ЧАСТИНА 1 Ехінакозид індукує вазорелаксацію легеневої артерії щурів, відкриваючи канали NO-cGMP-PKG-BKCa і знижуючи внутрішньоклітинні рівні Ca2 plus

Як ехінакозид викликає розслаблення вен?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Кафедра фармакології, Школа наук про життя та біофармацевтики, Шеньянський фармацевтичний університет, Шеньян 110016, Китай; 2 Дослідницький центр висотної медицини, Медичний коледж Цінхайського університету, Сінін 810001, Китай; 3 Фармацевтична школа Цинхайського університету для національностей, Сінін 810007, Китай; 4 Qinghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xining 810001, China

Мета:Стійке звуження легеневих судин, яке спостерігається на великій висоті, може призвести до легеневої гіпертензії (ЛГ). Основною метою цього дослідження є дослідження судинорелаксуючої діїехінакозид(ECH), фенілетаноїдний глікозид з тибетської трави Lagotis brevituba Maxim іЦистанка трубчаста, на легеневу артерію та її потенційний механізм.

Методи:Легеневі артеріальні кільця, отримані від самців щурів Вістар, підвішували в камерах органів, заповнених розчином Кребса-Гензеляйта, і ізометричний натяг вимірювали за допомогою датчика сили. Внутрішньоклітинні рівні Ca2 plus вимірювали в культивованих гладком’язових клітинах легеневої артерії щурів (PASMC) за допомогою Fluo 4-AM.

Результати: ECH(30–300 мкмоль/л) розслаблюють легеневі артерії щурів, які попередньо скорочуються норадреналіном (NE) залежно від концентрації, і цей ефект можна спостерігати як в інтактному ендотелії, так і в оголених ендотелієм кільцях, але зі значно нижчою максимальною відповіддю та вищий EC50 у оголених ендотелієм кільцях. Цей ефект значно блокували L-NAME, TEA та BaCl2. Однак IMT, 4-AP і Gli не пригнічувалиECH- викликана релаксація. У позаклітинних умовах без Са2 плюс максимальне скорочення було знижено до 24,54% ±2,97% і 10,60% ±2,07% у кільцях, оброблених 100 і 300 мкмоль/л ECH відповідно. В умовах позаклітинного надходження кальцію максимальне скорочення було знижено до 112,42% ±7,30%, 100,29% ±8,66% і 74,74% ±4,95% у кільцях, оброблених 30, 100 і 300 мкмоль/л ECH відповідно. Після завантаження клітин Fluo 4-AM середня інтенсивність флуоресценції була нижчою в клітинах, обробленихECH(100 мкмоль/л), ніж з NE.

Висновок: ECHпригнічує NE-індуковане скорочення легеневої артерії щурів через зниження внутрішньоклітинних рівнів Ca2 plus і індукує його розслаблення через шлях NO-cGMP і відкриття каналів K plus (BKCa та KIR).

Ключові слова:тибетська трава;ехінакозид; легенева гіпертензія; велика висота; розслаблення судин; НІ; BKCa; KIR; кільце артерії; гладком'язові клітини легеневої артерії.

Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola має багато ефектів, натисніть тут, щоб дізнатися більше

вступ

Стійке легеневе звуження судин, яке спостерігається на великій висоті, може призвести до легеневої гіпертензії (ЛГ) і медіальної гіпертрофії [1], які були визначені як основна причина гіпертрофії правого шлуночка та серцевої недостатності [2]. Особи, які живуть на великій висоті, тимчасово або постійно, можуть мати легеневу гіпертензію легкого або помірного ступеня, а ті, хто більш схильний до гіпоксії, можуть мати надмірне звуження легеневих судин, що призводить до різних високогірних захворювань, які пов’язані зі значною захворюваністю та смертністю, такими як висотний набряк легенів і серцеві захворювання[3].Ехінакозид(ECH) (Малюнок 1) є aфенілетаноїдний глікозидміститься в різноманітних китайських травах, таких як тибетська трава Lagotis brevituba Maxim іЦистанка трубчаста[4, 5]. Lagos brevituba Maxim є видом Lagotis spp, що належить до Scrophulariaceae і широко росте на висоті понад 3000 метрів на Цинхай-Тибетському плато.ECHмає різні бажані фармакологічні характеристики, такі як антиоксидантні, протизапальні, нейропротекторні, гепатопротекторні та властивості поглинання радикалів оксиду азоту (NO) [6]. Він також може викликати залежну від ендотелію релаксацію в кільцях грудної аорти щурів і лікувати серцево-судинні захворювання [7]. Однак, наскільки нам відомо, не було досліджень, які вивчали б його вплив на судинний тонус легеневих артерій. Цілі цього дослідження полягають у наступному: (1) дослідити, чи індукує ECH вазорелаксацію in vitro в легеневих артеріях щурів, попередньо скорочених норадреналіном (NE), і чи цей ефект, якщо такий є, є ендотелій-залежним або діє безпосередньо на гладкі м’язи судин ; (2) дослідити вплив ECH на позаклітинний приплив кальцію та внутрішньоклітинне вивільнення кальцію в гладком’язових клітинах легеневої артерії щурів (PASMC); і (3) для визначення можливих шляхів і каналів K plus, залучених до релаксації, викликаної ECH.

