Частина 1: Актеозид протидіє міжлейкін-1β-індукованим катаболічним процесам через модуляцію мітоген-активованих протеїнкіназ і NFκB клітинного сигнального шляху

Актеозид протидіє міжлейкін-1β-індукованим катаболічним процесам через модуляцію мітоген-активованих протеїнкіназ і NFκB клітинного сигнального шляху NFκB

Хьангі Лім ,1 До Кьон Кім ,1 Те-Хьон Кім ,1 Кьон-Рок Кан ,1 Чон-Йон Сео ,1,2 Сен Сік Чо ,3 Янгхі Юнь ,4,5 Є-йон Чой ,4,5 Юнгте Лім ,4,5 Хьон-Ву Кім ,6 Geon-Ung Jo ,6

Чан-Цзінь О ,6 Деук-Сіль О ,6 Хун-Сун Чун ,2 і Дже-Сун Кім 1

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com

1Інститут стоматологічної науки, Університет Чосун, Кванджу 61452, Республіка Корея

2Департаменти біомедичних наук, Університет Чосун, Кванджу 61452, Республіка Корея

3Відділ наук про біомедицину, здоров'я та конвергенцію життя, BK21 Four, Фармацевтичний коледж, Національний університет Мокпо,

Jeonnam 58554, Республіка Корея

4Чун-Йонський медичний інститут, Кванджу 61949, Республіка Корея

5Дослідження та розвиток Інституту розвитку, CY Pharma Co., Сеул 06224, Республіка Корея

6Jeollanamdo Інститут лісових ресурсів, Наджу, Джеолланамдо, 58213, Республіка Корея

Листування слід адресувати Дже-Сун Кіму; js_kim@chosun.ac.kr

Отримано 2 липня 2020 року; Переглянуто 15 лютого 2021 року; Прийнятий 6 березня 2021 року; Опубліковано 25 березня 2021

Академічний редактор: Жоель Р. Древет

Авторське право © 2021 Хянгі Лім та ін. Це стаття з відкритим доступом, поширена під ТворчимикомпонамиAttributionLicense,

що дозволяє необмежене використання, поширення,і відтворення в будь-якому середовищі за умови правильного цитування оригінального твору.

cistanche може лікувати захворювання нирок, покращувати функцію нирок

Остеоартроз (ОА) є найбільш поширеним дегенеративним захворюванням суглобів з хронічними болями в суглобах, викликаними прогресуючою дегенерацією суглобового хряща в синовіальних суглобах.Актеозид, каффеойлфенілетханоїдний глікозид, має різні біологічні дії, такі як протимікробну, протизапальну, протипухлинну, антиокислювальну, цитопротекторну та нейропротекторну дію. Далі, пероральний прийомактеозидпри високій дозуванні не викликає генотоксичності. Тому метою даного дослідження є перевірка антикатаболічних ефектівактеозидпроти остеоартриту і його антикатаболічного сигнального шляху.Актеозидне зменшив життєздатності клітин фібробласта миші L929, що використовуються як нормальні клітини і первинні хондроцити щурів.Актеозидпротидіяв втраті протеоглікану, індукованого ІЛ-1β, у хондроцитах та суглобовому хрящі шляхом придушення експресії та активації ферментів, що розщеплюють хрящі, таких як матрична металопротеїназа- (ММП-) 13, ММП-1 та ММП-3. Крім тогоактеозидпридушив експресію медіаторів запалення, таких як індукована синтаза оксиду азоту, циклооксигеназа-2, оксид азоту та простагландин Е2, у первинних хондроцитах щурів, оброблених ІЛ-1β. Згодом експресія прозапальних цитокінів зменшилася за рахунокактеозидв первинних хондроцитах щурів, оброблених ІЛ-1β. Більш того, актеозид придушував не тільки фосфорилювання мітоген-активованих протеїнкіназ в первинних хондроцитах щурів, оброблених ІЛ-1β, але і транслокацію NFκB з цитозольу в ядро шляхом придушення його фосфорилювання. Пероральне введення актеозиду 5 та 10 мг/кг послабило прогресуючу дегенерацію суглобового хряща в остеоартритичній моделі миші, породженій дестабілізацією медіального меніска. Наші висновки вказують на те, що актеозид є перспективним потенційним антикатаболічним агентом або доповненням для ослаблення або запобігання прогресуючої дегенерації суглобового хряща.

