Паразити, інфекції та інокуляція в синтетичних мінімальних клітинах

АНОТАЦІЯ: Синтетичні мінімальні клітини забезпечують керовану та розроблену модель біологічних процесів. Хоча синтетичні клітини набагато простіші за будь-яку живу природну клітину, вони пропонують основу для дослідження хімічних основ ключових біологічних процесів. Тут ми показуємо синтетичну клітинну систему з клітинами-господарями, які взаємодіють з паразитами та зазнають інфекцій різного ступеня тяжкості. Ми демонструємо, як господаря можна сконструювати так, щоб він протистояв інфекції, ми досліджуємо метаболічні витрати на носіння резистентності та демонструємо щеплення, яке імунізує господаря проти патогенів. Наша робота розширює інструментарій синтетичної клітинної інженерії, демонструючи взаємодію між господарем і патогеном і механізми набуття імунітету. Завдяки цьому синтетичні клітинні системи на крок наближаються до повної моделі складного природного життя.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

ВСТУП

Протягом останніх кількох десятиліть галузь синтетичної біології вибухнула, дозволяючи будувати синтетичні клітини, які нагадують і моделюють аспекти природного біологічного життя. Моделювання клітинних шляхів і поведінки в синтетичних клітинах пропонує багато переваг перед живими клітинами, такі як більш спрощене та визначене реакційне середовище, повний контроль над протеомним і хімічним складом клітини, здатність розділяти заважаючі біологічні шляхи та процеси, а також підтримувати важливі біологічні системи, які відсутні в реакційних системах in vitro.1,2 Ці унікальні активи технологій синтетичних клітин вже дозволили моделювати біологічні умови та шляхи в реальному біореакторі in vitro (синтетична клітина) і принесли краще розуміння багато областей дослідження, включаючи молекулярне скупчення3, ліпідно-білкову динаміку4, мінімальний метаболізм5 та багато інших важливих аспектів біологічного життя.2 Ці схожі на життя синтетичні клітини з їх унікальними властивостями швидко стають кращими моделями та проливають більше світла на таємнича внутрішня робота клітинного життя.6,7 Ці прориви не обмежуються одноклітинними процесами; інженерна взаємодія між популяціями ліпосом також виявилася потужною технологією. Наприклад, дизайн синтетичної клітинної системи, яка імітує зв’язок хижак–жертва, був розроблений із використанням світла як сигналу між цими популяціями синтетичних клітин.8 Було розроблено іншу складну роботу, яка дозволяє поширювати сигнал у матриці крапель синтетичної клітини, дозволяючи флуоресценції просторово поширюватися серед популяції.9 Окрім взаємодії синтетична клітина–синтетична клітина, останнім часом також були досягнуті досягнення в інтерфейсах синтетична клітина–жива клітина. Наприклад, було показано, що синтетична клітина, призначена для взаємодії з нервовою стовбуровою клітиною, здатна індукувати нейронну диференціацію, а також діяти як узагальнене шасі, здатне взаємодіяти з іншими типами клітин.10 У розробці було досягнуто незліченних успіхів. розповсюдження сигналу та синтетичних клітин, що діють як інтерфейси, багато з яких досліджено в наступних оглядах.11−13 Коротше кажучи, існують цілі галузі досліджень, пов’язаних із імітацією взаємодії клітинних популяцій у модельній системі синтетичних клітин. Незважаючи на це, не було досліджень, які б використовували синтетичні клітини для моделювання інфекції, паразитизму або щеплення. Так само, як синтетичні клітини зазвичай використовуються для моделювання складних біологічних процесів у спрощений і контрольований спосіб, існує потенціал для моделювання цих складних міжорганізмових взаємодій. Важливість цього можна побачити в новаторському дослідженні, яке успішно виробило активні фагові частинки на безклітинній платформі експресії білка.14 Ми прагнемо вивести цю концепцію на макрорівень, розробляючи синтетичні популяції клітин, які можуть активно інфікувати одна одну та захоплювати геном клітини-господаря, як це роблять живі віруси та паразити. Можливість застосувати та сконструювати синтетичні клітини для моделювання поведінки цих захворювань стане цінним інструментом для наукової спільноти.

У цій роботі ми демонструємо нашу систему для моделювання захворювань синтетичних клітин. Ми сконструювали клітину-господаря, яка могла б піддаватися інфікуванню від другої популяції паразитичних синтетичних клітин, і досліджували конкуренцію ресурсів, захоплення генома та метаболічне перепрофілювання, що відбувається під час такої інфекції. Ми також моделюємо метод, який дозволяє врятувати хазяїна після інфікування, а також засіб інокуляції, який дозволить хазяїну протистояти зараженню синтетичних клітин, що викликають хворобу. Коротше кажучи, ми представляємо шасі моделі нової хвороби та інфекції для синтетичних клітин. За допомогою цієї технології синтетичні клітини можуть почати використовуватися як рудиментарні моделі для хвороб, інфекцій та інокуляції (рис. 1).

Рисунок 1. Паразити, інфекції та система інокуляції в синтетичних мінімальних клітинах. (a) «Хазяїн» — це синтетична клітина, що експресує зелений флуоресцентний білок (GFP). На поверхні зовнішньої мембрани господар несе мітки оцДНК. Єдині білки, які транслюються у здорового господаря, — це власні білки господаря з плазмід, за допомогою яких був створений господар. (b) «Паразит» — це ліпосома, наповнена плазмідною ДНК, що кодує ген флуоресцентного білка mCherry, а поверхня ліпосоми паразита прикрашена міткою ssDNA (комплементарною мітці на поверхні господаря). «Інфекція» починається зі злиття ліпосом хазяїна та паразита за допомогою комплементарних ДНК-міток на їх поверхні. Після інфікування господар експресує як оригінальний ген господаря (GFP), так і ген паразита (mCherry). (c) «Інфекція» починається з «патогенних» ліпосом, що несуть ген для рестриктази MunI, злитої з ліпосомами господаря. Ген збудника MunI експресується хазяїном, а фермент рестрикції MunI розщеплює ДНК господаря. Це призводить до того, що нативний геном хазяїна перетравлюється, перетворюючи більшу частину експресії білка хазяїна з GFP на білок, кодований патогеном, MunI. (d) «Летальна інфекція» — це злиття ліпосоми хазяїна (з геномом GFP) з ліпосомою збудника, що містить ген, що кодує aHL, мембранний білок. Після зараження хазяїн експресує aHL, що створює мембранні пори, що спричиняє витік поживних речовин хазяїна та фактично припиняє метаболізм хазяїна. (e) «Імунізація» — це інкубація хазяїна з оцДНК, що містить послідовність, сумісну з мітками злиття на поверхні ліпосом хазяїна. Імунізуюча ДНК створює дуплекс із мітками ДНК господаря, запобігаючи гібридизації інших олігонуклеонів ДНК із цими мітками. Це запобігає злиттю будь-яких патогенних ліпосом з господарем. Це цифра для підтвердження концепції, а графіки наведені з метою ілюстрації, вони представляють відносну кількість білка, що виділяється хазяїном і різними патогенами. Реальні дані для кожної системи наведені на наступних малюнках.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

У цій роботі ми використовуємо слова: хазяїн, паразит, інфекція, смертельний, вакцина та щеплення – все це в контексті неживих, синтетичних клітинних систем. Під «смертельною» інфекцією ми маємо на увазі помітне зниження трансляції в популяції синтетичних клітин. Усі експерименти в цій роботі проводилися на синтетичних клітинах, які не є живими, не самовідтворюються та не еволюціонують. Це модель системи природних біологічних властивостей і процесів.

