Частина 1: Ехінакозид пригнічує вивільнення глутамату шляхом пригнічення залежного від напруги Ca2 плюс входження та протеїнкінази С у закінченнях церебральних нервів щурів

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Чен Вей Лу 1,2, Цзу Ю Лінь 1,2, Шу Куей Хуан 1 і Су Джейн Ван 3,*

Анотація:

Глутаматергічна система може брати участь у ефектах нейропротекторної терапії.Ехінакозид, фенілетаноїдний глікозид, витягнутий з лікарської китайської травиHerba Cistanche, має нейропротекторну дію. Це дослідження вивчало впливехінакозидна 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, у закінченнях кори головного мозку щурів (синаптосомах). Ехінакозид пригнічував Ca2+-залежне, але не Ca2+-незалежне 4-вивільнення глутамату, викликане амінопіридином, залежно від концентрації. Ехінакозид також зменшував 4-спричинене амінопіридином підвищення концентрації вільного Ca2 в цитоплазмі, але не змінював потенціал синаптосомної мембрани. Інгібуючу дію ехінакозиду на 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, запобігав о-конотоксин MVIIC, блокатор широкого спектру дії каналів Cav2.2 (N-тип) і Cav2.1 (P/Q-тип). , але був нечутливим до внутрішньоклітинного Ca2 плюс інгібіторів вивільнення дантролену та 7-хлоро-5-(2-хлорфеніл)-1,5-дигідро-4 ,1-бензодіазепін-2(3H)-он (CGP37157). Крім того, ехінакозид зменшував 4-індуковане амінопіридином фосфорилювання протеїнкінази С, а інгібітори протеїнкінази С скасовували вплив ехінакозиду на вивільнення глутамату. Згідно з цими результатами, ми припускаємо, що інгібуюча дія ехінакозиду на викликане вивільнення глутамату пов’язана зі зниженим вольтаж-залежним надходженням Ca2 плюс і подальшим пригніченням активності протеїнкінази С.

Ключові слова:ехінакозид; виділення глутамату; закінчення церебральних нервів; залежні від напруги Са2 плюс канали; протеїнкіназа С

1. Введення

Ехінакозидє основним фенілетаноїдним глікозидом, присутнім уHerbaЦистанхе, відома традиційна китайська медицина, яка використовується для лікування забудькуватості, імпотенції та хронічних запорів [1].Ехінакозидмає різноманітні біологічні властивості, такі як антиоксидантна, протизапальна, протипухлинна, гепатопротекторна та імуномодулююча [2–4]. Слід зазначити, що ехінакозид має нейропротекторну дію; наприклад, він може захищати від нейротоксичності, спричиненої окислювальним стресом або нейротоксином, у первинних кортикальних нейронах щурів, клітинах нейробластоми людини SH-SY5Y та клітинах феохромоцитоми (PC12) [5–8]. Крім того, ехінакозид послаблює пошкодження головного мозку та покращує когнітивні функції на тваринних моделях хвороби Паркінсона, хвороби Альцгеймера та оклюзії середньої церебральної артерії [9–12]. Однак механізм, за допомогою якогоехінакозидіндукує нейропротекторію, до кінця не вивчений.

Нейропротекція - це складний процес збереження структури і функції нейронів при токсичних інсультах. Зменшення ексайтотоксичності глутамату вважається потенційним механізмом, задіяним у нейропротекції мозку. Глутамат, нейромедіатор збуджуючої амінокислоти, відіграє вирішальну роль у кількох функціях мозку [13]. Однак надмірна активація глутаматних рецепторів при високих концентраціях глутамату викликає внутрішньоклітинне Ca2 плюс перевантаження, мітохондріальну дисфункцію, утворення вільних радикалів і загибель нейронів [14,15]. Цей патологічний процес причетний до багатьох розладів головного мозку, включаючи церебральну ішемію, черепно-мозкові травми, епілепсію та нейродегенеративні захворювання [16,17]. Отже, інгібітори, які блокують патофізіологічну глутаматергічну передачу, вважаються потенційними нейропротекторними препаратами. Яскравими прикладами з них є антагоністи рецепторів глутамату [18,19]; проте клінічні випробування цих препаратів зазнали невдачі через меншу ефективність і небажані або навіть цитотоксичні побічні ефекти [20,21]. На додаток до прямої блокади глутаматного рецептора, інгібування вивільнення глутамату може бути ефективною стратегією нейропротекції. Кілька нейропротекторів (наприклад, мемантин і рилузол) можуть зменшувати вивільнення глутамату в тканинах мозку щурів [22–24].

