Частина 1: Карбамільований сортилін, пов’язаний із кальцифікацією серцево-судинної системи у пацієнтів із хронічною хворобою нирок

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Частина 1: Карбамільований сортилін, пов'язаний із серцево-судинною кальцифікацією у пацієнтів із хронічною хворобою нирок

Ключові слова: хронічні захворювання нирок, серцево-судинні, ниркові

Заява про переклад

Пацієнти зхронічні захворювання нирокдуже сприйнятливі до розвиткусерцево-судинноїзахворювання.Хронічна хвороба нирок-конкретнісерцево-судинноїФактори ризику досі переважно невідомі. Ми демонструємо, що циркулюючий сортилін посттрансляційно модифікується шляхом карбамілювання у пацієнтів зі зниженимниркафункція. Карбамілювання сортіліну призводить до вищої афінності зв’язування з інтерлейкіном-6 і сприяє артеріальній кальцифікації ex vivo. Крім того, карбамільований сортилін є фактором ризику наявності та прогресування кальцифікації коронарних артерій. Наші результати вказують на карбамільований сортилін як потенційну терапевтичну мішень для інгібіруваннясерцево-судинноїкальцифікація у хворих схронічні захворювання нирок.

вступ

Сортилін, внутрішньоклітинний рецептор сортування, був ідентифікований як aсерцево-судинноїфактор ризику в загальній популяції. Пацієнти зхронічнийнирказахворюваннядуже чутливі до розвитку серцево-судинних ускладнень, таких як кальцифікація. Проте специфічніхронічнийнирказахворювання-індуковані посттрансляційні білкові модифікації сортіліну та їх зв'язок зсерцево-судинноїкальцифікація залишається невідомою. Щоб дослідити це, ми перевірили два незалежниххронічнийнирказахворюваннякогорти для карбамілювання циркулюючого сортіліну та виявили збільшення залишків карбамільованого сортіліну лізину в позаклітинному домені сортіліну знирказниження функції за допомогою цільової мас-спектрометрії. Аналіз структури передбачив змінене зв’язування ліганду карбамільованим сортіліном, що було підтверджено дослідженнями зв’язування з використанням вимірювання поверхневого плазмонного резонансу, що показало підвищену спорідненість інтерлейкіну 6 до карбамільованого сортіліну in vitro. Крім того, карбамільований сортилін посилював кальцифікацію судин in vitro та ex vivo, що прискорювалося інтерлейкіном 6. Візуалізація за допомогою мас-спектрометрії кальцинованих артерій людини виявила in situ карбамільований сортилін. У пацієнтів зхронічнийнирказахворюваннякарбамілювання сортиліну було пов’язане з кальцифікацією коронарних артерій, незалежно від віку таниркафункція. Крім того, у пацієнтів із карбамільованим сортиліном спостерігалося значно швидше прогресування кальцифікації коронарної артерії, ніж у пацієнтів без карбамільованого сортиліну. Таким чином, карбамільований сортилін може бути фактором ризикусерцево-судинноїкальцифікації та може сприяти підвищеннюсерцево-судинноїускладнення у хворих нахронічнийнирказахворювання.

Цистанхеможна уникнутихронічнийнирказахворювання.

Приблизно 1 з 10 людей у ​​всьому світі відчуваєхронічнийнирказахворювання.1 Порушенняниркафункція є основним незалежним фактором ризику длясерцево-судинноїзахворюваності та смертності та смертності від усіх причин.1,2 Фактично, пацієнти зхронічнийнирказахворюваннянабагато більше шансів померти відсерцево-судинноїподій, ніж розвинути кінцеву стадію ниркової хвороби Q14, що потребує діалізу.3 Надмірне відкладення кальцинованих мінералів у судинній тканиніхронічнийнирказахворюванняпацієнтів сприяє в основному підвищеннюсерцево-судинноїризик.4хронічнийнирказахворюванняполегшує посттрансляційну модифікацію (PTM) білків.5 PTM, у свою чергу, були пов’язані зсерцево-судинноїкальцифікації,6 що свідчить про те, що краще розуміння PTM вхронічнийнирказахворювання-індуковані процеси кальцифікації можуть виявити нові терапевтичні цілі. Щоправда, досі специфічніхронічнийнирказахворювання-асоційовані модифікації білка, пов'язані зсерцево-судинноїкальцифікація невідома.