Переваги доповнення cistanche - підвищення імунітету

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Зараження синтетичної клітини паразитичною синтетичною клітиною захоплює ресурси господаря.

Щоб перевірити концепцію синтетичної клітинної системи, що імітує інфекцію, ми почали з побудови модельної системи для паразита. Ми використали найпростішу концепцію паразита, яку можна відтворити в цій неживій біохімічній системі: паразит, який захоплює деякі ресурси хазяїна. У цьому випадку метаболізм хазяїна представлений експресією білка GFP, а паразит представлений експресією білка mCherry. Для цієї системи ми використали раніше продемонстроване явище виходу лінійної експресії білка, що залежить від концентрації матриці ДНК у TxTl.15,16 Спочатку ми вирішили знайти оптимальну загальну концентрацію плазміди, при якій співвідношення GFP та ДНК mCherry відповідає співвідношення спостережуваної флуоресценції цих білків. Ми довільно призначили ген GFP «господарем», а ген mCherry — «паразитом». Ці назви не означають нічого особливого в цьому конкретному експерименті, але вказуватимуть на хазяїна та паразита в наступних експериментах із синтетичними клітинами. Тут ми використовуємо ці назви, щоб легше було пов’язати ці експерименти з підтвердження концепції з подальшими експериментами із синтетичним зараженням клітин з використанням тих самих плазмід. Ми змішали плазміди GFP і mCherry, з обома генами під контролем промотору T7 при різних співвідношеннях плазмід і загальній концентрації плазмід у зразках 1, 5, 10 або 15 нМ (рис. 2b). Результати відповідали очікуваній майже лінійній залежності між концентрацією плазміди та зареєстрованою інтенсивністю флуоресценції, причому найкраща відповідність між співвідношеннями флуоресценції та концентрації плазміди спостерігалася при загальній кількості плазміди 10 нМ. Спостережуваний зв’язок вказує на те, що плазміди, протеїни з однаковими розмірами та амінокислотним складом (рис. S1), конкурують за один і той самий пул ресурсів TxTl для своєї експресії. Зміна відносної концентрації двох плазмід призводить до змін ефективності експресії, приблизно пропорційних співвідношенню плазмід. Це вказує на те, що це була б хороша модель для імітації паразитарної інфекції: геном паразита (плазміда mCherry) конкуруватиме з геномом господаря (плазміда GFP). Далі ми вирішили перевірити випадок, коли будь-яка з плазмід перебувала під контролем більш сильного промотора, таким чином імітуючи сценарій упередженого розподілу ресурсів. Щоб зберегти аспект конкуренції ресурсів у майбутніх експериментах із зараженням «паразитами», ми тримали обидва гени під одним промотором РНК-полімерази (РНК-полімераза T7, T7 RNAP), але змінювали його силу. Ми використали сильний промотор T7 RNAP T7Max, який демонструє значно вищий вихід транскрипції, що призводить до відповідно вищих результатів трансляції, у TxTl.17 Ми перевірили установку реакції, ідентичну описаній раніше: дві плазміди в різних співвідношеннях, протестовані при змінній кінцевій сумі концентрації плазмід. Одна з плазмід була під контролем сильного промотора T7Max, тоді як інша була під контролем канонічного промотора T7. В обох тестових випадках експресія плазміди T7Max була достатньо сильною, щоб флуоресценція білка з гена під T7Max суттєво не зросла зі збільшенням загальної концентрації плазміди (рис. 2c, 2d). Здається, не має значення, T7Max стимулює GFP чи mCherry, обидва білки відповіли на сильніший промотор подібним відносним збільшенням. Це забезпечило багатообіцяючу модель для зараження «сильнішим» паразитом (паразитом, що несе ген під T7Max у господаря під T7) і зворотним, сильнішим господарем, який чинить опір слабшому паразиту (господар з геномом під T7Max і паразит, що несе ген T7). Підбадьорені цими експериментами з підтвердженням принципу, ми перейшли до експериментів із синтетичними клітинами.

«Інфекція» в усіх випадках є злиттям синтетичної клітини хазяїна та паразита. Злиття сприяють ДНК-мітки на поверхні ліпосом, використовуючи описану раніше систему злиття, індуковану ДНК.18 Коротко кажучи, синтетичні клітини були створені за допомогою Escherichia coli TxTl всередині мембрани з POPC і холестерину, а зовнішня листка була прикрашена з одноланцюговою ДНК, прикріпленою до мембрани шляхом модифікації холестерину. Якщо пара ліпосом із комплементарними мітками зустрічається, мітки ДНК гібридизуються, зближуючи мембрани та ініціюючи злиття мембран, за яким слідує змішування в просвіті. У наших експериментах синтетичною клітиною-господарем є ліпосома, що містить TxTl з T7 RNAP на додаток до генома GFP, кодованого плазмідою. Моніторинг флуоресценції GFP служить проксі для "здоров'я" метаболізму господаря. Вхідний паразит містить геном у формі плазміди, що кодує mCherry, повну систему трансляції, але не містить РНК-полімеразу T7. Це гарантує, що будь-які спостережувані зміни в метаболізмі господаря є результатом генів, внесених паразитом, а не злиттям ліпосом паразита та господаря, що розріджує цитоплазму господаря. Експерименти із зараженням паразитами проводилися з мембраною хазяїна, міченою ліпідним барвником синьої мембрани Marina Blue DHPE. Це дозволило нам нормалізувати спостережувану флуоресценцію гена хазяїна та паразита до блакитної флуоресценції, нормалізувавши результати до загальної кількості флуоресценції мембрани господаря, присутньої у зразку. Це пояснює розведення загального об’єму зразка після додавання ліпосом паразитів. Мембрани паразитів не були флуоресцентно мічені. Усі експерименти супроводжувалися контрольним зразком, де була присутня лише одна популяція-господар, але з плазмідою mCherry, щоб показати теоретичні максимально можливі рівні експресії mCherry, якщо це був єдиний ген у популяції. У першій серії експериментів ми змішали господаря та паразита з генами, обидва під контролем звичайного промотору T7тому і гени хазяїна, і гени паразита були однаково «сильними». Ми змішали господаря з паразитом так, щоб паразит становив 25, 50 або 75% від загальної популяції ліпосом. У всіх випадках флуоресценція GFP господаря зменшувалася в присутності паразита з відповідним збільшенням флуоресценції паразита mCherry (рис. 2e). Зразки лише з паразитом і без господаря не виробляли флуоресценції жодного кольору, як очікувалося. У всіх випадках ДНК-опосередковане злиття ліпосом не є 100% ефективним;18,19 Тому відносне зниження флуоресценції хазяїна та збільшення флуоресценції паразита не були такими великими, як очікуване теоретичне значення на основі співвідношення хазяїна та паразита. Іншими словами, зараження не було ефективним на 100%. Ця випадкова якість системи злиття, викликаної ДНК, у цьому випадку була корисною властивістю системи. Як і у випадку природного зараження, інфекція, опосередкована злиттям синтетичних клітин, не вплинула на всіх господарів і не всі паразити знайшли господаря. Далі ми дослідили два випадки, коли хазяїн і паразит не однаково збігалися за силою своїх геномів. В одному випадку геном хазяїна був під контролем промотора T7, тоді як геном паразита був під промотором T7Max (рис. 2f), а в протилежному сценарії геном господаря був під контролем T7Max, а геном паразита був під промотором T7 (Малюнок 2g). У разі атаки слабшого господаря сильнішим паразитом відносне збільшення паразитарної флуоресценції mCherry і відповідне зниження флуоресценції GFP господаря були набагато сильнішими, ніж у попередньому випадку рівномірного відповідності господаря та паразита. Як і очікувалося, коли хазяїн був сильнішим за паразита, було навпаки: рівні флуоресценції mCherry були нижчими, а відносне зниження флуоресценції GFP було нижчим, ніж у рівномірному випадку. Найкраще це можна проілюструвати порівнянням однієї точки даних за однакових умов зараження: при 75% відношенні паразитів. Рівномірно підібрані популяції господаря та паразита призводять до флуоресценції паразита, дещо більшої, ніж у господаря. Коли паразит сильніший, флуоресценція паразита значно вища, ніж хазяїна. А коли хазяїн сильніший, флуоресценція паразита трохи нижча, ніж хазяїн. Ці виділені точки даних позначені жовтою зірочкою на малюнку 2e-g. Ми провели контрольний експеримент із господарем, інфікованим «безсимптомним» паразитом — паразитом, який несе плазміду з промотором T7, але не містить послідовності, що кодує білок (ми видалили касету mCherry з плазміди) (рис. 2h). Флуоресценція GFP господаря мінімально зменшується на вищих рівнях паразитів, що вказує на те, що деяка невелика кількість ресурсів господаря спрямована на транскрипцію короткої некодуючої РНК із плазміди паразита. Ці дані також підтверджують, що основний метаболічний тягар паразитарної інфекції на господаря полягає у використанні трансляційних, а не транскрипційних ресурсів. Це спостереження узгоджується з попередніми спостереженнями про те, що трансляція є більш мінливим і обмежуючим ресурсом у безклітинних системах.20 Загалом ці експерименти забезпечують модель зараження паразитом, який захоплює метаболічні ресурси хазяїна, імітуючи поведінку синтетичних клітин аспекти природних відносин хазяїн-паразит.