Матеріали та методи

Реагенти

ECH був люб'язно наданий доктором Пенг-фей TU з Пекінського університету (Пекін, Китай), з чистотою понад 98 відсотків, як визначено високоефективною рідинною хроматографією. Диметилсульфоксид (ДМСО) був придбаний у компанії Solar Science & Technology Co, Ltd (Пекін, Китай); NE, ацетилхолін (ACh, більше або дорівнює 99 відсоткам), індометацин (IMT), гідрохлорид метилового ефіру Nω-нітро-L-аргініну (L-NAME), хлорид тетраетиламонію (TEA), хлорид барію (BaCl2), {{ 9}}амінопіридин ({{10}}AP) і глібенкламід (Gli) від Sigma Chemical Co (Сент-Луїс, Миссурі, США); модифіковане середовище Ігла Дульбекко з високим вмістом глюкози (DMEM), ембріональна бичача сироватка (FBS) і трипсин від Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, США); мишаче антитіло проти первинного гладком'язового актину (-SMA) і козяче антимишаче вторинне антитіло від Boshide Biotech Co, Ltd (Ухань, Китай); Індикатори кальцію Fluo (Fluo 4-AM) від Invitrogen Corp (Карлсбад, Каліфорнія, США); і всі неорганічні солі від Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Пекін, Китай). IMT розчиняли в DMSO, а 5% NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM і ECH розчиняли в DMSO, а всі інші реагенти розчиняли в розчині Krebs-Henseleit (KH) або PBS. Попередні експерименти показали, що ДМСО в концентрації менше 0,1 відсотка (об./об.) не впливав на розвиток натягу ізольованих кілець легеневої артерії.

Піддослідні тварини

Усі процедури та протоколи були схвалені Комітетом з догляду та використання тварин Медичного коледжу Університету Цинхай. Самці щурів лінії Вістар віком 6–8 тижнів, масою тіла 250–300 г були придбані в Центрі тварин Університету Ланьчжоу (Ланьчжоу, Китай) і містилися на стандартній лабораторній дієті та водопровідній воді ad libitum при температурі навколишнього середовища 22± 2 градус і відносна вологість 45–55 відсотків протягом усього експерименту.

Перфузія легеневої артерії in vitro

Приготування кілець легеневої артерії щурів

Щурам вагою 250–300 г анестезували шляхом внутрішньоочеревинної ін’єкції пентобарбіталу натрію (40 мг/кг), а потім їхні серця та легені витягували та негайно занурювали в крижаний розчин KH, що містив (у ммоль/л) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 і 11,1 глюкози (pH 7,4). Внутрішньолегеневі артерії (діаметром 0,7–1,5 мм) розсікали без навколишньої сполучної тканини та адвентиції, а потім розрізали на кільця приблизно 2–3 мм завдовжки. Кільця підвішували в камерах органів, заповнених 10 мл розчину KH при 37 градусах і газували 95% O2–5% CO2 [8], і ізометричний натяг вимірювали за допомогою датчика сили (JH-2, Space Medico - Інженерний інститут, Пекін, Китай)

