Остеопороз є основною проблемою охорони здоров'я для населення світу, яке дедалі старіє

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Анотація:Остеопороз є важливою проблемою охорони здоров’я в усьому світі, причому приблизно в 3/4 випадків виникає остеопороз у постменопаузі через дефіцит естрогену. У цьому дослідженні у 18 вівцематок породи Меринос видалили яєчники, а 10 були контрольними. Три вівці з оваріектомією отримували щотижня 400 мг метилпреднізолону протягом 5 місяців, а три отримували щотижня протягом 2 місяців, після чого наступав 3-місячний період відновлення. Через 2 місяці п'ять контрольних тварин і шість тварин з оваріектомією піддалися евтаназії. Через 5 місяців усіх овець, що залишилися, піддали евтаназії. Зразки нирок були зібрані посмертно для аналізу qPCR NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA та NCX1. Вівці після оваріектомії мали значно більшу експресію VDR порівняно з іншими групами. Вівці з видаленою яєчником, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців з подальшою евтаназією через 5 місяців, показали значні відмінності в експресії генів TRPV5, CYP24A1 і klotho порівняно з іншими групами. Відмінності в експресії клото були найбільш помітними після коригування для повторних вимірювань (p=0.1). Клото відомий як гормон «антистаріння» і бере участь у метаболізмі кальцію та фосфору. Klotho може брати участь у відновленні мінеральної щільності кісток у овець після оваріектомії, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців з наступною евтаназією через 5 місяців. Рекомендуються подальші дослідження ролі клото.

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Ключові слова:остеопороз; вівці; вітамін D; фосфатування; кПЦР; метаболізм кальцію; фосфорний обмін; клото

1. Введення

Остеопороз є основною проблемою охорони здоров’я для населення світу, яке все більше старіє, коштуючи Сполученим Штатам Америки майже 17 мільярдів доларів США у 205 році та, за прогнозами, зросте до 25 мільярдів доларів США у 2025 році [1,2]. Приблизно 70-75 відсотків тягаря остеопорозу зумовлено постменопаузальним остеопорозом у жінок [1], первинним остеопорозом, при якому дефіцит естрогену призводить до зниження утворення кісткової тканини та збільшення її резорбції, що призводить до зменшення кісткової маси та крихкості кісток [3] . Остеопороз також може виникнути внаслідок певних причин, наприклад лікування глюкокортикоїдами. Вівці є добре встановленою моделлю великих тварин для різних захворювань скелета людини, включаючи остеопороз [4]. Однією з переваг великої тваринної моделі, такої як вівця, є можливість перевірити ортопедичні імплантати, хірургічні методи та біоматеріали [4]. Крім того, вівця є відносно низькою вартістю, легкою у використанні та забезпечує багатий матеріал для тестування [4,5].

Найпоширенішими моделями остеопорозу в овець є 12-місячні післяопераційні оваріектомовані вівці та 6-місячні вівці з оваріектомією на дієті з дефіцитом кальцію та вітаміну D і глюкокортикоїдами[4]. Використовуючи комбінацію відомих факторів, що викликають остеопороз, включаючи оваріоектомію, лікування глюкокортикоїдами та дієту з низьким вмістом кальцію, ми змогли створити овечу модель остеопорозу всього за 5 місяців [6,7], таким чином зменшивши житло, працю, і витрати на корм, пов'язані з розробкою моделі. У цій моделі було виявлено, що оваріоектомія підвищує сироваткові концентрації С-кінцевих телопептидів колагену I типу (CTX-I, маркер кісткової резорбції) і остеокальцину (маркер оновлення кісткової тканини) порівняно з контрольними вівцями. Вівці, які отримували лікування глюкокортикоїдами протягом 2 місяців, мали вищі концентрації CTX-I у сироватці крові та нижчі концентрації остеокальцину в сироватці крові. Крім того, щільність кісткової тканини стегнового та поперекового відділів хребта, а також загальна і трабекулярна об’ємна мінеральна щільність кісткової тканини проксимального відділу великогомілкової кістки були нижчими в групах, які отримували експериментальне лікування, порівняно з контрольними групами, особливо в овець, які отримували глюкокортикоїди після оваріектомії [6]. Було також виявлено, що метаболізм амінокислот і ліпідів змінюється у овець, які перенесли оваріектомію та отримували глюкокортикоїди [7].cistanche wirkungПодібні зміни також були виявлені в інших моделях остеопорозу овець [8].