Рисунок 2. Паразитарна інфекція захоплює ресурси хоста. (a) Ліпосома синтетичної клітини господаря містить безклітинну систему трансляції та плазміду, що кодує GFP. Поверхня хазяїна прикрашена мітками ssDNA. Ліпосома паразита містить плазміду, що кодує mCherry, із системою трансляції, але без РНК-полімерази (тому паразит не може експресувати mCherry). Поверхня паразита прикрашена мітками оцДНК, комплементарними міткам на поверхні хазяїна. Мітки ДНК полегшують злиття ліпосом хазяїна та паразита, і хазяїн експресує як свій власний геном GFP, так і паразитарний геном, що містить mCherry. (b−d) Доказ принципу для геномів господаря (GFP) і паразита (mCherry), що конкурують за ті самі синтетичні клітинні ресурси. Ці експерименти проводяться в розчині TxTl, а не в ліпосомах. Дві плазміди, що кодують GFP і mCherry, були змішані у співвідношенні, зазначеному піктограмами плазмід ліворуч від теплової карти, із загальною концентрацією ДНК зразка, зазначеною в рядку над тепловою картою. Флуоресценцію вимірювали в зеленому (GFP) і червоному (mCherry) каналах. Кожну плазміду тестували у двох варіантах з промоторами різної сили: з T7 і з більш сильним промотором T7Max. Індивідуальні дані для всіх теплових карт представлені на малюнках S2−S4. Репрезентативні індивідуальні часові курси для експресії білка T7-господаря та паразита представлені на малюнках S5-S7, а для паразита T7Max на малюнках S8-S10. (e−g) Зараження хазяїна паразитом. У кожному експерименті ліпосоми господаря змішують з ліпосомами паразита. Злиття паразита з хазяїном доставляє паразитарну ДНК mCherry, яка експресується разом із GFP ДНК господаря. Було протестовано різні співвідношення хазяїна та паразита, як зазначено піктограмами під гістограмами. Геном хазяїна під промотором T7 був інфікований паразитом з його геномом під панеллю промотора T7 (e) і паразитом з його геномом під панеллю промотора T7Max (f), хазяїна також створили з геномом T7Max та інфікували з паразитом з панеллю геному Т7 (g). Типові індивідуальні часові курси експресії білка наведені на малюнку S11. Подібні експерименти з вищими та нижчими концентраціями загального ліпіду наведені на малюнку S12. На малюнку S13 наведено сліди очищення за допомогою ексклюзії, що показує стабільність везикул після злиття. (h) Інфекція несумісним паразитом: паразит несе промотор T7, але не кодує ДНК. Смуги помилок позначають SEM, n=3. Значення флуоресценції на панелях (e−h) нормалізовано до синьої флуоресценції мембранного барвника, щоб нормалізувати результати до концентрації клітин-господарів. Усі серії зразків, позначені як «господар, інфікований GFP», є експериментами, де хазяїн і паразит мали комплементарні мітки ДНК на поверхні, що уможливлювало злиття ліпосом, що називається інфекцією. Зразки, помічені серією «господар GFP здоровий», показують зразки, де господар і паразит змішані у вказаних співвідношеннях, але не містять комплементарних міток злиття, що унеможливлює зараження. Ромб на панелях (e-h) вказує на один конкретний стан інфекції, який найкраще ілюструє відмінності в силі експресії хазяїна та паразита на панелях (e-g) і переваги імунітету хазяїна на панелі (h). Пряме порівняння значень хазяїна та паразита, позначених зірочкою, наведено на малюнку S14. Дані щодо зараження паразитом без будь-якої плазміди показано на малюнку S15.

Інфекція синтетичної клітини може знищити геном господаря.

Паразит, описаний вище, експресував mCherry, що кодує геном, використовуючи ресурси хазяїна, але хазяїн підтримував частину свого метаболізму та продовжував експресувати GFP, незважаючи на інфекцію. Далі ми вирішили дослідити систему, в якій інфекція призводить до повного захоплення метаболізму хазяїна паразитом через руйнування геному господаря (рис. 3а). Щоб розробити такий сценарій, ми дослідили переварювання рестриктазою плазміди в TxTl. В експериментах з підтвердження принципу фермент рестрикції MunI експресувався в TxTl без ліпосом. Плазміду MunI змішували з плазмідою GFP у різних співвідношеннях. Якщо плазміда GFP не містить сайтів рестрикції MunI, відносно невелике зниження спостережуваної флуоресценції GFP можна пояснити описаною раніше конкуренцією між двома плазмідами за ресурси TxTl. Якщо плазміда GFP має сайт рестрикції MunI, флуоресценція GFP значно зменшується, і зменшення масштабується пропорційно до збільшення кількості плазміди, що кодує MunI (рис. 3b). Експресію MunI контролювали за допомогою вестерн-блоттингу та масштабували пропорційно концентрації плазміди (рис. 3c).