Оцінка активності судинного кільця та оцінка функції ендотелію

Судинні кільця залишали врівноваженим протягом 2 годин при базальному натягу 400 мг, протягом цього часу розчин KH змінювався кожні 15 хвилин; потім у камеру додавали 1 мкмоль/л NE для оцінки активності кожного кільця шляхом визначення відсотка скорочення. До і після експериментального протоколу вимірювали відсоток скорочення (рис. 2A і 2B). Ендотелій видаляли в деяких кільцях шляхом обережного тертя поверхні інтими тонким сталевим дротом, а цілісність оцінювали якісно за ступенем релаксації, викликаної ACh (10 мкмоль/л), у відсотках скорочувального тонусу, індукованого NE (1 мкмоль/л). Якщо релаксація за допомогою ACh була більше 80 відсотків, ендотелій залишався в хорошому стані; якщо розслаблення було менше 30 відсотків, ендотелій був зруйнований (рис. 2A і 2B) [9].

Виділення та культивування PASMC щурів

Дистальні легеневі артерії виділяли з легеневих часток щурів, а ендотелій і адвентицію обережно видаляли. Після того, як тканини подрібнювали на шматки розміром {{0}} мм, їх негайно додавали до колб, витримували при 37 градусах і 5% CO2 у зволоженому інкубаторі протягом приблизно чотирьох годин, а потім культивували з високим вмістом глюкози DMEM з додаванням 20% FBS, 100 ОД/мл пеніциліну та 100 ОД/мл стрептоміцину протягом приблизно п’яти днів. Половину культурального середовища замінили свіжим середовищем, коли з’явилися клітини. Коли клітини досягали 80% конфлюентності, їх збирали з 0,125% трипсину та висівали в колби (співвідношення 1:2), що містили DMEM з високим вмістом глюкози, доповненого 10% FBS, 100 ОД/мл пеніциліну та 100 ОД/мл стрептоміцину. . Для всіх експериментів використовували клітини з 3-8 пасажами.

Ідентифікація PASMC методом імуногістохімії

PASMC були позитивними для імунохімічного фарбування, коли спостерігалися типові ознаки «пагорба та долини». Клітини висівали в 6-лункові планшети зі скляними покривними скельцями. Коли клітини досягли 80-відсоткового злиття, їх фіксували в 4-відсотковому параформальдегіді, блокували 3-відсотковим перекисом водню протягом 15 хвилин, а потім інкубували з мишачими анти-щурячими первинними -SMA-антитілами протягом ночі при 4 градусах. Після тричі промивання в PBS протягом 10 хвилин клітини інкубували з козячим антимишачим вторинним антитілом при кімнатній температурі протягом 45 хвилин, знову промивали три рази в PBS протягом 10 хвилин і візуалізували діамінобензидином.

Виявлення внутрішньоклітинної концентрації кальцію в PASMC щурів

PASMC були висіяні в {{0}}лункові планшети зі скляними покривними скельцями. Коли клітини досягали 80 відсотків конфлюентності, культуральні середовища замінювали DMEM без сироватки. Через двадцять чотири години клітини завантажили 7 мкмоль/л Fluo 4-AM при 37 градусах протягом 30 хвилин у зволоженій атмосфері з 5% CO2. Залишок барвника промивали розчином збалансованого сольового розчину Хенкса (HBSS), який містив наступне (у ммоль/л): 1,26 CaCl2, 0.49 MgCl2·6H2O, 0.41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 і 5,56 D-глюкози, без фенолового червоного. Клітини, завантажені Fluo 4-AM, піддавалися одному з трьох умов лікування: (1) контрольна група (протигрупа), у якій клітини інкубували з DMEM без сироватки; (2) група NE, в якій клітини інкубували з DMEM, що не містить сироватки, з додаванням 1 мкмоль/л NE протягом 10 хвилин; та (3) група NE плюс ECH (100 мкмоль/л) (група NE плюс ECH100), у якій клітини інкубували з DMEM без сироватки, доданим 1 мкмоль/л NE протягом 10 хв та 100 мкмоль/л ECH протягом 20 хв. Інтенсивність флуоресценції спостерігали та фотографували за допомогою флуоресцентної мікроскопії (IX71, Olympus, Токіо, Японія) [11]. Для кожного зразка було зібрано шість полів зору (200×). Внутрішньоклітинну концентрацію кальцію кількісно визначали шляхом вимірювання середньої інтенсивності флуоресценції за допомогою програмного забезпечення Image Pro-Plus 6.0.