Cistanche може омолоджувати старіння

Гени, що реагують на вітамін D, і система фосфатування раніше не досліджувалися на моделях овець з видаленням яєчників. Вітамін D, активною формою якого є 1,25-дигідроксивітамін D, зрештою призводить до підвищення концентрації іонізованого кальцію та фосфору в плазмі шляхом зв’язування з гетеродимером рецептора вітаміну D (VDR)-ретиноїдного X рецептора та зміни експресії багатьох вітамінів Гени, що реагують на D, такі як білки, що зв’язують кальцій (кальбіндин D9 і 28k (CalD9k, CalD28k)) і кальцієві канали (член 5 і 6 підродини катіонних каналів тимчасового рецепторного потенціалу V (TRPV5, TRPV6), кальцієва АТФаза плазматичної мембрани (PMCA) , натрій-кальцієвий обмінник 1 (NCX1) [9]. Виробництво 1,25-дигідроксивітаміну D є жорстко регульованим етапом, за допомогою якого ниркова lo гідроксилаза (CYP27B1) каталізує перетворення 25-гідроксивітаміну D до 1,25-дигідроксивітаміну D, а фермент 24-гідроксилаза (CYP24A1) розщеплює як 25-гідроксивітамін D, так і 1,25-дигідроксивітамін D на неактивні побічні продукти.cistanche ВеликобританіяСистема фосфатування також контролює концентрацію фосфору та кальцію в плазмі [10]. Ключовим елементом цієї системи є фактор росту фібробластів 23, який виробляється остеоцитами в кістках і головним чином контролює концентрацію фосфору в плазмі шляхом зв’язування з кофактором клото, щоб зменшити експресію натрій-фосфатних котранспортерів (NPT1, NPT2a, NPT2c). [11]. Через взаємопов’язані ефекти паратиреоїдного гормону та 1,25-дигідроксивітаміну D визначити вплив FGF23 на метаболізм кальцію було складно, але є докази того, що він може регулювати всмоктування кальцію в кишечнику та нирках. реабсорбція кальцію [12,13].

Глюкокортикоїди мають численні ефекти на метаболізм кальцію та фосфору, зокрема пригнічують всмоктування кальцію в кишечнику, знижують реабсорбцію кальцію в ниркових канальцях і знижують реабсорбцію фосфору в нирках [14-16]. Крім того, небагато досліджень вивчали вплив дефіциту естрогену на гени, що реагують на вітамін D, і систему фосфатування [17,18].

Ця модель остеопорозу вівці з оваріектомією, дієтою з низьким вмістом кальцію та лікуванням глюкокортикоїдами дала можливість отримати попередню інформацію про вплив цих методів лікування на експресію фосфатуючих генів і генів, що реагують на вітамін D, у нирках овець. Цілі цього дослідження були подвійними: (1) визначити, чи змінила оваріоектомія або лікування оваріектомією та глюкокортикоїдами експресію вітаміну D і пов’язаних з фосфатуванням генів у нирках; (2) визначити зв’язок між нирковим вітаміном D і пов’язаними з фосфатуванням генами, сироватковий вітамін D і сироваткові маркери обміну кісткової тканини (CTX-I і остеокальцин).

2. Матеріали та методи

Раніше були опубліковані детальні методи розробки моделі остеопорозу вівці з видаленням яєчників і лікуванням глюкокортикоїдами [6]. Коротко, літніх вівцематок мериноса (7-9 років, n=28) було випадковим чином розподілено на групи: контрольна (n=10) оваріектомована (OVX) (n=12), оваріектомована та лікування глюкокортикоїдами (40 мг метилпреднізолону шляхом підшкірної ін’єкції) щомісяця протягом 2 місяців з подальшою відсутністю лікування протягом 3 місяців (n=3) та лікування глюкокортикоїдами (400 мг метилпреднізолону) щомісяця протягом 5 місяців (n=3) .біофлавоноїди цитрусовихОвець містили в хліві і годували або контрольною (115 г/кг кальцію; 2,2 г/овецю на день), або дієтою з низьким вмістом кальцію (5 г/кг кальцію; 1 г/овецю на день) концентратом овець [19]. Вимоги до утримання невагітної вівці становлять 1,2 г/овецю на день [19].