Сортилін є повсюдно експресованим членом сімейства внутрішньоклітинних рецепторів сортування вакуолярних білків 10. Це однопрохідний трансмембранний білок типу I, який відіграє різні ролі у сортуванні білків, транспортуванні та передачі клітинних сигналів. Як рецептор ендоцитозу, сортилін може ініціювати інтерналізацію лігандів з клітинної поверхні шляхом ендоцитозу та сортувати ліганди між внутрішньоклітинними компартментами, такими як транс-мережа Гольджі, ендосома, лізосома та секреторний шлях.8 Доклінічні дані in vivo свідчать про важливу роль сортилін у патогенезі судинних і метаболічних розладів через внесок у запалення артеріальної стінки та кальцифікацію, дисрегуляцію метаболізму ліпопротеїдів та цукровий діабет 2 типу, всесерцево-судинноїrisk factors.7 In human vascular smooth muscle cells (hSMCs), intracellular sortilin regulates the loading of the procalcific protein tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) into extracellular vesicles, thereby conferring the calcification potential that contributes to microcalcification formation.9 The ectodomain of plasma membrane-bound sortilin can be shed and secreted into the circulation.7 In a community-dwelling cohort of men aged >50 років ми повідомили про зв’язок високих рівнів сортіліну в сироватці крові з кальцифікацією аорти тасерцево-судинноїподії, що свідчить про сортилін як aсерцево-судинноїфактор ризику в загальній популяції.10 Роль сортіліну вхронічнийнирказахворювання, кількість пацієнтів із помітним збільшеннямсерцево-судинноїкальцифікація, продовжує заперечувати. Більшість досліджень зосереджено на функції клітинного сортіліну, а не на вивченні біологічної функції циркулюючої розчинної форми.7 Таким чином, досягнення кращого розуміння механічного зв’язку між циркулюючим сортіліном і регуляторним впливом ПТМ ухронічнийнирказахворюваннярозширить знання сортіліну всерцево-судинноїкальцифікація.

Це дослідження перевіряє гіпотезу про те, що PTM циркулюючого сортіліну бере участь у розвиткусерцево-судинноїкальцифікація у хворих схронічнийнирказахворювання.

користь цистанхеї: лікує хвороби нирок

МЕТОДИ

Серцево-судинніі нирковий результат вхронічнийнирказахворювання2–4 пацієнти – когорта четвертої оцінки Хомбурга (CARE FOR HOMe)

Дослідження CARE FOR HOME було детально описано раніше.11 Для аналізу було використано підгрупу з 97 пацієнтів.

Dan-NICAD 1 когорта

The study design of the Danish study of noninvasive testing in coronary artery disease (Dan-NICAD 1) trial has been described previously.12 For the analysis, we identified a subset of 97 enrolled patients with estimated glomerular filtration rate (eGFR) >60 мл/хв і виконували відповідність частоти на основі віку, статі, індексу маси тіла, статусу куріння, цукрового діабету тасерцево-судинноїзахворювання. Ідентифікацію проводили в сліпому вигляді щодо рівнів сортіліну.Серцево-судинніКогорта поглибленого оцінювання (CARVIDA) CARVIDA є піддослідженням німецькогоХронічнийниркаЗахворювання13. Були використані лише зразки пацієнтів із CARVIDA, включених у дослідження в Аахені, Німеччина (n=78). Комп’ютерну томографію проводили на КТ-сканері з подвійним джерелом (SOMATOM Definition Flash або Force; Siemens), як описано раніше.14 При середньому періоді спостереження 4,4 року 41 із 78 пацієнтів погодилися або були готові для другої комп’ютерної томографії. сканування під час другого візиту CARVIDA у 2019/ Q15 2020.