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Підбадьорені цими результатами, ми поставили експеримент із зараженням синтетичними клітинами. Господар ніс плазміду GFP, а патоген ніс плазміду MunI. Концентрацію плазмід GFP і MunI було встановлено на рівні 2 мМ, що значно нижче концентрації насичення плазмід для TxTl.21 Ми мали намір залишатися нижче загальної концентрації плазмід, при якій експресія хазяїна та паразита буде достатньо високою, щоб безпосередньо конкурувати за обмежені ресурси ( як у вищеописаному випадку простого паразита), замість того, щоб здебільшого виміряти ефект ферменту паразита, який активно руйнує геном господаря. Як і в раніше описаних експериментах з паразитами, хазяїн містив бактеріальну TxTl і Т7 РНК-полімеразу, патоген ніс лише клітинний екстракт без Т7 РНК-полімерази, і хазяїн, і патоген були помічені комплементарними мітками злиття ДНК. Мембрана хазяїна була помічена DHPE Marina Blue для нормалізації результатів флуоресценції до концентрації ліпосом хазяїна. Господар і патоген змішувалися в різних співвідношеннях, причому патоген становив 25, 50 або 75% від загальної популяції. Флуоресценція «інфікованого» хазяїна, де хазяїн і патоген містили комплементарні мітки злиття, зменшувалася зі збільшенням кількості патогену. Флуоресценція GFP від ​​«здорового» хазяїна, де патоген не містив комплементарних міток злиття, не зменшувалась у присутності будь-якої кількості патогену. Зразки лише з патогеном не призвели до вимірюваної флуоресценції (рис. 3d). Експресію патогенного білка MunI кількісно визначили за допомогою аналізу вестерн-блот, з даними, показаними для серії зразків інфікованого господаря (рис. 3e). Далі ми досліджували інфекцію у випадку господаря, імунного до патогену: плазміда GFP господаря не мала сайту рестрикції MunI (рис. 3f). Флуоресценція хазяїна після інфікування зменшилася, але не була настільки значною, як у попередньому випадку хазяїна з сайтом MunI в геномі. Білок збудника MunI експресувався на рівнях, порівнянних з попередніми експериментами з інфікуванням (рис. 3g), тому метаболічне навантаження на господаря було подібним. Зменшення флуоресценції інфікованого хазяїна в цих експериментах спричинене тим, що деякі ресурси хазяїна були захоплені патогеном, що експресує MunI, але оскільки загальна концентрація плазміди набагато нижча, ніж у попередніх простих експериментах з патогеном, зниження флуоресценції хазяїна є менш значним. Цей експеримент також підтверджує, що зниження флуоресценції хазяїна з сайтом MunI (рис. 3d) було викликано часовими курсами експресії білка, наведеними на малюнку S22. (g) Експресію MunI відстежували за допомогою вестерн-блот-аналізу під час експерименту для зразків, показаних у серії «GFP інфікованих» на панелі (f). Смуги помилок на всіх панелях позначають SEM, n=3. Значення флуоресценції на панелях (d, f) нормалізовано до синьої флуоресценції мембранного барвника, який використовується для нормалізації результатів щодо концентрації клітин-господарів. Флуоресценція на панелі (b) нормалізована до 0 мМ плазміди MunI для кожної серії зразків. Ромбоподібні символи на панелях (d, f) висвітлюють один конкретний стан, який найкраще ілюструє відмінності у відповідях на інфекцію від господаря, чутливого до панелі патогенів (d) і імунної до панелі патогенів (f). Усі серії зразків, помічені як «заражені GFP», є експериментами, де господар і патоген мали комплементарні ДНК-мітки на поверхні, що уможливлювало злиття ліпосом, що називається інфекцією. Серія з позначкою «GFP здоровий» показує зразки, у яких господар і збудник були змішані у вказаних співвідношеннях, але не містили комплементарних міток злиття, що унеможливлювало зараження.

Рисунок 3. Інфекція руйнує геном хоста та захоплює ресурси хоста. (a) Клітини-господарі містять плазміду, що кодує GFP, з двома сайтами рестрикції MunI; збудник містить плазміду, що кодує рестриктазу MunI. Після злиття хазяїна та патогена хазяїн TxTl експресує рестриктазу MunI, яка потім розщеплює геном хазяїна. (b) Експерименти з підтвердженням принципу інфекції: плазміду GFP готували з сайтами рестрикції MunI і без них. Плазміду GFP змішували з плазмідою MunI і реєстрували експресію GFP. Ці експерименти проводили в розчині TxTl без ліпосом. Підтвердження принципу експерименту з інфекцією, коли фермент MunI додається ззовні замість експресії в TxTl, показано на малюнках S16 і S17. Показові часові курси експресії білка наведено на малюнку S18. (c) Експресію MunI контролювали за допомогою вестерн-блот аналізу; інтенсивність смуги MunI була кількісно визначена в тих самих зразках, що й результати флуоресценції, показані на панелі (b) для серії «сайт MunI відсутній». Показовий вестерн-блот рестриктази MunI наведено на малюнку S19. (d) Флуоресценція GFP хазяїна, змішаного з ліпосомами патогена у співвідношенні, показаному під графіком даних. Плазміда GFP хазяїна має два сайти рестрикції MunI. Показові часові курси експресії білка наведено на малюнку S20. Дані для експериментів із зараженням несумісними мітками злиття наведено на малюнку S21. (e) Експресію MunI відстежували за допомогою вестерн-блот-аналізу під час експерименту для зразків, показаних у серії «GFP infected» на панелі (d). (f) Флуоресценція GFP хазяїна, змішаного з ліпосомами патогену, у співвідношенні, показаному під графіком даних. GFP господаря не має сайтів рестрикції MunI, що забезпечує імунітет до білка патогена. Показові часові курси експресії білка наведено на малюнку S22. (g) Експресію MunI відстежували за допомогою вестерн-блот-аналізу під час експерименту для зразків, показаних у серії «GFP інфікованих» на панелі (f). Смуги помилок на всіх панелях позначають SEM, n=3. Значення флуоресценції на панелях (d, f) нормалізовано до синьої флуоресценції мембранного барвника, який використовується для нормалізації результатів щодо концентрації клітин-господарів. Флуоресценція на панелі (b) нормалізована до 0 мМ плазміди MunI для кожної серії зразків. Ромбоподібні символи на панелях (d, f) висвітлюють один конкретний стан, який найкраще ілюструє відмінності у відповідях на інфекцію від господаря, чутливого до панелі патогенів (d) і імунної до панелі патогенів (f). Усі серії зразків, помічені як «заражені GFP», є експериментами, де господар і патоген мали комплементарні ДНК-мітки на поверхні, що уможливлювало злиття ліпосом, що називається інфекцією. Серія з позначкою «GFP здоровий» показує зразки, у яких господар і збудник були змішані у вказаних співвідношеннях, але не містили комплементарних міток злиття, що унеможливлювало зараження.

Інфекція синтетичної клітини може бути «смертельною», виснажуючи ресурси клітини-господаря, і такі інфекції можна «лікувати» для виконання рятувальної функції.