Будь ласка, натисніть тут, до частини 2

1. Вступ

Остеоартроз (ОА) - найпоширеніше дегенеративне захворювання суглобів з хронічними болями в суглобах, викликаними прогресуючою дегенерацією суглобового хряща в синовіальних суглобах [1].

У зв'язку зі збільшенням тривалості життя поширеність ОА з втратою рухливості і хронічними болями в суглобах, викликаними прогресуючою дегенерацією суглобового хряща в синовіальних суглобах, оцінюється в 18% і 9,6% у жінок після менопаузи і у чоловіків відповідно [2]. Хоча всесвітня поширеність ОА щорічно зростає, патофізіологічна етіологія ОА досі невідома. Це може бути викликано дуже складними та багатофакторними факторами ризику, такими як старіння, стать, генетичне успадкування, травматична травма суглобів та важке механічне навантаження на суглоб. Крім того, невідомі нейро- патологічні зв'язки між прогресуючою дегенерацією суглобового хряща і розвитком хронічного болю в суглобах [3]. Отже, метою клінічного лікування пацієнтів з ОА є підтримка рухливості тіла та механічної функції суглобів шляхом полегшення хронічного болю в суглобах, використання фармакологічних та нефармакологічних підходів та хірургії заміни суглобів. Зростає попит на розвиток ефективного втручання або доповнення з довгостроковою біологічною безпекою для запобігання або ослаблення ОА для підтримки якості життя за рахунок підтримки механічної функції суглобів у людей похилого віку.

Як показано на рисунку 1,актеозид(КАС No 61276-17-3; C29H36O15) — каффеойлфенілетаноїдний глікозид, виділений з декількох трав'яних рослин, таких як гормони Вербаскум [4], Buddleja globosa [5], і Plantago australis [6]. Актеоїд має різні біологічні дії, такі як протимікробний [5], протизапальний [7], протипухлинний [8], антиокислювальний [9], цитопротекторний [9], нейропротекторну дію [10]. Далі, пероральний прийомактеозидпри високому дозуванні не викликає генотоксичності[11].

Отже, ми висунули гіпотезу, що актеозид з протизапальною біологічною безпекою має антикатаболічні ефекти, пов'язані із захистом суглобового хряща від прогресуючої дегенерації суглобового хряща через придушення катаболічних факторів, таких як прозапальні цитокіни, медіатори запалення та ферменти, що деградують хрящі, у синовіальних суглобах. Тому метою цього дослідження було дослідитиактеозид-індуковані антикатаболічні ефекти та його клітинний сигнальний шлях як in vitro, з використанням первинних хондроцитів, виділених з суглобового хряща колінного суглоба щура, так і in vivo, використовуючи модель тварин ОА, породжену хірургічною дестабілізацією медіального меніска в колінному суглобі мишей.

актеозидВcistancheМожетеполіпшуватиІмунітет

2. Методи

2.1. Культура клітин.

Первинні хондроцити щурів були виділені з суглобового хряща щура (5-денного віку; Колінні суглоби Sprague-Daw- ley), відповідно до протоколу (CIA- CUC2019-A0027), затвердженого Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Чосун, Кванджу, Республіка Корея. Ізольовані первинні хондроцити щурів підтримувалися в модифікованій суміші середнього/поживної речовини Dulbecco Eagle's Medium/Nutrient F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rock-ford, IL, USA), доповненій 10% сироваткою великої великої рогатої худоби (FBS) (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), антибіотиками (50U/mL пеніциліну та стрептоміцином 50μg/mL) та 50 мкг/мл аскорбіновою кислотою. Звичайна клітинна лінія фібробласта миші L-929 була придбана в американській колекції культури типу (ATCC). Згідно з інструкцією, наданою від ATCC, клітини L-929 культивувалися в мінімально необхідному середовищі Орла, що містить 10% FBS, і вирощувалися в зволоженому інкубаторі при 37 °C з 5% CO2.

2.2. Аналіз життєздатності клітин.

Аналіз диметилтіазолілдилу дифенілтетразолієвої солі (МТТ) був проведений для оцінки життєздатності клітин клітини фібробластів миші L929 клітин, що використовуються як нормальна клітина, і первинних хондроцитів щурів, оброблених актеозидом. Коротко, що клітини L929 та первинні хондроцити щурів культивували при щільності клітин 8×105 клітин/мл у пластинах культури протягом 24 годин, а потім обробляли 2,5, 5, 10, 25, 50 та 100 мкМактеозидза 24 год. Після лікування розчином МТТ як клітини L929, так і хондроцити були додатково культивовані протягом 4 годин. Після інкубації утворені кристали МТТ були повністю зважені в диметилсульфоксиді і виміряні для поглинання на рівні 570 нм за допомогою спектрометра (спектрофотометр з мікропластинами Epoch, BioTek®, Winooski, VT, USA) для оцінки життєздатності клітин.