Зразки крові збирали за допомогою яремної венепункції через 2 місяці та 5 місяців після операції. Остеокальцин вимірювали за допомогою набору для імунологічного аналізу Micro Vue Osteocalcin, а CTX-I – за допомогою набору IDS Serum CrossLaps ELISA, як повідомлялося раніше [6]. Концентрації загального кальцію та фосфору в сироватці крові вимірювали за допомогою спектрофотометрії на аналізаторі клінічної хімії AU680 (Beckman Coulter, Brea). , Каліфорнія, США). Концентрацію 25-гідроксивітаміну D у сироватці вимірювали за допомогою рідинної хроматограми з ізотопним розведенням; графічної мас-спектрометрії в Endolab, Canterbury Health Laboratories, Крайстчерч, Нова Зеландія.

Через кілька місяців 5 овець з контрольної групи та 6 з групи OVX піддалися евтаназії та розтину трупа. Через 5 місяців решту овець також піддали евтаназії (контрольна група n =5, група OVX n=6, OVX плюс 2m глюкокортикоїди n=3 та OVX плюс 5m глюкокортикоїди n=5 ) і розтин. Зразки нирок відбирали протягом 30 хвилин після смерті та розділяли на дві частини, причому один зразок поміщали в 10-відсотковий нейтральний буферний формалін і обробляли для гістології, а інший зразок заморожували в рідкому азоті та зберігали при -80 градусах до обробки гематоксиліном і пофарбовані еозином зрізи нирки були досліджені основним автором і підтвердили відсутність значних пошкоджень.

Усі експериментальні процедури були схвалені комітетом з етики тварин Університету Массі (номер схвалення 14/103) і виконані відповідно до Кодексу етичної поведінки щодо використання живих тварин для досліджень в Університеті Массі, Палмерстон-Норт, Нова Зеландія.

Екстракцію РНК і КПЦР проводили, як описано раніше [20,21]. Коротко, Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина) використовували для екстракції РНК згідно з інструкціями виробника. Геномну ДНК видаляли за допомогою Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) відповідно до інструкцій виробника. Концентрацію РНК визначали за допомогою флуорометра Qubit 2.0 і набору широкого діапазону аналізу РНК Qubit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, США), а якість РНК оцінювали шляхом визначення співвідношення 260/280 і запуску на агарозному гелі. Набір для синтезу кДНК першого ланцюга Transcriptor (Roche) використовувався для синтезу кДНК. Кожні 20 мкл реакційної суміші містили 600 нг РНК, 2,5 мкМ оліго（dT）, 8 мМ реакційного буфера RT, 1 мМ dNTP, 10U зворотної транскриптази, 20U інгібітор РНКази та воду, вільну від Рнази-Днази. Реакцію проводили при 55 градусах протягом 30 хвилин, 85 градусах протягом 5 хвилин, а потім охолоджували при 4 градусах за допомогою термоциклера Applied Biosystems Veriti (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, США). КПЦР у реальному часі проводили за допомогою апарату для ПЛР у реальному часі StepOne Plus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). Кожна суміш для ПЛР містила 5 мкл основної суміші для ПЛР Power SYBR Green (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США), прямий і зворотний праймери в концентраціях, зазначених у таблиці S1, 10 нг кДНК, а потім довели до 10 мкл з РНКазою, вода без ДНКаз. Протокол ПЛР складався з 95 градусів протягом 20 секунд, 40 циклів при 95 градусах і 60 градусах, і, нарешті, кривої плавлення в діапазоні від 60 градусів до 95 градусів зі швидкістю нагрівання 0,3 градуса /15 с. Воду та реакційну суміш без зворотної транскриптази включали як негативні контролі в кожному циклі ПЛР, і всі зразки аналізували в двох примірниках. Були оцінені такі гени: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA та NCX1. Раніше було встановлено, що PKG1 і SDHA стабільно експресуються в нирках овець [20], і зразки були нормалізовані щодо експресії цих генів і ефективності генів за допомогою методу 2-AACt [22].