Враховуючи роль глутамату в ексайтотоксичності та нейропротекторний профіль ехінакозиду, у цьому дослідженні використовували ізольовані нервові закінчення (синаптосоми), очищені з кори головного мозку щурів, щоб дослідити вплив ехінакозиду на вивільнення глутамату та додатково дослідити потенційні механізми. Ізольований препарат нервового закінчення є добре встановленою моделлю для вивчення пресинаптичної регуляції вивільнення нейромедіаторів лікарськими засобами за відсутності будь-яких постсинаптичних ефектів [25]. Використовуючи цю модель, ми оцінили вплив ехінакозиду на вивільнення глутамату, мембранний потенціал, пресинаптичний приплив Ca2 плюс і активність протеїнкінази С. Згідно з нашим оглядом літератури, це перший звіт, який документує механізм, за допомогою якого ехінакозид пригнічує ендогенне вивільнення глутамату на пресинаптичному рівні.

2. Результати

2.1. ЕхінакозидПригнічує 4-вивільнення глутамату, викликане амінопіридином, із кінцівок кори головного мозку щурів шляхом зменшення везикулярного екзоцитозу

Рисунок 1 ілюструє залежний від концентрації ефект ехінакозиду на 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, із очищених синаптосом кори головного мозку щурів. У синаптосомах, інкубованих з 1 мМ CaCl2, 1 мМ 4-амінопіридин викликав вивільнення глутамату 7,4 ± {{1{{20}}}.1 нмоль/мг/5 хв, яке було зменшено на 1, 5, 10, 30 і 50 мкМ ехінакозиду до 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,

4,1 ± 0.1 або 2,3 ± 0.4 нмоль/мг/5 хв відповідно (F(5,24)=67.1, p=0). 000). Значення IC50 для опосередкованого ехінакозидом інгібування вивільнення глутамату, спричиненого 4-амінопіридином, отримане з кривої доза-відповідь, становило 24 мкМ. Крім того, вивільнення глутамату, викликане 1 мМ 4-амінопіридину в позаклітинному розчині, вільному від кальцію, що містить 300 мкМ етиленгліколю біс(-аміноетилового ефіру)-N,N,N/,N/-тетраоцтової кислоти (EGTA) становив 2.1 0.2 нмоль/мг/5 хв (F(2,12)=310.65, p=0.000),

і на цей Ca2+-незалежний компонент 4-вивільнення глутамату, викликаного амінопіридином, не впливав 20 мкМ ехінакозид (1,8 ± 0,2 нмоль/мг/5 хв; p {{1 0}}.58; Малюнок 1). У синаптосомах, оброблених 0.1 мкМ бафіломіцином А1, інгібітором везикулярного транспортера [26], 4-вивільнення глутамату, викликане амінопіридином, було значно знижено (2,2 ± 0.2 нмоль/мг/ 5 хв; F (2,12)=249.518, p=0.000). У присутності бафіломіцину А1 20 мкМ ехінакозиду не вдалося суттєво інгібувати вивільнення глутамату (2,1 ± 0,2 нмоль/мг/5 хв; р=0,94; рис. 1). Навпаки, 10 мкМ DL-трео-бета-бензил-оксиаспартату (DL-TBOA, інгібітор зворотного захоплення глутамату) [27] збільшив 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, до 11,8 ± 0,4 нмоль/мг/5 хв ( t(8)=-11.31, p=0.000). Навіть у присутності DL-TBOA 20 мкМ ехінакозиду істотно інгібував 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином (7,7 ± 0,2 нмоль/мг/5 хв; F(2,12)=87).23, p=0.000; Малюнок 1).