2.3. Клітинний живий/мертвий аналіз.

Виживання клітин проводилося з використанням пробірного набору Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), який складається з зеленого кальцеїну-AM для маркування живих клітин (із зеленою флуоресценцією) та ethidium homodimer-1 для маркування мертвих клітин (з червоною флуоресценцією). Коротко, як клітини L929, так і первинні хондроцити щурів культивувалися при щільності клітин 8×105 клітин/мл на камерних гірках (система Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™; Сігма- Олдріх; Merck KGaA) протягом 24 годин, а потім оброблений актеозидом 50 і 100 мкМ протягом 24 год. Після культивування проводився аналіз виживання клітин згідно з інструкцією виробника. Після цього фарбовані клітини були зображені за допомогою флуоресцентного мікроскопа (Eclipse TE200; Інструменти Никон, Мелвілл, Нью-Йорк).

2.4. Аналіз диметиленового синього (ДММБ).

Аналіз ДММБ проводився для оцінки зміни вмісту протеоглікану в первинних хондроцитах щурів, які отримували актеозид протягом 21 дня за наявності або відсутності ІЛ-1β. Для підтримки характеристик первинних хондроцитів щурів протягом 21 дня первинні хондроцити щурів (2×106 клітин) були звужені в 1 мл 1,2% альгінату, а потім інкапсульовані шляхом капання суспензії клітини/альгінату в розчин 105mM CaCl2. Первинні хондроцити щурів, інкапсульовані в альгінаті, культивувалися протягом 24 годин у DMEM/F12 (містять 10% FBS, 50U/mL пеніцилін, стрептоміцин 50 мкг/мл та 50 мкг/мл аскорбінової кислоти), а потім адаптувалися протягом 24 годин у DMEM/F12, що містить 1% міні-інсуліну–трансферин–селен (міні-ІТС) та 50 мкг/мл аскорбінової кислоти. Згодом хондроцити обробляли 50 або 100 мкМактеозидза наявності або відсутності 1нг/мл ІЛ-1β протягом 21 дня. На 21 день первинні хондроцити щурів були зібрані для оцінки вмісту протеоглікану за допомогою аналізу ДММБ, як описано раніше [12]. Крім того, для кількісної оцінки вмісту протеоглікану на одну клітину і оцінки проліферації первинних хондроцитів щурів, номери клітин вимірювалися за допомогою аналізу ДНК за допомогою PicoGreen (Молекулярні зонди, Карлсбад, СА), згідно з інструкцією виробника. наявність або відсутність 10нг/мл ІЛ-1β протягом 7 днів. В кінці періоду культури зразки були зібрані і зафіксовані в 4% параформальдегіді протягом 72 год для гістологічного аналізу.

2.6. Гістологічний аналіз.

Гістологічний аналіз з використанням сафраніну-О та швидке зелене фарбування було проведено для перевірки втрати протеоглікану в суглобовому хрящі, обробленому актеозидом 100 мкМ за наявності або відсутності 10ng/мл IL-1β протягом 7 днів. Коротко, зафіксовані суглобові зразки хряща були декальцифіковані в етилендіамінтетраоцтової кислоти, а потім вбудовані в парафін. Після цього підготовлені парафінові блоки, що містять суглобовий хрящ, серійно нарізали до товщини 5 мкм і поміщали на гірки. Згодом було виконано сафранін-О і швидке зелене фарбування для оцінки втрати протео- глікану в суглобовому хрящовому ґрунтовому речовині. Крім того, було проведено фарбування гематоксиліну і еозину для спостереження загальної морфології суглобового хряща.

2.7. Західний блотинг.