Статистичний аналіз проводили за допомогою R Studio 1.3.1093[23] з версією R

4.0.3 і tidyverse, nlme 3.1-150 і Гері

2.1.2 пакети. Лінійні моделі були застосовані до log10 трансформованих даних експресії генів. У першій моделі експресія гена була змінною результату, тоді як група (контроль або OVX, але за винятком овець, які отримували глюкокортикоїди) і час (умертвлені через 2 м або 5 м) були залежними змінними, з включеним терміном взаємодії (група: час). У другій моделі експресія генів була змінною результату, тоді як група (контроль, OVX, OVX з лікуванням глюкокортикоїдами протягом 2 місяців і OVX з лікуванням глюкокортикоїдами протягом 5 місяців) була залежною змінною.переваги циноморіяОскільки кілька змінних результатів (генів) тестувалися на відмінності між групами, р-значення були скориговані для багаторазового тестування за допомогою послідовної процедури Холма [24]. Концентрації кальцію, фосфору та 25-гідроксивітаміну D у сироватці крові перевіряли на моделях експресії генів, але вони не були значущими та, враховуючи відсутність суттєвих відмінностей між групами, були видалені. Крім того, аналіз головних компонентів використовувався для оцінки того, чи відрізняються дані про експресію гена трансформованого log10 залежно від групи, часу евтаназії або концентрації 25-гідроксивітаміну D у сироватці крові. Попарна кореляція Спірмена та діаграми розсіювання були використані для вивчення кореляції між даними експресії генів, трансформованих у log10, та аналітами сироватки.

3. Результати

3.1. Вплив оваріектомії, часу після оваріектомії та лікування глюкокортикоїдами на концентрації кальцію, фосфору та 25-гідроксивітаміну D у сироватці крові

Повні результати щодо концентрації кальцію, фосфору та 25-гідроксивітаміну D у сироватці крові в кожній групі представлені на рисунку 1. Не було суттєвих відмінностей у концентраціях кальцію, фосфору та 25-гідроксивітаміну D у сироватці крові між група з оваріектомією та дієтою з низьким вмістом кальцію та група без оваріектомії з адекватною кальцієвою дієтою, а також час після оваріектомії 2 місяці та 5 місяців. Ці результати свідчать про те, що оваріектомія в поєднанні з дієтою з низьким вмістом кальцію не вплинула на концентрацію кальцію в сироватці. і отримували лікування глюкокортикоїдами протягом місяців з наступною евтаназією через 5 місяців, мали значно нижчі концентрації кальцію в сироватці (p =0.0462, прим. R20.13) порівняно з 5 м оваріектомією на дієті з низьким вмістом кальцію та 5 м оваріектомією на дієта з низьким вмістом кальцію та вівці, які отримували глюкокортикоїди. Проте аналіз даних показує, що це може бути пов’язано з гіпокальціємією однієї тварини (1,52 ммоль/л, референтний діапазон 2.0-2.7 ммоль/л); видалення з ця тварина прибрала будь-яке значення.пустельний гіацинтУсі інші вівці мали концентрацію кальцію в сироватці в межах референсного діапазону. Жодних відмінностей у сироваткових концентраціях фосфору чи 25-гідроксивітаміну D у овець, яким видалено 5 м яєчника та які отримували глюкокортикоїди, не виявлено.

3.2. Вплив оваріектомії та часу після оваріектомії на експресію вітаміну D і фосфатоніну в нирках

Експресія генів вітаміну D і генів, пов'язаних з фосфатуванням, не була пов'язана з оваріектомією або часом після оваріектомії (рис. 2). Винятком був рецептор вітаміну D (VDR), завдяки чому група OVX мала значно більшу експресію VDR (p=0.05, adj R2 0.16); однак ця значущість зникла після поправки на повторні вимірювання.

3.3. Вплив оваріектомії та лікування глюкокортикоїдами на експресію генів вітаміну D і фосфатоніну в НИРКАХ через 5 місяців після операції

Повні результати представлені на малюнку 3. Експресія PTH1R була значно більшою у овець OVX, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців, порівняно з іншими групами (p=0.04, adj R40.18), тоді як TRPV5 (p{ Експресія {8}}.01, adj R20.31) і CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) була значно вищою у овець OVX, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців, порівняно з іншими групами.