2.2 Ехінакозид знижує цитозольну концентрацію Ca2 плюс, але не змінює потенціал синаптосомної мембрани

Деполяризація синаптосом, спричинена 1 мМ 4-амінопіридину, збільшила концентрацію Ca2 плюс (p=0.000; таблиця 1). Застосування 20 мкМ ехінакозиду суттєво не вплинуло на базальну концентрацію Ca2 плюс (t(8)=0.06, p=0.95), але суттєво зменшило 4-індуковане амінопіридином збільшення Ca2 плюс концентрація (t(10)=6.16, p=0.000). Крім того, 1 мМ 4-амінопіридин збільшив флуоресценцію 3',3',3'-дипропілтіадикарбоціанін йодиду [DiSC3(5)] (p=0.000). Додавання 20 мкМ ехінакозиду не змінило мембранний потенціал спокою (t(8)=0.976, p=0.36) або суттєво змінило 4-опосередковане амінопіридином збільшення DiSC3 (5) флуоресценція (t(8)=-0.014, p=0.99; таблиця 1).

2.3 Зменшення надходження Ca2 плюс через канали Cav2.2 (N-тип) і Cav2.1 (P/Q-тип) може бути пов’язане з інгібуванням 4-вивільнення глутамату, викликаного амінопіридином, ехінакозидом

На малюнку 2 показано, що 2 мкМ о-конотоксину MVIIC, блокатора Ca2 плюс каналів N- і P/Q-типу, знижує 4-вивільнення глутамату, викликане амінопіридином, з 7,4 ± {{10}}. 2 до 2.0 ± 0.1 нмоль/мг/5 хв (t(9)=25.35, p=0.000). У присутності о-конотоксину MVIIC вплив 20 мкМ ехінакозиду на 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, був незначним (1.8 2± плюс 0,2 нмоль/мг/5 хв; t(8)=1.06,p=0.32). Дантролен (10 мкМ), інгібітор внутрішньоклітинного вивільнення Са з ендоплазми

ретикулуму [28], зменшене 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином (5,6 ± 0.3 нмоль/мг/5 хв; F(2,14) {{10}}. 95, p=0.000). Однак у присутності дантролену 20 мкМ ехінакозиду все ще може суттєво інгібувати вивільнення глутамату (3,3 ± 0,2 нмоль/мг/5 хв; p=0.000). Подібні результати спостерігалися при застосуванні 100 мкМ 7-хлоро-5-(2-хлорофені)-1,5-дигідро-4,1-бензотіазепіну -2(3H)-он (CGP37157), проникний для мембрани блокатор мітохондріального Na плюс /Ca2 плюс обміну. У п’яти досліджених синаптосомних препаратах 20 мкМ ехінакозиду в поєднанні зі 100 мкМ CGP37157 зменшували 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, на 48,3% ± 5,2% (F(2,13) ​​= 136).79, p {{ 49}}.000), подібно до інгібування одним ехінакозидом (46,2% ± 2,3%; p=0,89; рис. 2).

2.4 ЕхінакозидПригнічує 4-вивільнення глутамату, викликане амінопіридином, шляхом передачі сигналів через протеїнкіназу С

Як показано на малюнку 3, 10 мкМ 2-[1-(3-диметиламінопропіл)індол-3-іл]-3-(індол-3-іл) малеіміду (GF109203X), загальний інгібітор протеїнкінази С [29], зменшив 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{{17 }}). У синаптосомах, оброблених GF109203X, 20 мкМ ехінакозиду знижувало 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, лише на 5,5% ± 1,8% (p=0.89), менше, ніж при застосуванні ехінакозиду окремо (42,4% ± 2,3%). відсотків; p=0.000). Подібні результати були отримані з 5,6,7,13-тетрагідро-13-метил-5-оксо-12Н-індоло[2,3-а]піроло[3 ,4-c]карбазол-12-пропанітрил (Go6976), селективний щодо Са2 плюс -залежних ізоформ протеїнкінази С ( , I, II, y) [29]. У присутності 3 мкМ Go6976, 20 мкМ ехінакозиду знижували вивільнення глутамату на 11,9% ± 2,9% (p=0.59), що означає значне зниження порівняно з ехінакозидом окремо (42,4% 2,3%; p {{ 65}}.000; Малюнок 3). Навпаки, 3 мкМ роттлерину, Ca2 плюс -незалежного інгібітора протеїнкінази С6 [30], суттєво не змінив 4-амінопіридин (1 мМ) вивільнення глутамату (p=0.45). Тим не менш, у присутності роттлерину 20 мкМ ехінакозиду ефективно спричиняло середнє інгібування вивільнення на 37,1% ± 5,6% (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{88 }}), подібно до ехінакозиду окремо (p=0.41; рис. 3). Крім того, мітоген-активований інгібітор протеїнкінази 2-(2-аміно-3-метоксифеніл)-4H-1-бензопіран-4-он (PD98059 ) (50 мкМ) та інгібітор протеїнкінази А N-[2-(п-бромциннаміламіно)етил]-5-ізохінолінсульфонамід (H89) (100 мкМ) зменшили 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином (p=0.000). Навіть у присутності PD98059 або H89 20 мкМ ехінакозиду ефективно зменшувало вивільнення (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; рис. 3).