Статистичний аналіз

Дані експериментального дослідження представлені як середнє SD; n вказує на кількість незалежних експериментів або кількість пацієнтів. Нормальність перевіряли за допомогою критерію Шапіро-Вілка, а квантильний графік і неоднорідність дисперсії перевіряли за допомогою критерію Брауна-Форсайта. Для порівняння 2 груп було виконано парний або непарний 2-тест Стьюдента з рівними чи нерівними дисперсіями. Для порівняння між трьома групами лікування було проведено 1- або 2-аналіз дисперсії з подальшим постфактум Тьюкі для даних із нормальним розподілом і рівною дисперсією. Дані з викривленим розподілом оцінювали за допомогою тесту Краскела-Уолліса з наступним тестом Dunn post hoc. Дані з нерівними дисперсіями були перевірені за допомогою дисперсійного аналізу Велча з наступним тестом Dunnett T3 post hoc.

У клінічних дослідженнях безперервні дані представлені як середнє стандартне відхилення при нормальному розподілі або як медіана та інтерквартильний діапазон для змінних зі спотвореним розподілом. Категориальні дані представлені у відсотках. Критерій c2 Пірсона/Фішера використовувався для вивчення зв’язку між категоріальними змінними та непарним t-критерієм Стьюдента або U-тестом Манна-Уітні для безперервних змінних. Відмінності між 3 групами порівнювали за допомогою 1-дисперсійного аналізу з наступним тестом Sidak post hoc. Середні значення найменших квадратів, скориговані за багатофакторним числом карбамільованих залишків сортіліну, були розраховані за допомогою узагальнених лінійних моделей, як описано раніше.

Об’єм кальцифікації коронарної артерії (CAC) був перетворений у логарифм (тобто натуральний логарифм, ln; ln[CAC плюс 1]), щоб зменшити асиметрію. Двофакторну кореляцію оцінювали за допомогою Eta (1 номінальна змінна та 1 метрична змінна) або коефіцієнтів кореляції Пірсона (якщо обидві змінні були метричними). Зміна об’єму CAC за рік розраховувалась таким чином: [(контроль CAC – вихідний рівень CAC) / час спостереження в місяцях] * 12. Аналіз дисперсії зі зміною об’єму CAC як залежною змінною та терміном із фіксованим ефектом для карбамілювання (так проти ні) використовували для аналізу прогресування CAC. Крім того, ця модель була скоригована за допомогою аналізу коваріації для коваріатів CAC на базовому рівні Q18 і змінних. P < 0.05="" вважалося="" статистично="" значущим.="" статистичний="" аналіз="" проводили="" за="" допомогою="" graphpad="" prism="" (prism="" software="" inc.,="" версія="" 9)="" або="" spss="" (версія="">

Цистанхеможна покращитиниркафункції іхронічнийнирказахворювання.

РЕЗУЛЬТАТИ

Карбамільований сортилін підвищує снирказниження функції

Спочатку ми оцінювали рівні сортіліну в сироватці крові у пацієнтів зхронічнийнирказахворюванняз дослідження CARE FOR HOME11 і виявили підвищені рівні сортиліну порівняно з відповідною контрольною групою з нормальнимниркафункції з дослідження Dan-NICAD 1 (табл. 1). Циркулюючі білки схильні до ПТМ у пацієнтів зхронічнийнирказахворюванняQ20 .5 Таким чином, ми провели детальне картування залишків PTM циркулюючого сортиліну в учасників дослідження CARE FOR HOMe та здорових контрольних суб’єктів (додаткова таблиця S1) за допомогою MALDI-TOF/TOF MS. Порівняно з суб’єктами контролю,хронічнийнирказахворюванняпацієнти мали 8 із 30 залишків лізину, які були переважно карбамільовані у позаклітинному домені сортіліну (додаткова таблиця S3 Q21 та додатковий малюнок S1). Репрезентативні спектри MS від контрольного суб'єкта та пацієнта зхронічнийнирказахворюваннязображено на малюнках 1a і b. Специфічність сигналу була підтверджена спектрами MALDI-TOF/TOF-MS/MS (додатковий малюнок S2A). Кількісна оцінка виявила aхронічнийнирказахворюваннязалежне від стадії збільшення числа карбамільованих залишків (рис. 1c) та інтенсивності карбамільованих сортилінових пептидів (рис. 1d). Залишок лізину 205 був однаково модифікований у всіххронічнийнирказахворюваннястадії, тоді як залишки 95, 260 і 294 частіше модифікувалися на розвинутиххронічнийнирказахворюванняетапи (рис. 1e).

