafish
2.4.1 Групування моделі
Личинки даніо були розділені на кілька груп: контрольна група, модельна група, модель плюс група Ed, модель плюс групи сполук, кожна з яких містила 30 личинки. Контрольну групу підтримували в середовищі з 0,2% ДМСО. Модельну групу обробляли Pre (25 мкМ) від 3 dpf до 8 dpf. Групу моделі та Ed спільно обробляли Pre та Ed (30 мкг/мл).
2.4.2 Фарбування алізариновим червоним
Після 5 днів культивування з різними сполуками личинки по черзі анестезували, фіксували та відбілювали. Алізарин червоний використовувався для фарбування кісток голови рибок даніо. Для видалення надлишку застосовували 1% КОН і гліцерин (співвідношення 3:1, 1:1 і 1:3). Нарешті, стереомікроскоп (Olympus SZX16) був використаний для захоплення зображень рибок даніо в положенні лежачи. Площа фарбування та інтегральна оптична щільність (IOD) були розраховані за допомогою Image-Pro Plus 6.0.
2.4.3 Визначення активності ALP і TRAP
Личинки рибки даніо при 3 dpf пересівали в 6-лункові планшети та інкубували з Pre в присутності або за відсутності сполук протягом 5 днів. Потім їх збирали для вимірювання активності ALP. Активність ALP визначали за допомогою набору ALP ELISA рибок даніо на основі протоколу виробника. Метод оцінки активності TRAP був таким самим, як і ALP.
2.5 Експериментальні процедури для моделі AD Zebrafish
2.5.1 Групування моделі
Личинки даніо були розділені на кілька груп: контрольна група, модельна група, модель плюс група DPZ, модель плюс групи сполук, кожна з яких містила 30 личинки. Контрольну групу підтримували в середовищі з 0,2% ДМСО. Модельну групу обробляли AlCl3 (150 мкМ, pH 5,8) від 3 dpf до 6 dpf. Групу моделі та DPZ спільно обробляли AlCl3 та DPZ (8 мкМ).
2.5.2 Аналіз поведінки
Після 3 днів доставки препарату рух личинок було зафіксовано аналізатором поведінки ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Усі експерименти були завершені за 60 хвилин при 28˚C, що містило 3 цикли фази світло/темрява (по 10 хвилин для світла та темряви). Відповідно до методів у попередньому звіті середня швидкість (AS), зміна швидкості (∆S), швидкість відновлення дискінезії (DRR, рівняння a) та ефективність відповіді (RE, рівняння b) вибираються як ефективність препарату проти AD. індекс оцінки в цій моделі (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (мм/с)=D / T, DRR (відсотки)=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
де D – відстань руху даніо за 60 хв, T – час експерименту.
RE (відсотки)=100 × (∆SDпрепарат - ∆SMодель) / (∆SControl - ∆SMодель), b
де ∆S – зміна швидкості рибок даніо в циклах світла/темряви.
2.5.3 Вимірювання активності AChE та ChAT
Личинки рибки даніо при 3 dpf були субкультивовані в 6-лункові планшети та інкубовані з AlCl3 у присутності або за відсутності сполук протягом 3 днів. Потім їх збирали для діяльності AChE. Активність AChE була виявлена за допомогою набору AChE ELISA рибок даніо на основі протоколу виробника. Метод оцінки активності ChAT був таким самим, як і AChE.
2.6 Кількісний ПЛР-аналіз у реальному часі
Личинки даніо були розділені на групи OP і AD. Групи OP складалися з контрольної групи, групи Pre та груп Pre plus, культивованих від 3 dpf до 8 dpf. Групи AD включали контрольну групу, групу AlCl3 і групи AlCl3 плюс сполуки, культивовані від 3 dpf до 5 dpf. Кожна група містила по 30 личинок. Загальну РНК відповідно екстрагували з цих зразків личинок рибки даніо Trizol. Зразки РНК були зворотно транскрибовані в кДНК відповідно до інструкцій виробника набору кДНК. Рівень експресії мРНК визначали за допомогою флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі (Roche LightCycler96). Результати були нормалізовані до експресії -актину та кількісно визначені порівняльним (2−∆∆Ct) методом. Використані прямі та зворотні праймери були синтезовані Sangon Biotech (Шанхай, Китай) і перераховані в додатковій таблиці S1.
цистанш і порошок Тонгкат Алісприяє підвищенню імунітету.
Для отримання додаткової інформації натисніть тут.
2.7 Статистичний аналіз
GraphPad Prism версії 8.00 використовувався для описового статистичного аналізу. Дані були виражені як середнє значення ± стандартне відхилення та проаналізовані методом дисперсійного аналізу для перевірки мінливості між кожним дослідженням, вважаючи P менше або дорівнює 0,05 як значуще.