Західний блотинг був виконаний для дослідження експресії катаболічних факторів, включаючи ММП-13, ММП-1, ММП-3, індуковану синтазу оксиду азоту (iNOS) і циклооксигеназу-2 (ЦОГ-2) і зміну клітинних сигнальних молекул, таких як мітоген-активовані протеїнкінази і ядерний фактор-каппа В (NFκB). Коротко первинні хондроцити щурів лікувалися актеозидом 50 або 100 мкМ за наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 24 год. Після цього первинні хондроцити щурів були зібрані шляхом центрифугування і були лізовані за допомогою буфера лізису (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) згідно з інструкцією виробника. Крім того, для перевірки ядерної транслокації NFκB первинні хондроцити щурів лікувалися актеозидом 50 або 100 мкМ за наявності або відсутності 10нг/мл IL-1β протягом 24 год. Після цього цитозольна і ядерна фракції були витягнуті з використанням ядерних і цитоплазматичних екстракційних реагентів NE-PER™ Nuclear і Цитоплазматичної екстракції (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, USA) згідно з інструкцією виробника. Концентрація загального білка, витягнутого з первинних хондроцитів щурів, визначалася за допомогою набору для аналізу білка біцинхонінової кислоти (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) згідно з інструкцією виробника. Крім того, було зібрано умовне середовище для виявлення рівнів ферментів, що розщеплюють хрящі, що виділяються з хондроцитів. Рівні кількості білка і умовного середовища електрофорезувалися на додецилсульфат-поліакриламідному гель-електрофорезі натрію (SDS-PAGE), а потім переносилися на нітроцелюлозні мембрани. Після цього західний блотинг був виконаний з використанням цільових первинних протиорганів проти ММП-13, ММП-1, ММП-3, iNOS, COX-2, фосфо-ERK1/2, total-ERK1/2, фосфо-р38, total-p38, фосфо-JNK, total JNK, фосфо-NFκB, total NFκB, total NFκB, β-актину, і ламіну B. Імунореактивні смуги були візуалізовані за допомогою посиленої системи хемілюмінесценції (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, USA) згідно з інструкцією виробника, а потім зображені приладом Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Єрусалим, Ізраїль).

2.8. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція (qPCR) та кількісна ПЛР у реальному часі (qRT-PCR).

Первинні хондроцити щурів лікувалися 50 або 100 мкМактеозидза наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 24 год. Після цього загальна РНК була виділена з первинних хондроцитів щурів за допомогою реактиву TRIzol (Інвітроген, Карлсбад, СА, США) згідно з інструкцією виробника. Загальна концентрація РНК була виміряна за допомогою NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, США). Для синтезу cDNA РНК 1 мкг була зворотно транскрибована за допомогою системи термоскрипції-ПЛР (Invitro- gen, Carlsbad, CA, USA) згідно з інструкцією виробника. qPCR cDNA виконувався з використанням 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Сеул, Республіка Корея) і специфічних праймерів на термоциклерному пристрої TAKaRa PCR (TaKaRa Bio Inc., Шига, Японія). Після цього продукти ПЛР були електрофорезовані на агарозному гелі для визначення рівнів експресії генів-мішеней. Гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназа (GAPDH) застосовувався в якості ендогенного контролю. Крім того, для qRT-PCR cDNA посилили за допомогою ПЛР-системи Eco™ Real-Time (illumine Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). β-Актин використовувався в якості ендогенного контролю. Послідовності праймерів, що використовуються в qPCR і qRT-PCR, зведені в таблиці 1 і 2 відповідно.

2.9. Желатинова зимографія.

Желатинова зимографія проводилася для оцінки активації ММП в первинних хондроцитах щурів. Коротко первинні хондроцити щурів лікувалися актеозидом 50 або 100 мкМ за наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 24 год. Після цього рівний об'єм умовного середовища був електрофорезований на 10% поліакриламідному гелі, сополімерованому з 0,2% (1 мг/мл) свинячим желатином шкіри. Після електрофорезу гель інкубували в буфері ренатурації зимо- грама (50мМ Tris–HCl (рН7,6), 10мМ CaCl2, 50мМ NaCl і 0,05% Brij-35) при 37°C протягом 72 год. Після ренатурації ММП гель був пофарбований 0,1% Coomassie Brilliant Blue R250. Желатинолітичні смуги були розкриті у вигляді чітких смуг на фоні, рівномірно забарвленому світло-синім кольором, а потім зображені за допомогою цифрової камери.

2.10. Вимірювання оксиду азоту (NO).

Первинні хондроцити щурів лікувалися актеозидом 50 або 100 мкМ за наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 24 год. Після цього 50 мкл умовного середовища було прореаговано по 50 мкл сульфаніламіду та N-1-нафтил-етилендіаміну дигідрохлориду. Потім абсорбцію вимірювали на довжині хвилі 540 нм за допомогою спектрофотометра (спектрофотометр Епохи, БіоТек, Віноскі, ВТ, США).

2.11. Аналіз простагландину Е2 (ПГЕ2).