На рисунку 4 показано, що 1 мМ 4-амінопіридин збільшує фосфорилювання протеїнкінази С у синаптосомах (t(4)=-6.871, p=0.002). Коли синаптосоми попередньо обробляли 20 мкМ ехінакозидом протягом 10 хвилин перед додаванням 4-амінопіридину, 4-індуковане амінопіридином фосфорилювання протеїнкінази С значно зменшувалося (F(2,6)=29).202 , p=0.001).

2.5 Інгібування вивільнення глутамату, опосередковане ехінакозидом, не залучає рецептор гамма-аміномасляної кислоти типу А (GABAA).

На малюнку 5 порівнювали вплив ехінакозиду на 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, за відсутності або присутності SR95531 (антагоніста рецептора GABAA). Крім того, 100 мкМ SR95531 суттєво не змінило 4-амінопіридин (1 мМ) вивільнення глутамату. У синаптосомах, оброблених SR95531-, застосування 20 мкМ ехінакозиду призвело до 43-відсоткового інгібування 4-вивільнення глутамату, викликаного амінопіридином (F(2,12)=42).63, p { {18}}.000), яке суттєво не відрізнялося від інгібування, спричиненого одним ехінакозидом (40 відсотків; p=0.000). Подібний результат був отриманий з іншим антагоністом рецептора GABAA, бікукулліном (50 мкМ). Вивільнення, виміряне в присутності бікукуліну та ехінакозиду, суттєво відрізнялося від вивільнення, отриманого в присутності бікукуліну окремо (p=0.{000).

3. Обговорення

У цьому дослідженніехінакозид, активна сполука в HerbaЦистанхе, пригнічував 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, у нервових закінченнях кори головного мозку щурів. Можливі основні механізми дляехінакозид-опосередковане інгібування вивільнення глутамату додатково досліджується та обговорюється тут.

3.1 Механізми, що лежать в основі опосередкованого ехінакозидом інгібування вивільнення глутамату