Наведені вище експерименти з паразитами та патогенами продемонстрували, що синтетичні клітини можна використовувати як модель для інфекції, коли патоген захоплює ресурси господаря. Далі ми вирішили дослідити сценарій, за яким інфекція спричиняє припинення функціонування метаболізму хазяїна після експресії патогенного білка. У цьому випадку збудник можна порівняти з інфекцією бактерією, яка експресує смертельний токсин, за вирахуванням аспекту реплікації господаря або паразита, оскільки ці синтетичні клітини не реплікуються (рис. 4а). Для розробки цієї системи ми обрали гемолізин (aHL), природний токсин і мембранний білок, який широко використовується в синтетичній клітинній інженерії для створення неспецифічних мембранних пор.22,23 Ми цінуємо іронію цього вибору, оскільки aHL природним чином експресується Staphylococcus aureus як токсину, і білок пізніше був призначений для інженерного мембранного транспорту та подовження синтетичного клітинного метаболізму.24 Тут ми повертаємося до використання aHL для його природної ролі як шкідливого токсину, що виробляється інфекцією. Ще один помітний приклад використання токсичності aHL для природної смерті клітин, пов’язаний із синтетичною клітинною інженерією, – застосування синтетичних клітин як технології лікування раку.25 Як доказ принципу ми встановили, що експресія високої концентрації aHL у везикулах синтетичних клітин призводить до витоку клітинного вмісту та значного зниження експресії GFP всередині клітини. Цей ефект можна скасувати, якщо зовнішня частина ліпосом містить усі малі молекули, необхідні для TxTl (рис. 4b). У нашій модельній системі господар-патоген господар містить плазміду, що кодує GFP, а патоген містить плазміду, що кодує aHL. Усі експерименти з інфікуванням подібні до описаного вище сценарію паразитів і патогенів, причому патоген не несе Т7 РНКП, а господар і патоген прикрашені мітками злиття ДНК. Цікаво, що ми спостерігали, що при нижчих концентраціях патогенів (патоген становить 25 або 50% від загальної популяції) флуоресценція господаря лише незначно зменшується. Однак збільшення концентрації збудника до 75% призводить до значного зниження флуоресценції GFP господаря (рис. 4c). Ми припускаємо, що цей результат може бути викликаний відносно повільним витоком поживних речовин із синтетичних клітин при нижчій концентрації aHL. Флуоресценцію GFP вимірювали лише через 12 годин інкубації, і GFP є дуже стабільним білком. Таким чином, можливо, що у випадку нижчих концентрацій aHL (нижча кількість патогенів) витік поживних речовин, викликаний aHL, був досить повільним, щоб клітини-хазяїни накопичили значну кількість GFP до того, як наслідки індукованого aHL витоку стали руйнівними для метаболізм. Щоб відокремити результати простої конкуренції за ресурси між геномами хазяїна та паразита, ми провели експерименти «зараження з порятунком», у яких зовнішній буфер містив усі малі молекули, які складають суміші енергії TxTl, амінокислот і солей. Це було налаштовано аналогічно умові «живильні речовини ззовні», перевіреній на малюнку 4b. Зменшення флуоресценції хазяїна в цих експериментах було подібним до попередніх зразків «інфекція без порятунку» з 25 і 50% рівнями збудника. Зменшення флуоресценції хазяїна на 75% збудника було значно меншим, ніж зниження, що спостерігалося у зразках без відновлення (рис. 4d). Велика різниця в результатах експерименту з 75% паразита, з точками даних на панелях рисунка 4 (c, d), виділеними зірочкою, здається, підтверджує нашу гіпотезу про те, що вищі концентрації aHL завдають шкоди на початку реакції. При нижчій концентрації патогенів витік відбувається досить повільно, щоб GFP-господар накопичувався (як видно як із допоміжними поживними речовинами, так і без них), тому спостережувана флуоресценція GFP зменшується після інфікування переважно через конкуренцію за ресурси. При вищих концентраціях патогенів флуоресценція GFP у зразках із зовнішніми поживними речовинами зменшується переважно через конкуренцію за ресурси. Ці експерименти демонструють, що ми можемо створювати синтетичні клітини для моделювання інфекції, що призводить до двох різних результатів: метаболічного покарання самої інфекції (зниження GFP через конкуренцію ресурсів) і більш «смертоносної» інфекції в результаті скасування експресії білка господаря. Підбадьорені цим спостереженням, ми вирішили дослідити систему, в якій синтетичні клітини можуть активно протистояти патогенній інфекції, і дослідити метаболічну шкоду такої відповіді.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Синтетичні клітини можуть захистити від інфекції за допомогою стратегії, натхненної бактеріями.

Надихаючись відомою функцією ендонуклеаз рестрикції для захисту бактерій від чужорідної ДНК, ми намагалися застосувати цю стратегію в синтетичних клітинах. Ми розширили систему паразитів, представлену на малюнку 2: на додаток до GFP ми додали плазміду, що містить MunI, до господаря. Паразит містив mCherry, як і в попередніх експериментах. Плазміда mCherry містить сайт рестрикції MunI (рис. 5а). По-перше, ми провели експерименти з підтвердженням принципу, щоб оцінити метаболічне навантаження експресії MunI на хазяїна. У цих неінкапсульованих експериментах TxTl ми стежили за експресією GFP та експресією mCherry, кожен змішаний із зростаючою кількістю плазміди MunI або EcoI. Усі гени були під контролем одного промотору Т7. Ген GFP мав сайт рестрикції EcoI, але не MunI, а ген mCherry мав сайт рестрикції MunI, але не EcoI. Коли плазміду рестриктази змішували з флуоресцентною білковою плазмідою без сайту розпізнавання для цієї рестриктази, експресія флуоресцентного білка зменшувалася пропорційно збільшенню плазміди рестриктази, що свідчить про конкуренцію між двома плазмідами за ресурси TxTl, як було продемонстровано раніше для GFP і mCherry на малюнку 2. Ці неріжучі пари були GFP з MunI (малюнок 5b) і mCherry з EcoI (малюнок 5e). Коли флуоресцентний білок з’єднали з рестриктазою, здатною розрізати ген цього флуоресцентного білка, флуоресценція значно зменшилася майже до фонового рівня при вищих концентраціях плазміди рестриктази. Ці пари різання були GFP з EcoI (рис. 5c) і mCherry з MunI (рис. 5d). Це вказує на зниження флуоресценції, що значно перевищує просту конкуренцію за ресурси та схоже на сценарій зараження, показаний на малюнку 3. Експресія MunI у присутності GFP знижує експресію GFP. Якщо ми використовуємо GFP як проксі для «базового» метаболізму господаря, то MunI можна розглядати як метаболічне навантаження на господаря.