Далі ми оцінили зв’язок між карбамілюванням сортіліну та базовими характеристиками (додаткова таблиця S2) у дослідженні CARE FOR HOME. Ми спостерігали залежне від віку збільшення залишків карбамілювання сортіліну (табл. 2). Нижча функція нирок, виходячи з eGFR на основі сироваткового цистатину С і креатиніну (eGFRcys-область), а також більш високі рівні сечовини та N-кінцевого промозкового натрійуретичного пептиду (NT-proBNP) були пов’язані з вищими залишками карбамільованого сортиліну (таблиця 2). Асоціації залишалися значущими після поправки на вік і стать (табл. 2).хронічнийнирказахворюванняу пацієнтів, які приймали антагоністи альдостерону Q22, спостерігалося знижене карбамілювання сортиліну (таблиця 2), тоді як не було різниці в площі eGFRcys (ні, 50.6 23.2 мл/хв на 1,73 м2; так, 43.{{10}}.9 мл/хв на 1,73 м2; P=0.236) і сечовина (ні, 68.6 40.1 мг/дл; так, 72.{{21 }}.9 мг/дл; P=0,729) між пацієнтами з або без антагоністів альдостерону. Крім сечовини, мієлопероксидаза може опосередковувати карбамілювання білка всерцево-судинноїОднак ми не виявили зв’язку між загальними рівнями та активністю мієлопероксидази та карбамілювання сортиліну (додаткові малюнки S3A та B).

лікування захворювань нирок:Цистанхе

Крім того, ми оцінили присутність карбамільованого сортіліну в стегнових артеріях людини за допомогою візуалізації MS. Карбамільований пептид SEDYGK*NFK* (m/z 1172) був значно присутній у кальцифікованих стегнових артеріях зхронічнийнирказахворюванняпацієнтів і відсутній у некальцифікованих стегнових артеріях (рис. 1f). Спектри MS/MS підтримували ідентифікацію SEDYGK*NFK* (додатковий малюнок S2B). SEDYGK*NFK* розташований поблизу кальцифікованих ділянок у середній оболонці (рис. 1g). Навпаки, інтенсивність мас-сигналу не посттрансляційно модифікованого пептиду SEDYGKNFK (m/z 1086) була вищою в контрольних артеріях (рис. 1f).

Взяті разом, порівняно з контролем з нормоюниркафункції, хворі схронічнийнирказахворюваннямають вищі рівні сортиліну в сироватці крові та виявляють посттрансляційний карбамільований сортилін у кровообігу, який також можна виявити в судинній системі.

Карбамільований сортилін сприяє кальцифікації клітин гладкої мускулатури. Враховуючи наш висновок, що карбамільований сортилін локалізується в кальцифікованих областях, далі ми оцінили вплив карбамілювання сортиліну на кальцифікацію судин in vitro та ex vivo. Щоб визначити функціональну значущість карбамілювання сортиліну, ми індукували in vitro карбамілювання рекомбінантного сортиліну (SortCarb) за допомогою сечовини та виявили подібну картину залишків карбаміл-лізину, як виявлено у людей in vivo (додатковий малюнок S4A та додаткова таблиця S4). In vitro карбамілювання не змінювало цілісність білка SortCarb порівняно з контрольною макетною модифікацією (SortCo), як було оцінено за допомогою гель-електрофорезу та Вестерн-блот (додатковий малюнок S4B і C). Ні SortCo, ні SortCarb не виявили цитотоксичної дії на hSMC (додатковий малюнок S5A). SortCo та SortCarb були однаково захоплені hSMC (додатковий малюнок S5B). У кальцифікуючих hSMCs SortCarb індукував проостеогенні транскрипти ALPL (þ56 відсотків; P ¼ 0.039) і RUNX2 Q23 (þ25 відсотків; P ¼ 0.014; рис. 2a і b ), а також тканинну неспецифічну активність лужної фосфатази (þ46 відсотків; P ¼ 0,007; рис. 2c), порівняно з SortCo. На функціональному рівні SortCarb значно посилив кальцифікацію матриці (рис. 2d і e). Нарешті, на моделі культури органів ex vivo SortCarb посилив кальцифікацію в кільцях аорти щурів (рис. 2f і g).

користь цистанхеї: лікує хвороби нирок

Для продовження натиснітьтутдля частини 2.