Експресія клото значно відрізнялася між усіма групами (p =0.01, adj R20.48), з найнижчою експресією у контрольних овець. Вівці OVX, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців, мали найвищу експресію (p =0.002), за якою йшли вівці OVX (p=0.008), а потім вівці OVX, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців (p{ {10}}.03). Однак, якщо відкоригувати повторні вимірювання, експресія генів у цих групах суттєво не відрізнялася, причому klotho показав найбільшу різницю в овець OVX, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців (p=0.1).

Подібним чином експресія VDR значно відрізнялася між усіма групами (p=0.03, adj R20.38). Найбільша експресія VDR була у овець OVX, які отримували глюкокортикоїди протягом місяців (p=0.009), за ними йшли овець OVX (p=0.01), потім овець OVX, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців (p=0.05), а найнижча експресія була присутня у контрольних овець.

3.4. PCA загальної експресії генів між групами

Аналіз PCA OVX, контролю та евтаназії через 2 та 5 місяців не зміг відокремити різні групи (рис. S1). PCL та PC2 пояснили 69,6% варіацій. Подібним чином аналіз PCA груп, підданих евтаназії через 5 місяців, також не зміг відокремити різні групи. PCL і PC2 пояснили 53,2 відсотка варіації (Малюнок S2). Аналіз PCA показав, що загальну експресію генів не можна пояснити концентрацією кальцію та фосфору в сироватці 25-гідроксивітаміну D (Малюнок S3).

3.5. Попарна кореляція між усіма аналітами та експресією генів

Незалежно від статусу оваріоектомії, вмісту кальцію в раціоні, часу після оваріоектомії (2 або 5 місяців) або статусу лікування глюкокортикоїдами, експресія гена NPT1 була суттєво та позитивно корелювала (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Обговорення

Результати цього дослідження свідчать про те, що лікування глюкокортикоїдами оваріектомованих овець мало найбільший вплив на експресію генів, тоді як сама оваріектомія та час після оваріектомії (2 і 5 місяців) мали незначний вплив на експресію генів. В однофакторному аналізі значні відмінності в експресії генів TRPV5, CYP24A1 і klotho спостерігалися у овець після оваріектомії, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців з наступною евтаназією через 5 місяців, і в PTH1R у овець після оваріектомії, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців. Відмінності були найбільш помітними в експресії клото після коригування для повторних вимірювань.

Кількісна периферична комп’ютерна томографія проксимального відділу великогомілкової кістки цих овець показала, що оваріектомія зменшила загальну об’ємну мінеральну щільність кісткової тканини (vМЩКТ) на 8 відсотків, оваріектомія з лікуванням глюкокортикоїдами протягом 5 місяців на 27 відсотків, а оваріектомія з лікуванням глюкокортикоїдами протягом 2 місяців та евтаназія через 5 місяців на 13 відсотків [6]. Цікаво, що трабекулярна МЩКТ, трабекулярна площа та вміст мінеральних речовин у трабекулярній кістці були подібними або вищими, ніж контрольні у овець після оваріектомії, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців і піддалися евтаназії через 5 місяців, що свідчить про відновлення кісткової маси [6]. Глюкокортикоїди мають кілька добре задокументованих впливів на кістку, що призводить до розвитку індукованого глюкокортикоїдами остеопорозу. Ці ефекти включають пригнічення утворення клітин-попередників остеобластів і остеобластів, посилення апоптозу остеобластів і зниження вироблення остеоїдів, усі з яких зменшують утворення кісток [25,26]. У той же час глюкокортикоїди збільшують резорбцію кісткової тканини шляхом зниження експресії OPG, підвищення експресії RANKL, збільшення утворення остеокластів, зменшення апоптозу остеокластів і збільшення секреції катепсинів і матриксних металопротеїназ остеокластами [25,26].