Рисунок 4. Господар сприйнятливий до «смертельної» інфекції, але його можна врятувати. (a) Господар містить плазміду GFP, а патоген містить плазміду, що кодує мембранний канал гемолізину (aHL). Після інфікування хазяїн експресує aHL, що створює пори в мембрані, що спричиняє витік поживних речовин і призводить до зниження метаболічної активності хазяїна. (b) Доказ принципу для хазяїна, що експресує aHL (без інфекції, хазяїн був створений як з 5 нМ GFP, так і з зазначеною кількістю плазміди aHL). Господаря інкубували в буфері з поживними речовинами або без них (усі компоненти енергії, солі та амінокислотної суміші, що використовувалися для приготування безклітинної системи трансляції хазяїна). Оптимальна концентрація поживних речовин для порятунку була встановлена ​​експериментально, дані показані на малюнку S23. (c) Зараження хазяїна патогеном із різною кількістю патогена на клітину хазяїна. Витік малих молекул із «здорових» і «інфікованих» клітин вимірювали безпосередньо за допомогою маломолекулярного барвника, дані показані на малюнках S24 і S25. (d) Експерименти, подібні до цих, показані на панелі (c), але зовнішній буфер містить маломолекулярні поживні речовини, подібні до експериментальних умов «поживних речовин поза межами», показаних на панелі (b). Смуги помилок на всіх панелях позначають SEM, n=3. Значення флуоресценції на панелях (b−d) нормалізовано до синьої флуоресценції мембранного барвника, який використовується для нормалізації сигналу щодо концентрації клітин-господарів. Ромбові символи на панелях (c, d) висвітлюють одну особливу умову, яка найкраще ілюструє відмінності у відповіді на інфекцію від господаря без зовнішніх поживних речовин на панелі (c) і імунітету до патогену через присутність зовнішніх поживних речовин на панелі (d). Для панелей (c, d) ряд «GFP інфікований» означає господаря, злитого з патогеном, що несе білок aHL, а «GFP здоровий» означає господаря, злитого з патогеном, який не несе плазміди.

Ми переходимо до експериментів із зараженням, змішуючи господаря (з плазмідами GFP і MunI) з паразитом (з плазмідою mCherry). Як і раніше, ми досліджували сценарії зі збільшенням кількості паразитів у популяції (рис. 5f). Позитивний контроль лише mCherry, що експресує хазяїна (з EcoI замість MunI для балансування метаболічного навантаження), створив орієнтир для теоретичної максимальної кількості патогенного білка, який може бути експресований у хазяїні (рис. 5f). У міру збільшення кількості паразита флуоресценція GFP господаря зменшувалася, але зниження флуоресценції інфікованого господаря було значно меншим, ніж зниження експресії GFP, що спостерігалося в попередніх експериментах з тим самим паразитом. GFP і флуоресценцію паразита mCherry цього інфікованого господаря, що експресує MunI (точка даних, позначена зірочкою на малюнку 5f), можна безпосередньо порівняти з подібними інфекційними господарями без MunI (точка даних, позначена зірочкою на малюнку 2e). У хазяїна, який експресує MunI, GFP хазяїна починався з абсолютно нижчого рівня, поки він був здоровим (оскільки деякі ресурси відволікаються на експресію MunI), але після інфікування зниження флуоресценції хазяїна є набагато менш значним, і хазяїн виробляє набагато менше білка паразита mCherry. ніж у випадку, коли господар не виражає MunI. Цей експеримент демонструє переваги господаря, який витрачає певні ресурси на захист від паразитів. Цю систему можна розглядати як дуже просту біохімічну модель для організмів, які експресують білки для захисту від майбутніх інфекцій або навіть шкідливих факторів навколишнього середовища. Спочатку хазяїн є менш міцним (якщо ми беремо експресію GFP як еталон здоров’я хазяїна), але в разі інфекції додаткові ресурси, витрачені хазяїном на експресію захисних білків, окупаються, забезпечуючи захист від інфікуючого паразита. Тому в цій простій неживій синтетичній клітині ми відтворили приклад фундаментальної біологічної гонки озброєнь.

Рисунок 5. Клітини-господарі захищаються від інфекції. (a) Клітини-господарі містять дві плазміди: одна кодує GFP (без сайту рестрикції MunI), а інша кодує ензим рестрикції MunI (ген «стійкості до паразитів»). Паразит містить плазміду mCherry у системі, подібній до експериментів, показаних на малюнку 2. Інфекція опосередкована злиттям через ДНК-мітки на поверхні хазяїна та паразита. Після зараження плазміда mCherry, введена паразитом, перетравлюється рестриктазою господаря MunI. (b−e) Вимірювання метаболічної вартості вираження стійкості до паразитів. Експерименти проводяться в масовій системі TxTl, не інкапсульованій у везикули. У кожному експерименті флуоресцентну білкову плазміду (GFP або mCherry) змішували з плазмідою рестриктази (MunI або EcoI) у співвідношенні, зазначеному на осі х, для загальної концентрації плазміди 10 мМ. GFP має сайт обмеження EcoI, але не сайт MunI, а mCherry має сайт обмеження MunI, але не сайт обмеження EcoI. Лінія тренду є візуальним орієнтиром, але не підгонкою даних. Смуги помилок позначають SEM, n=3. Контрольні експерименти з очищеними ферментами рестрикції замість експресії їх із плазміди представлені на малюнку S26. Стабільність ліпосом із збільшеною кількістю паразитної плазміди також вимірювали, дані показані на малюнку S27. (f) Зараження хазяїна зростаючою кількістю паразита. «Здоровий GFP господаря» — це експресія GFP клітинами-господарями, злитими з паразитом, без жодної плазміди. «Заражений GFP-господар» — це господар, злитий із паразитом, який несе mCherry. Червона флуоресценція — це флуоресценція mCherry від паразита, злитого з господарем (доступні лише дані щодо інфікованого господаря. Зразки здорових господарів не містили плазміди mCherry). Смуги помилок на всіх панелях позначають SEM, n=3. Значення флуоресценції нормалізуються до блакитної флуоресценції мембранного барвника, який використовується для нормалізації результатів щодо концентрації клітин-господарів. Символ ромба вказує на експресію білка паразита за певних умов зараження, прямо порівнянну з точкою даних, виділеною зірочкою на малюнку 2e, в експерименті за тих самих умов, але з господарем, у якого відсутній ген резистентності MunI.