Статистичний аналіз

Дані були виражені як середнє ± SD. Коли відповідна, значуща різниця оцінювалася за допомогою тесту Даннета або тесту Стьюдента-Ньюмана-Кейлза для численних порівнянь після одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA). Рівень ймовірності P<0.05 was="" considered="">

Результати. Вазорелаксуючий ефект ЕХГ на ізольовану легеневу артерію

На початку експерименту кумулятивне додавання ЕХГ від 30 до 300 мкмоль/л не мало істотного впливу на базальний натяг легеневої артерії. Після того, як вазоконстрикція, викликана NE, досягла плато, ECH кумулятивно додавали (30–300 мкмоль/л) до інтактного ендотелію (E плюс, рис. 2C) або кільця, оголеного ендотелієм (E–, рис. 2C). У інтактних ендотеліальних кільцях кумулятивне додавання ECH розширювало судини залежно від концентрації, з максимальною

мам відсоток релаксації 89,22 відсотка ±0.32 відсотка при 300 мкмоль/л і EC50 51,60±0,57 мкмоль/л (рис. 2A і 2C). Подібним чином, у оголених ендотелієм кільцях ECH також розширював судини залежно від концентрації, але зі значно нижчою максимальною відповіддю 67,72% ±1,69% (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Вплив ECH на внутрішньоклітинне вивільнення кальцію та позаклітинний приплив кальцію

Оголені кільця ендотелію піддавали впливу 1 мкмоль/л NE до досягнення максимального скорочення. У позаклітинних умовах, вільних від Ca2 плюс, кільця були врівноважені в розчині KH, вільних від Ca2 плюс, що містив 0.2 ммоль/л EGTA перед початком експериментів. Після трьох промивань розчином KH, що не містить Ca2 plus - і EGTA, кільця попередньо інкубували з ECH (30, 100 і 300 мкмоль/л) протягом 20 хв, а потім повторно піддавали дії 1 мкмоль/л NE. Виготовлені кільця

нетривалі скорочення, які швидко повернулися до вихідного рівня, порівняно з початковими скороченнями, спричиненими NE, яка служила еталоном. Максимальне скорочення контрольної групи становило 33,27% ±2,94% (Рисунок 3A та 3E), але було значно знижено до 24,54% ±2,97% та 10,60% ±2,07% у кільцях, попередньо оброблених 100 та 300 мкмоль/л ECH, відповідно (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Роль різних інгібіторів у вазорелаксації легеневої артерії щурів, спричиненій ECH

Вазорелаксацію легеневої артерії щурів, спричинену ECH, досліджували за присутності або відсутності таких інгібіторів: L-NAME (інгібітор eNOS), IMT (інгібітор циклооксигенази), TEA (інгібітор каналу K plus з великою провідністю Ca2 plus), BaCl2 ( інгібітор K плюс каналу внутрішнього випрямляча), 4-AP (залежний від напруги K plus інгібітор каналу) та Gli (АТФ-чутливий K plus інгібітор каналу). Кільця були максимально скорочені при 1 мкмоль/л NE, а потім L-NAME (100 мкмоль/л), IMT (10 мкмоль/л), TEA (1 ммоль/л) додавали BaCl2 (1 ммоль/л), 4-AP (1 ммоль/л) або Gli (10 мкмоль/л) відповідно. Після досягнення нового плато ECH додавали кумулятивно від 30 до 300 мкмоль/л. Криві концентрація-відповідь у присутності різних інгібіторів показані на малюнку 4. Вазорелаксуючий ефект ECH на кільця легеневої артерії, скорочені 1 мкмоль/л NE, значно блокувався L-NAME (100 мкмоль/л), TEA ( 1 ммоль/л) і BaCl2 (1 ммоль/л) з максимальними релаксаціями 64,41% ±3,20%, 84,38% ±0,70% і 75,27% ±0,93% відповідно (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Ідентифікація PASMC щурів

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 відсотків) (Малюнок 6A). Пофарбовані в коричневий колір міофіламенти чітко спостерігалися в цитоплазмі при великому збільшенні (рис. 6B).

Цистанхеехінакозидможе протистоятиапоптоз

Вплив ECH на внутрішньоклітинну концентрацію кальцію в PASMC щурів

NE (1 мкмоль/л) значно підвищував внутрішньоклітинну концентрацію кальцію (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">