Вивільнення глутамату, викликане 4-амінопіридином, складається з двох компонентів: фізіологічно значущого Ca2+-залежного компонента, який утворюється через екзоцитоз синаптичних везикул, що містять глутамат; і Са2 плюс -незалежний компонент, який виникає внаслідок тривалої деполяризації, що спричиняє опосередкований мембранним потенціалом зсув стаціонарного стану транспортера глутамату назовні, таким чином впливаючи на цитозольний витік глутамату [31]. Тут ми помітили, що ехінакозид суттєво не пригнічує 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, у присутності середовища, вільного від Са2 плюс (незалежне від Са2 плюс вивільнення). Крім того, спостережуване опосередковане ехінакозидом інгібування 4-вивільнення глутамату, викликаного амінопіридином, ефективно запобігалося бафіломіцином А1 (який зменшує вміст глутамату в синаптичних везикулах), але не DL-TBOA (який невибірково пригнічує всі збудливі амінокислоти транспортні підтипи). Ці результати свідчать про те, що ехінакозид впливає на Ca2+-залежний екзоцитоз вивільнення глутамату, не впливаючи на Ca2+-незалежний цитозольний витік глутамату через реверсію транспортера глутамату на плазматичній мембрані нервових кінцівок. У синаптичних терміналах інгібування каналу Na plus або активація каналу K plus стабілізує збудливість мембрани і, отже, зменшує викликаний вход Ca2 plus і вивільнення нейромедіатора [32,33]. Таким чином, потенційний механізм, що лежить в основі опосередкованого ехінакозидом інгібування вивільнення глутамату, включає зниження збудливості синаптосом. Однак ця можливість є неприйнятною на основі двох спостережень: (1) 4-деполяризація мембранного потенціалу, викликана 4-амінопіридином, виміряна за допомогою чутливого до мембранного потенціалу барвника DiSC3(5), не вплинула на додавання ехінакозиду; і (2) ехінакозид не впливав на 4-викликане амінопіридином Ca2 плюс -незалежне вивільнення глутамату, компонент вивільнення, який залежить лише від потенціалу мембрани [31]. Якщо ефект не викликаний пригніченням синаптосомної збудливості, він може проявлятися через зниження активності Cav2.2 (N-тип) і Cav2.1 (P/Q-тип) каналів Ca2 plus у поєднанні з глутаматним екзоцитозом у нервові закінчення [34–36]. Використовуючи фура-2, ми демонструємо, що ехінакозид значно зменшує 4-амінопіридин-підвищення концентрації Ca2 plus. Крім того, наші дані показують, що інгібуюча дія ехінакозиду на 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, зменшилася з 42,4% 2,3% до 12,1% 3,9% після впливу блокатора Cav2.2 (N-типу) і Cav2 .1 (P/Q-тип) Ca2 плюс канали. Крім того, ми помітили, що ехінакозид продовжував суттєво інгібувати 4-вивільнення глутамату, спричинене амінопіридином, у присутності внутрішньоклітинних інгібіторів вивільнення Са2 плюс. Ці результати вказують на те, що одночасне пригнічення Cav2.2 (N-типу) і Cav2.1 (P/Q-типу) Ca2 плюс активності каналів є потенційно механізмом, що лежить в основі опосередкованого ехінакозидом інгібування вивільнення глутамату. Однак комбінована активація Cav2.2 (N-тип) і Cav2.1 (P/Q-тип) Ca2 плюс активність каналів не може повністю блокувати дію ехінакозиду. Отже, інші неідентифіковані типи Ca2+ каналів або інші пресинаптичні шляхи можуть брати участь у гальмуванні. Наприклад, рецептори ГАМКА присутні на пресинаптичному рівні, і було показано, що їх активація пригнічує приплив Ca2 плюс і вивільнення глутамату [37]. У цьому дослідженні антагоністи ГАМК-рецепторів SR95531 і бікукулін не блокували опосередковане ехінакозидом інгібування вивільнення глутамату, що свідчить про те, що ГАМК-рецептори не беруть участь у зниженні вольтаж-залежної активності каналу Са2 плюс і в подальшому гальмуванні вивільнення глутамату. Надходження Ca2 plus через напругозалежні канали Ca2 plus активує кілька протеїнкіназ, пов’язаних із вивільненням глутамату в нервових закінченнях, включаючи протеїнкіназу, активовану мітогеном, протеїнкіназу C і протеїнкіназу A. Тут ми демонструємо, що інгібітори протеїнкінази C ефективно протидіють ехінакозиду. -опосередковане гальмування вивільнення глутамату; незважаючи на це, мітоген-активований інгібітор протеїнкінази PD98059 або інгібітор протеїнкінази А H89 виявилися неефективними. Крім того, 4-індуковане амінопіридином фосфорилювання протеїнкінази С зменшилося в синаптосомах після попередньої обробки ехінакозидом у концентрації, ефективній для інгібування вивільнення глутамату. Таким чином, сигнальний шлях інгібування вивільнення глутамату, опосередкованого ехінакозидом, може включати протеїнкіназу С. Протеїнкіназа С є важливою внутрішньоклітинною сигнальною системою, яка присутня на пресинаптичному рівні та відіграє вирішальну роль у екзоцитозі нейромедіаторів. Наприклад, кілька синаптичних білків, залучених до переміщення синаптичних везикул або рекрутингу та екзоцитозу, таких як мірістоїльований багатий на аланін субстрат C-кінази, фосфорилюються протеїнкіназою C [38,39]. Цей процес фосфорилювання може бути посилений деполяризаційним стимулюванням входу Ca2 plus, який полегшує вивільнення глутамату [40]. Отже, ми можемо обґрунтовано припустити, що спостережуваний тут інгібуючий ефект ехінакозиду на входження Ca2 plus може зменшити активність протеїнкінази С і, як наслідок, вивільнення глутамату.

Натисніть тут, щоб перейти до частини 2