Рисунок 6. Інокуляція забезпечує захист від інфекцій. (a) Господар містить плазміду GFP. Патоген у цих експериментах є однією з трьох схем зараження, продемонстрованих у цій статті: паразит (як показано на малюнку 2), збудник з рестриктазою MunI, що перетравлює геном GFP господаря (як показано на малюнку 3), або патоген перенесення мембранного каналу aHL, викликаючи витік поживних речовин із господаря (як показано на малюнку 4). У кожному випадку хазяїн і патоген містять комплементарні мітки злиття ДНК. Перед введенням патогена хазяїна «інокулюють»: інкубують із надлишком олігонуклеотидів оцДНК, комплементарних міткам злитої ДНК на поверхні хазяїна (мітки, ідентичні міткам на патогені за вирахуванням частини холестерину, яка використовується для прикріплення мітки до мембрани збудник). Інокуляція призводить до того, що мітки злиття на поверхні хазяїна стають дволанцюговими, що унеможливлює злиття з патогеном. (b) Доказ принципу для схеми щеплення. Популяція ліпосом, що несуть GFP під контролем промотору РНК Т7, але без РНК-полімерази Т7, зливається з ліпосомами, що містять РНК-полімеразу Т7. Білок GFP може бути експресований, лише якщо дві популяції зливаються. Один або обидва партнери змішування були «защеплені» шляхом інкубації з міткою ДНК, сумісною з мітками злиття на поверхні ліпосоми, роблячи мітки злиття дволанцюговими і, отже, несумісними зі злиттям. Показовий часовий хід експресії білка показано на малюнку S28. Контрольні експерименти без будь-яких міток злиття наведені на малюнку S29, а контрольні експерименти з несумісними мітками злиття наведені на малюнку S30. Концентрація олігонуклеотиду при інокуляції була встановлена ​​експериментально, дані показані на малюнку S31. (c) Експерименти з паразитами. Господар, що несе GFP, був злитий з паразитом, що несе mCherry, як описано на малюнку 2. Господар і паразит були змішані з різним співвідношенням господаря до паразита; клітини-господарі були або інокульовані (з дволанцюговими мітками злиття ДНК, не сумісними зі злиттям), або не інокуловані (таким чином сприйнятливі до злиття з паразитом). Флуоресценція mCherry повідомляється лише для зразків з неінокульованим хазяїном, оскільки в інокульованих зразках хазяїна не було вимірюваної флуоресценції mCherry. Було протестовано зворотну інокуляцію шляхом інокуляції паразита замість хазяїна, дані показані на малюнку S32. (d) Експерименти з інфекцією з геномом хазяїна, сприйнятливим до збудника, який несе рестриктазу MunI, як описано на малюнку 3. Інфіковані серії даних представляють хазяїна без інокуляції, а інокульовані серії даних представляють зразки з хазяїном, інкубованим з інокуляційними олігонуклеотидами, тому не сприйнятливий до злиття з патогеном. (e) Експерименти з інфекцією з патогеном, що несе ген aHL, призводять до того, що канали aHL виводять поживні речовини з клітин-господарів після інфікування, як описано на малюнку 4. Інфікований ряд даних представляє господаря без інокуляції, а інокульований ряд даних представляє зразки з хазяїн, інкубований з інокуляцією олігонуклеотидів, таким чином не сприйнятливий до злиття з патогеном. Смуги помилок на всіх панелях позначають SEM, n=3. Значення флуоресценції на панелях (c−e) нормалізовано до синьої флуоресценції мембранного барвника, який використовується для нормалізації результатів щодо концентрації клітин-господарів. Деякі дані, показані на цьому малюнку, є експериментами з установкою, ідентичною експериментам, показаним на попередніх малюнках (як зазначено в кожному підписі). Ці експерименти повторювали для цієї фігури, щоб отримати дані з використанням тієї самої партії TxTl для прямого порівняння результатів, усуваючи мінливість препаратів TxTl від партії до партії.

Інокуляція синтетичних клітин запобігає зараженню.

У вищеописаному прикладі ми продемонстрували захист господаря від впливу геному патогена шляхом експресії додаткового білка. Далі ми запитали, чи можливо змоделювати сценарій, коли певне втручання робить раніше чутливого господаря імунітетом до інфекції. Ми назвали це моделлю щеплення. Визнаючи, що це далеко не ідеальна аналогія, аспект, на якому ми зосередилися, полягає в тому, що синтетична клітина-хазяїн не витрачає жодних ресурсів на формування імунітету. У нашій моделі імунізації ми розробили лікування, яке перетворює синтетичну клітину господаря, чутливу до інфекції, на клітини, які не можуть зливатися з патогеном. Синтетична система злиття клітин, яка використовується в цій статті, спирається на одноланцюгові мітки ДНК для індукції злиття мембрани ліпосом. Для інокуляції проти злиття з патогеном ми інкубували клітини з ДНК-олігонуклеотидом, комплементарним злитому оліго на поверхні клітин (рис. 6а). По-перше, нам потрібно було підтвердити, що інокуляція шляхом інкубації з комплементарним олігонуклеотидом припиняє злиття. В експериментах з підтвердженням принципу було підготовлено дві популяції ліпосом: одна популяція мала TxTl з плазмідою, що кодує GFP під контролем промотору T7, а інша популяція мала TxTl і T7 РНК-полімеразу, але не мала плазміди. Після злиття цих двох популяцій плазміда GFP змішалася з РНК-полімеразою Т7 та індукувала експресію GFP. Якщо дві популяції мали одноланцюгові та комплементарні мітки злиття, відбулося злиття та була виявлена ​​флуоресценція GFP. Якщо одну або обидві популяції інкубували з олігонуклеотидом, комплементарним мітці злиття, злиття ліпосом не відбувалося, і GFP не експресувався (рис. 6b). Встановивши систему інокуляції, ми продовжили впровадження інокуляції для захисту синтетичних клітин господаря в трьох сценаріях зараження, описаних раніше в цій роботі. По-перше, ми використали сценарій паразитів, описаний на малюнку 2. Клітини-господарі, що містять геном GFP, були щеплені олігокомплементарним до мітки злиття на поверхні хазяїна, а хазяїна змішали з паразитом mCherry. Ми змішували господаря з паразитом у різних співвідношеннях. За будь-яких умов зараження флуоресценція паразита mCherry була неможливою виявити, якщо хазяїн був інокульований, а флуоресценція GFP інокульованого хазяїна не зменшувалася. Контрольні експерименти з неінокульованим господарем показали зниження експресії GFP господаря та збільшення сигналу паразита mCherry, як і очікувалося (рис. 6c). Далі ми застосували систему інокуляції до випадку господаря, інфікованого патогеном, який несе ензим рестрикції MunI, що кодує геном і здатний перетравлювати геном GFP господаря, як в експериментах, показаних на малюнку 3. Інокульований господар не показав зменшення у флуоресценції GFP після змішування зі збільшенням кількості патогену, тоді як неінокульований хазяїн був інфікований, а флуоресценція GFP господаря зменшувалася пропорційно до збільшення кількості патогену (рис. 6d). Інокуляція також була ефективною проти збудника aHL. Інокульовані хазяї не показали зниження флуоресценції після змішування з патогеном, тоді як флуоресценція GFP неінокульованого хазяїна значно зменшилась із зараженням (рис. 6e). У всіх випадках цієї простої процедури інокуляції, інкубації хазяїна з олігонуклеотидом ДНК, комплементарним до злитого олігонуклеотиду на поверхні хазяїна, було достатньо, щоб скасувати здатність патогенних синтетичних клітин інфікувати клітини хазяїна. Тому ми продемонстрували просту фізико-хімічну модель втручання, яка захищає клітини-господарі від інфекції.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

ВИСНОВКИ

У цій статті ми демонструємо методи використання мінімальних синтетичних клітин для моделювання паразитарних і патогенних інфекцій. Мотивація нашої роботи була подвійною. Ми хотіли створити складну, схожу на життя поведінку в синтетичних клітинах, полегшивши мету створення синтетичних клітин, які більше нагадують природні живі клітини. Ми також хотіли скористатися перевагами простої та керованої системи синтетичних клітин для моделювання основних властивостей процесів інфекції, інокуляції та стійкості. Хоча синтетичні клітини не еволюціонують і не самовідтворюються, ця система дозволяє вивчати динаміку інфекції в простій і легкій для аналізу моделі. Ми сподіваємося, що описані тут принципи інфекції допоможуть створити практичні та застосовні моделі для різних патогенів і пом’якшення інфекції. Вивчення цієї спрощеної системи синтетичних клітин підкреслило фундаментальні взаємодії між паразитом і патогеном. Хоча синтетичні клітини (ще) не живі, і вони не мають здатності пройти дарвінівську еволюцію, ця система дозволяє нам спостерігати за взаємодією патогена та хазяїна без можливості виробити природний імунітет або змінити вірулентність патогена. Хоча представлена ​​тут динаміка інфекції хазяїна використовує синтетичні клітини на основі бактерій, ця система за своєю суттю не обмежується бактеріальним TxTl. Можна навіть уявити, що представлена ​​тут система буде використана для моделювання динаміки інфекції в популяціях, схожих на природні екосистеми, використовуючи переваги простоти, притаманної синтетичним клітинам, для повного контролю та вивчення взаємодії між різними членами великих популяцій.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

(1) Програми. Матер. Сьогодні 2016, 19, 516−532.