Клото є невід’ємним компонентом системи фосфатування, за допомогою якої він зв’язується з фактором росту фібробластів 23 (FGF23) у нирках. Потім комплекс клото-FGF23 зв’язується з рецептором FGFR1IIC, який ініціює кілька клітинних шляхів і, зрештою, призводить до посилення експресії ниркової 24-гідроксилази (CYP24A1) і зниження регуляції ниркової la-гідроксилази (CYP27B1) і ниркових канальців Котранспортери Na/P II (NPT2a і 2c) [10]. Підвищена експресія (розбіжності в якій були найбільш помітними після поправки на повторні вимірювання) клото в овець, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців і потім піддалися евтаназії через 5 місяців, може пояснити підвищену експресію CYP241, яка також спостерігається в цій групі овець, незважаючи на відсутність суттєвих відмінностей у сироваткові концентрації 25OHD.

Klotho відомий як білок, що запобігає старінню, і миші з дефіцитом клото мають низьке утворення кісткової тканини та резорбцію кісткової тканини, що призводить до низького обміну кісткової тканини, остеопенії [27,28]. Крім того, специфічні поліморфізми гена klotho пов’язані зі зниженням мінеральної щільності кісткової тканини у людей [29,30]. Розчинний клото активізує білок ранньої відповіді на ріст 1 (EGR-1) і індукує експресію маркерів диференціації кісток у культурі клітин остеобластів [31]Крім того, глюкокортикоїди можуть пригнічувати фактор росту фібробластів 232. Можливо, більша експресія клото у овець, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців і потім піддавали евтаназії через 5 місяців, відображає процес відновлення цих овець після лікування глюкокортикоїдами та, враховуючи його роль у формуванні та резорбції кісткової тканини, ймовірно є ключовим фактором відновлення кісткової тканини. і, отже, потенційно є мішенню лікування остеопорозу у людей.

Проте вівці OVX також мали підвищену експресію клото порівняно з контрольними вівцями. Подібним чином одне дослідження на мишах з дефіцитом ароматази показало, що дефіцит естрогену підвищує рівень білка клото, а лікування естрадіолом знижує експресію клото у цих мишей [17]. У мишей естроген знижує регуляцію NPT2a в процесі, який не залежить від klotho/FGF23 і ПТГ [18]. Однак цей ефект не спостерігався у вівці з видаленням яєчників у цьому дослідженні. В іншому випадку існує мало літератури про вплив дефіциту естрогену на клото. Подальші дослідження мають вивчити вплив як оваріектомії, так і глюкокортикоїдів на експресію клото, враховуючи його роль у старінні та хронічній хворобі нирок.

TRPV5 є епітеліальним кальцієвим каналом, який переважно експресується в дистальних звивистих канальцях і сполучних канальцях нирки [20,33]. Канал TRPV5 конститутивно відкритий, але піддається кальцій-залежній інактивації у зв’язку з кальмодуліном, білком, що сприймає кальцій [34]. Експресія TRPV5 може бути збільшена ПТГ і 1,25(OH)D3 [35]. Одна вівця, яка отримувала глюкокортикоїди протягом 2 місяців і була піддана евтаназії через 5 місяців, мала гіпокальціємію, і концентрація кальцію в сироватці була значно нижчою у овець цієї групи порівняно з іншими групами. Тому ймовірно, що підвищена експресія TRPV5 є результатом зниження концентрації кальцію в сироватці крові у цих тварин. Було показано, що глюкокортикоїди зменшують всмоктування кальцію в кишечнику шляхом зниження експресії TRPV6 і CalD9k [36,37] і збільшення екскреції кальцію з сечею [14], але клінічно значуща гіпокальціємія у здорових людей зустрічається рідко. Подібним чином вівці з низькою концентрацією кальцію в сироватці крові не виявляли клінічних ознак гіпокальціємічної тетанії. З іншого боку, підвищена експресія TRPV5 у овець, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців і потім піддалися евтаназії через 5 місяців, може відображати процес відновлення, у результаті чого для заміни відновленої трабекулярної МЩКТ, площі та мінерального вмісту кісткової тканини необхідна підвищена резорбція кальцію з нирок.