Первинні хондроцити щурів лікувалися 50 або 100 мкМактеозидза наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 24 год. Після цього концентрація PGE2 вимірювалася за допомогою пробірного набору параметрів PGE2 (R&D Systems Inc., Міннеаполіс, MN, США) згідно з інструкцією виробника.

2.12. Цитокіновий масив.

Первинні хондроцити щурів лікувалися актеозидом 50 мкМ за наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 24 год. Після цього загальна кількість білків була витягнута і кількісно оцінена, як було описано раніше [13]. Далі був виконаний цитокіновий масив для дослідження зміни у виробництві цитокінів, згідно з інструкціями виробника (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA).

2.13. Ядерний транслокаційний аналіз.

Первинні хондроцити щурів лікувалися 50 і 100 мкг/млактеозидпри наявності 10нг/мл ІЛ-1β. Через 30 хв первинні хондроцити щурів фіксували 1% параформальдегідом, пермеабілізували в 0,2% тритона Х-100, і широко промивали фосфатно-буферним фізіологічним розчином. Неспецифічні сигнали блокувалися за допомогою звичайної козячої сироватки. Після багаторазових промивань хондроцити інкубували антитілами проти NFκB кроликів з подальшою інкубацією козячого антикролячого IgG, що кон'югується FITC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) протягом ночі при 4 °C. Після цього фарбовані клітини були зображені за допомогою лазерної конфокальної скануючої системи мікроскопів (Leica Microsystems, Wetzlar, Німеччина) у філії Кванджу Корейського інституту фундаментальних наук (Кванджу, Республіка Корея).

2.14. Покоління остеоартритичних тварин.

Для генерації остеоартритичних тварин медіальний меніск (DMM) був хірургічно дестабілізований в колінних суглобах мишей BALB/c (середня маса тіла 19:3±0:5g) відповідно до рекомендацій IACUC (CIACUC2019-A0029). Тварин, індукованих ОА, лікували перорально 5 та 10 мг/кг актеозиду, розчиненим у 5% етанолі (експериментальна група; n =5) або транспортному засобі (5% етанолу) (група DMM; n =5) через день протягом 8 тижнів. В кінці вегетаційного періоду колінні суглоби були розсічені і зафіксовані за допомогою 5% параформальдегіду протягом 7 днів для виконання гістологічних оцінок. Після сафраніну-О і швидкого зеленого фарбування були досліджені зображені тканини суглобового хряща відповідно до класу Манкіна [14, 15].

2.15. Статистичний аналіз.

Експериментальні дані представлені як середнє ± стандартне відхилення і порівнювалися за допомогою аналізу дисперсії, з подальшим пост-хок множинними порівняннями (тест Тукі) з використанням програмного забезпечення SPSS версії 25 (IBM Corp.) Всі дані, крім дослідження на тваринах, були отримані в результаті трьох самостійних експериментів.

актеозидВcistanche

3. Результати

3.1. Актеозид не впливає на життєздатність клітин L929 і первинних щурячих хондроцитів.

Клітинна лінія фібробласта миші L929, яка використовувалася як звичайні клітини, оброблялася актеозидом 2,5, 5, 10, 25, 50 і 100 мкМ протягом 24 годин. Після цього був проведений аналіз MTT для оцінки цитотоксичності актеозиду на клітинах L929. Як показано на рисунку 2(а), відносна життєздатність клітин L929 була визначена як 94:8±8%, 93:6±7%, 100 ± 5%, 103:9± 5%, 126:1±8%, і 122:7±4% при 2,5, 5, 10, 25, 50 і 100 мкМ актеозиду відповідно порівняно з контролем (100:02 ± 3%). Крім того, для перевірки цитотоксичності актеозиду на первинних хондроцитах щурів був проведений аналіз МТТ, як показано на рисунку 2(b). Життєздатність первинних хондроцитів щурів, які отримували 2,5, 5, 10, 25, 50 і 100 мкМ актеозиду, визначалася як 114 ± 4%, 117:8±6%, 123:9± 5%, 132:6±4%, 153:1± 7% і 142:1±6% відповідно в порівнянні з контролем (100:4±5%). Крім того, для підтвердження впливу актеозиду на життєздатність як клітин L929, так і первинних хондроцитів щурів, був проведений аналіз Cell Live/Dead, як показано на рисунку 2(c). Кількість мертвих клітин, забарвлених у вигляді червоної флуоресценції, не збільшувалася як для клітин L929, так і для первинних хондроцитів щурів, оброблених актеозидом 50 і 100 мкМ протягом 24 годин. Ці дані послідовно демонстрували, що визначається дозуванняактеозидне вплинула на життєздатність клітин L929 і первинних хондроцитів щурів. Таким чином, 50 мкМ актеозиду та актеозиду 100 мкМ, які є нетоксичними дозами як у клітинах L929, так і в первинних хондроцитах щурів, були використані для перевірки його антикатаболічного впливу in vitro-досліджень з використанням первинних хондроцитів щурів.

3.2. Актеозид протидіє ІЛ-1β-індукованій втраті протеоглікану в первинних хондроцитах щурів.

Первинні хондроцити щурів, вбудовані в альгінатні намистини, лікувалися актеозидом 50 і 100 мкМ за наявності або відсутності 1нг/мл ІЛ-1β протягом 21 дня. Після цього був проведений аналіз DMMB для оцінки зміни вмісту протеоглікану, як показано на рисунку 3(a). Відносний вміст протеоглікану визначали як 88:3±18:1% і 86:8±16:3% у первинних хондроцитах щурів, які отримували актеозид 50 і 100 мкМ відповідно, порівняно з контролем (103:8±32:3%). Хоча відносний вміст протеоглікану зменшувався актеозидом, ці результати не були значними. Однак відносний вміст протеоглікану значно знизився на 37:1± 14:7% в первинних хондроцитах щурів, оброблених 1нг/мл ІЛ-1β, але актеозид 50 і 100 мкМ значно знизив вміст протеоглікану на 57 ± 12:4% і 64 ± 14:5% відповідно за наявності 1ng/мл IL-1β. Згодом, щоб перевірити, чи пригнічує актеозид втрату протеоглікану, індуковану ІЛ-1β, суглобовий хрящ, розсічений з суглобових суглобів щурів, лікували актеозидом 100 мкМ за наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 7 днів. Після цього гістологічні оцінки з використанням фарбування H&E і сафраніну-О і швидкого зеленого фарбування були виконані, як показано на рисунку 3(b). Морфологічна зміна не спостерігалася за допомогою фарбування H&E; однак сафранін-О і швидке зелене фарбування показали, що протеоглікан, забарвлений як червоний колір, не змінився в суглобових хрящах, оброблених актеозидом 100 мкМ в порівнянні з тим, що знаходиться під контролем. Однак важка втрата протеоглікану була викликана 10ng/mLIL-1β в суглобовому хрящі, а актеозид 100 мкМ значно придушив втрату протеоглікану в суглобовому хрящі, обробленому 10нг/мл IL- 1β. У сукупності ці дані послідовно показують, що актеозид має антикатаболічний ефект, який затримує дегенерацію суглобового хряща за допомогою протидії втраті протеоглікану, індукованого ІЛ-1β.

актеозидВcistancheдобре впливають наАнтиоксидант

3.3. Актеозид має антикатаболічну дію, що пригнічує експресію ММП та активацію в первинних хондроцитах щурів, що лікуються ІЛ-1β.

Щоб дослідити, чи пов'язаний актеозид-індукований антикатаболічний ефект з пригніченням експресії та активації ММП, первинні хондроцити щурів лікувалися актеозидом 50 та 100 мкМ за наявності або відсутності 10нг/мл ІЛ-1β протягом 24 год. Після цього були досліджені зміни в ММП. Як показано на рисунку 4(а), хоча експресія ферментів, що деградують хрящі, таких як ММП-13, ММП-1 і ММП-3, була значно підвищена в обумовлених середовищах первинних щурячих хондроцитів, оброблених 10нг/мл ІЛ-1β, вона була знижена наактеозиду дозозалежному порядку. Крім того, результати як qPCR (рис. 4(b)), так і qRT-PCR (рис. 4(с)) показали, що ІЛ-1β значно підвищив рівень мРНК ММП, таких як ММП-13, ММП-1 і ММП-3 в первинних хондроцитах щурів. Однак вони знизилися дозозалежно в первинних хондроцитах щурів, які отримували актеозид 50 і 100 мкМ. Крім того, актеозид 50 і 100 мкМ ефективно придушував активацію ММП в первинних хондроцитах щурів, оброблених 10нг/мл ІЛ-1β (рис. 4(d)). У сукупності ці дані послідовно вказують на те, що актеозид має антикатаболічну дію, яка пригнічує експресію та активацію ферментів, що деградують хрящі.