(2) Гаут, Нью-Джерсі; Adamala, KP Відтворення природних клітинних елементів у синтетичних клітинах. Adv. Biol. 2021, 5, № 2000188.

(3) Тан, К.; Саураб, С.; Bruchez, MP; Шварц, Р.; Ледук, П. Молекулярне скупчення формує експресію генів у синтетичних клітинних наносистемах. Нац. Нанотехнології. 2013, 8, 602−608.

(4) Glantz, ST; Берлю, Е.Е.; Chow, BY Synthetic Cell-like Membrane Interfaces for Probing Dynamic Protein-Lipid Interactions, 1st ed.; Elsevier Inc, 2019; том. 622.

(5) Чжао, Дж.; Чжан, Ю.; Чжан, X.; Лі, К.; Ду, Х.; Sønderskov, SM; Му, В.; Донг, М.; Хан, X. Імітація клітинного метаболізму в штучних клітинах: універсальний транспорт молекул через мембрану через злиття везикул. анальний Chem. 2022, 94, 3811−3818.

(6) Даміано, Л.; Стано, П. Про «схожість на життя» синтетичних клітин. Фронт. біоінж. Біотехнологія. 2020, 8, № 953.

(7) Салехі-Рейхані, А.; Цес, О.; Елані, Ю. Штучні імітатори клітин як спрощені моделі для вивчення клітинної біології. Exp. Biol. Мед. 2017, 242, 1309−1317.

(8) Чакраборті, Т.; Вегнер, С. В. Передача сигналів між клітинами через світло в штучних клітинних спільнотах: сяючий хижак заманює здобич. ACS Nano 2021, 15, 9434-9444.

(9) Дюпен, А.; Зіммель, Ф. К. Передача сигналів і диференціювання в емульсійних мультикомпартменталізованих генних схемах in vitro. Нац. Chem. 2019, 11, 32−39.

(10) Топарлак О.Д.; Зассо, Дж.; Бріді, С.; Серра, доктор медицини; Macchi, P.; Конті, Л.; Боде, М.-Л.; Mansy, SS Штучні клітини керують нейронною диференціацією. Sci. Adv. 2020, 6, № eabb4920.

(11) Робінсон, А.О.; Венеро, О.М.; Adamala, KP Toward Synthetic Life: Biomimetic Synthetic Cell Communication. Curr. Опін. Chem. Biol. 2021, 64, 165−173.

(12) Сміт, Дж.М.; Чоудрі, Р.; Бут, М. Дж. Контроль синтетичного зв’язку клітина-стільник. Фронт. мол. Biosci. 2022, 8, № 1321.

(13) Елані, Ю. Інтерфейс живих і синтетичних клітин як новий рубіж у синтетичній біології. Angew. Chem., Int. ред. 2021, 60, 5602− 5611.

(14) Рустад, М.; Істлунд, А.; Джардін, П.; Noireaux, V. Безклітинний синтез TXTL інфекційного бактеріофага T4 у реакції з однієї пробірки. Синт. Biol. 2018, 3, № ysy002.

(15) Маршалл Р.; Noireaux, V. Кількісне моделювання транскрипції та трансляції All-E. безклітинна система coli. Sci. Відповідь 2019, 9, № 11980.

(16) Гарамелла, Дж.; Маршалл, Р.; Рустад, М.; Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Платформа для безклітинної синтетичної біології. ACS Synth. Biol. 2016, 5, 344−355.

(17) Deich, C.; Кеш, Б.; Сато, В.; Шарон, Дж.; Ауфдембрінк, Л.; Гаут, Нью-Джерсі; Хейлі, Дж.; Стокс, К.; Енгельгарт А.Е.; Adamala, KP Система транскрипції T7Max. 2021, 1−28.

(18) Гаут, Нью-Джерсі; Гомес-Гарсія, Дж.; Хейлі, Дж.М.; Кеш, Б.; Хан, К.; Енгельгарт А.Е.; Adamala, KP Програмоване злиття та диференціація синтетичних мінімальних клітин. ACS Synth. Biol. 2022, 11, 855− 866.

(19) Стенгель, Г.; Зан, Р.; Höök, F. ДНК-індуковане програмоване злиття фосфоліпідних везикул. J. Am. Chem. Соц. 2007, 129, 9584−9585.

(20) Chizzolini, F.; Форлін, М.; Є Мартін, Н.; Берлоффа, Г.; Cecchi, D.; Mansy, SS Cell-Free Translation є більш варіативним, ніж транскрипція. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 638−647.

(21) Шин, Дж.; Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: застосування до синтетичних генних ланцюгів і штучних клітин. ACS Synth. Biol. 2012, 1, 29−41.

(22) Noireaux, V.; Лібхабер, А. Везикулярний біореактор як крок до створення штучної клітини. Proc. Natl. акад. Sci. США 2004, 101, 17669−17674.

(23) Адамала, КП; Мартін-Аларкон, DA; Гутрі-Хонеа, КР; Boyden, ES Engineering Genetic Circuit Interactions всередині та між синтетичними мінімальними клітинами. Нац. Chem. 2017, 9, 431−439.

(24) Noireaux, V.; Бар-Зів, Р.; Годфруа, Ж.; Салман, Х.; Libchaber, A. На шляху до штучної клітини на основі експресії генів у везикулах. фіз. Biol. 2005, 2, P1−P8.

(25) Кринський, Н.; Кадурі, М.; Зінгер, А.; Шаїнський-Ройтман, Дж.; Голдфедер, М.; Бенхар, І.; Гершковіц, Д.; Шредер, А. Синтетичні клітини синтезують терапевтичні білки всередині пухлин. Adv. Матер охорони здоров'я. 2018, 7, № 1701163.

(26) Kwon, YC; Jewett, MC Високопродуктивні методи приготування сирого екстракту для надійного безклітинного синтезу білка. Sci. Відповідь 2015, 5, № 8663.

(27) нд, ZZ; Хейс, Каліфорнія; Шин, Дж.; Кашера, Ф.; Мюррей, Р.М.; Noireaux, V. Протоколи для впровадження безклітинної системи експресії TXTL на основі Escherichia Coli для синтетичної біології. J. Vis. Exp. 2013, 79, 1−15.

(28) Фуджі, С.; Мацуура, Т.; Сунамі, Т.; Нішікава, Т.; Казута, Ю.; Yomo, T. Відображення ліпосом для відбору in vitro та еволюції мембранних білків. Нац. Protoc. 2014, 9, 1578−1591.

(29) Löffler, PMG; Рис, О.; Рабе, А.; Охолм, AH; Томсен, Р.П.; Кємс, Дж.; Фогель, С. ДНК-програмований каскад злиття ліпосом. Angew. Chem., Int. ред. 2017, 56, 13228−13231.