У овець, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців, експресія PTH1R була підвищеною порівняно з іншими групами. Крім того, порівняно з іншими групами, між вівцями в групі були невеликі варіації в експресії. Хоча не було виявлено відмінностей у концентраціях кальцію в сироватці крові у овець, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців, можливо, це могло бути пов’язано з посиленням дії ПТГ та його рецепторів. Вплив глюкокортикоїдів на секрецію та дію ПТГ невідомий. Деякі дослідження на людях виявили, що у пацієнтів, які приймали глюкокортикоїди, спостерігається підвищення концентрації ПТГ у сироватці крові, а також зниження абсорбції кальцію, збільшення екскреції кальцію із сечею та зменшення кісткової маси [38,39]. Проте більшість досліджень не виявили змін у сироваткових концентраціях ПТГ у людей під час лікування глюкокортикоїдами [38, 40, 41]. Одне дослідження показало, що, ймовірно, глюкокортикоїди впливають на зміну секреції паратгормону з підвищенням пульсуючої секреції паратгормона в осіб, які приймають глюкокортикоїди [4]. Інші також продемонстрували підвищену експресію PTH1R в мезенхімальних стовбурових клітинах і остеобластоподібних клітинах у відповідь на лікування дексаметазоном [43,44]. Таким чином, збільшення ниркової експресії PTH1R у овець, які отримували глюкокортикоїди протягом 5 місяців, ймовірно, пов’язано з 5-місячним лікуванням глюкокортикоїдами.

У той час як оваріоектомія в поєднанні з дієтою з помірно низьким вмістом кальцію призвела до мінімальних змін експресії генів, виявилося, що вона змінила експресію VDR, при цьому вівці після оваріектомії на дієті з помірно низьким вмістом кальцію мали більшу експресію VDR порівняно з контрольними вівцями. Це контрастує з дослідженням на щурах з видаленою яєчником, де у тих, хто отримував дієту з нормальним рівнем кальцію, спостерігалося підвищення ниркової експресії VDR, тоді як у тих, хто отримував дієту з низьким вмістом кальцію, експресія VDR була знижена [45]. У цьому дослідженні на овець важко відокремити вплив оваріоектомії на ниркову експресію VDR від впливу дієти з низьким вмістом кальцію. Однак не було суттєвих відмінностей у концентраціях кальцію в сироватці між групами (за винятком групи глюкокортикоїдів), що свідчить про те, що дієта з помірно низьким вмістом кальцію мала мінімальний ефект і, можливо, вплив на VDR пов’язаний з оваріектомією. Однак для вивчення цих зв’язків будуть потрібні додаткові дослідження.

У двох попередніх дослідженнях вивчалися окремі зв’язки між генами, що реагують на вітамін D, і генами, пов’язаними з фосфатуванням, у нирках овець [20,21]. Однак взаємозв'язок між вітаміном D і шляхами фосфатування не досліджувався. Цікаво, що найбільш значні кореляції між генами, про які повідомляється в цих двох статтях, також стосуються зв’язків генів у цьому дослідженні овець, що свідчить про узгодженість результатів між дослідженнями та зв’язків між цими генами.екстракт цистанчі сальсиЗ цікавих зв’язків, про які раніше не повідомлялося, як можна було очікувати, враховуючи його ключову роль у метаболізмі кальцію, експресія PTH1R сильно корелювала з CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho та NPT2c. Експресія клото сильно корелювала з експресією гена TRPV5, що узгоджується з іншою літературою, яка показує, що клото посилює регуляцію TRPV5 і сприяє нирковій реабсорбції кальцію [46,47].

На жаль, різні групи не можна розділити на основі експресії генів, що реагують на вітамін D і фосфатування, за допомогою аналізу PCA. Ймовірно, це пов’язано з основним обмеженням цього дослідження — малим розміром вибірки. Оскільки в кожній групі лише 3-6 тварин, це, ймовірно, обмежує здатність виявляти відмінності в експресії генів між групами.

5. Висновки

Результати цього дослідження показують, що найбільш помітні відмінності в експресії генів спостерігалися в експресії клото в нирках у овець з видаленою яєчником, які отримували глюкокортикоїди протягом 2 місяців з подальшим періодом відновлення тривалістю 5 місяців. Враховуючи, що клото є гормоном «антистаріння» і відіграє вирішальну роль у метаболізмі кальцію та фосфатів, можливо, що цей гормон бере участь у відновленні мінеральної щільності та площі трабекулярної кістки у овець, які отримували лікування, і, отже, потенційно може бути цільове лікування остеопорозу у людей. Проте необхідні додаткові дослідження щодо впливу глюкокортикоїдів і оваріектомії на клото.

Ця стаття взята з Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals