Олігосахариди полегшують гостре ураження нирок шляхом послаблення кластерної диференціації 44-опосередкованої імунної відповіді в клітинах ниркових канальців

Анотація:Гостре ураження нирок (ГПН)це раптовий епізодураження нирокщо зазвичай виникає у пацієнтів, які госпіталізовані. На сьогоднішній день не розроблено ідеального лікування для зменшенняСтупінь тяжкості ГПН. Оліго-фукоїдан(FC) перешкоджає кластеру диференціювання 44 (CD44) поверхневих клітин ниркових канальців для запобігання інтерстиціальному фіброзу нирок; однак вплив олігосахаридів на ГПН залишається невідомим. У цьому дослідженні FC, галактоолігосахарид (GOS) і фруктоолігосахарид (FOS) були обрані для дослідження впливу олігосахаридів на AKI. Доведено, що всі три олігосахариди частково всмоктуються в кишечнику. Ми виявили, що олігосахариди залежно від дози знижують антигенність CD44 і пригнічують спричинену гіпоксією експресію CD44, фосфо-JNK, MCP-1, IL-1 і TNF- у NRK-52E клітини ниркових канальців. Тим часом трансфекція siRNA CD44 та інгібітор JNK SP600125 зменшили індуковану гіпоксією експресію фосфо-JNK і цитокінів. Ліганд CD44, гіалуронан, нейтралізував вплив олігосахаридів на CD44 і фосфо-JNK. Через 2 дні після операції з приводу ішемічно-реперфузійного ушкодження олігосахариди зменшили запалення нирок, сироватковий креатин, MCP-1, IL-1 і TNF- у мишей з ГПН. Через 7 днів після операції спостерігалося відновлення нирок. Ці результати вказують на те, що FC, GOS і FOS інгібують індукований гіпоксією каскад CD44/JNK і цитокіни в клітинах ниркових канальців, тим самим полегшуючи ГПН і запалення нирок у мишей ГПН. томудобавка олігосахаридівє потенційною стратегією охорони здоров’я для пацієнтів з ГПН.

Ключові слова: гостре ураження нирок; кластер диференціювання 44; фруктоолігосахарид; галактоолігосахарид; оліго-фукоїдан; запалення

1. Вступ

Гостре ураження нирок(ГПН) характеризується раптовим зниженням швидкості клубочкової фільтрації та, як наслідок, підвищенням рівня креатиніну в сироватці крові. Це пошкодження часто зустрічається у пацієнтів, які госпіталізовані в лікарні та відділення інтенсивної терапії, особливо літніх людей. Ішемія, сепсис і нефротоксичність є основними причинами ГПН, які часто співіснують і, таким чином, ускладнюють діагностику та лікування [1]. Важкий ГПН піддає виписаним пацієнтам ризик несприятливих подій, таких як хронічна хвороба нирок, серцево-судинні події, рак та інфекції [2]. AKI має швидкий розвиток, і немає ефективного лікування, щоб уникнути або зменшити його тяжкість. Прийом певних поживних речовин може зменшити пошкодження ниркових канальців при ГПН [3]. Таким чином, вивчення впливу особливого харчування на ГПН допоможе полегшити ГПН і супутні ризики, з якими стикаються виписані пацієнти.

Запалення та рекрутинг лейкоцитівє ключовими медіаторами ГПН. Виробляють нирки, особливо клітини ниркових канальцівзапальні цитокінипід час ГПН, наприклад IL-1, IL-6, моноцитарний хемоаттрактантний білок-1 (MCP-1) і фактор некрозу пухлини (TNF-) [4,5] . Ці цитокіни додатково індукують системне запалення та рекрутинг лейкоцитів. Незважаючи на те, що кілька підгруп лейкоцитів здійснюють захисну дію на ГПН (наприклад, Т-регуляторні клітини), більшість нейтрофілів, моноцитів і дендритних клітин шкідливі для відновлення ГПН [6]. Системне запалення також шкодить одужанню від ГПН через високі рівні цитокінів [7]. Серед цитокінів, що виділяються нирками, MCP-1 головним чином відповідає за рекрутинг лейкоцитів, реагує на різні цитокіни, включаючи IL-1 і TNF- [8,9], і відіграє важливу роль у патогенезі різних ушкоджень нирок [10]. У людських проксимальних тубулярних клітинах HK-2 індукована гіпоксією експресія MCP-1 опосередкована шляхом c-Jun NH2- кінцевої кінази (JNK) [11]. Шлях p38 також бере участь у індукованій альбуміном експресії MCP-1 в епітеліальних клітинах ниркових канальців [12]. Таким чином, регуляція шляхів JNK і p38 може впливати на запалення та рекрутинг лейкоцитів при ГПН.

Олігосахариди — полімери сахаридів, що містять 3–10 моносахаридів, які є неперетравлюваними і є основним компонентом усіх доступних пребіотиків як дієтичних добавок [13]. Більшість фруктоолігосахаридів (ФОС), що потрапляють в організм людини, повністю ферментуються флорою товстої кишки, і невелика частина виділяється з сечею [14]. Галактоолігосахариди (ГОС) можуть всмоктуватися в кров і згодом виводитися з сечею [15]. Така ж ситуація стосується фукоїдану в бурих морських водоростях [16]. Абсорбовані олігосахариди можуть впливати на біохімічні реакції та розпізнавання клітин [17]. Наше попереднє дослідження показало, що олігофукоїдан (FC) перешкоджає взаємодії між поверхневим білком клітин ниркових канальців CD44 та його позаклітинними лігандами, тим самим запобігаючи інтерстиціальному фіброзу нирок [18]. Взаємодія між CD44 та його позаклітинними лігандами сприяє сигнальному шляху JNK [19]. Таким чином, щоденний прийом олігосахаридів може зменшити запалення нирок у пацієнтів з ГПН. Однак вплив цих полімерів на AKI залишається невідомим. У цьому дослідженні досліджували вплив FC, FOS і GOS на клітини ниркових канальців, оброблені гіпоксією, і AKI мишей з ішемічно-реперфузійним пошкодженням (IRI). Результати показали, що три олігосахариди пригнічували CD44-опосередковані імунні відповіді нирок і зменшували тяжкість пост-ГПН. Таким чином, використання цих полімерів як харчової добавки представляє нову стратегію лікування ГПН

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

FOS (середній ступінь полімеризації < 10), GOS (середній ступінь полімеризації < 8) і FC (середній ступінь полімеризації < 5) були отримані від Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США, Кат. № F8052), Carbosynth (Беркшир, Великобританія, Кат. № OG32134) і Hi-Q Marine Biotech International (Тайпей, Тайвань), відповідно. Олігосахариди розчиняли у двічі дистильованій H2O та фільтрували за допомогою стерильних фільтрів 0,22 мкм (Merck Millipore, Дармштадт, Німеччина). Гіалуронан (ГК) та всі інші хімічні речовини реактивної якості були отримані від Sigma. Антитіла проти JNK (sc-7345), фосфо-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17) }}) і TNF- (sc-52746) були придбані в Santa Cruz Biotechnology (Даллас, Техас, США). Антитіла проти p38 (9212) і фосфо-p38 (9211) були отримані від Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Антитіла проти Ly6G (ab25377) і F4/80 (ab100790) були придбані у Abcam (Кембридж, Великобританія). Антитіла проти HIF-1 (NB100-105) були придбані у Novus Biologicals (Centennial, CO, USA).

2.2. Культура клітин

Клітини проксимальних ниркових канальців щурів (NRK-52E) і лінію макрофагів миші RAW264.7 були придбані в Інституті досліджень і розвитку харчової промисловості (Сінчу, Тайвань); культивують у DMEM, доповненому розчином антибіотика/протигрибкового засобу та 10% фетальної телячої сироватки; і зберігали при 37 ◦C і вологості 95% в CO2-інкубаторі. Після досягнення 70% конфлюентності клітини культивували в безсироватковому середовищі та інкубували протягом ночі перед експериментом. Для експерименту з гіпоксією клітини NRK-52E та Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США) помістили в прямокутні банки (Mitsubishi Gas Chemical America), а всю установку помістили в 37 ◦C інкубатор протягом 4 год. Потім клітини культивували протягом ночі за нормальних умов.

2.3. Вестерн-блот аналіз

Коротше кажучи, 15 мкг білкового лізату NRK-52E наносили на кожну доріжку, а результати аналізували Вестерн-блоттингом. Відносні рівні білкових смуг були кількісно визначені з п'яти незалежних експериментів за допомогою програмного забезпечення Quantiscan від Biosoft (Кембридж, Великобританія).

2.4. Коротка інтерферуюча (si)РНК трансфекція CD44

МіРНК CD44 щурів (4390771) була придбана у Thermo Scientific (Waltham, MA, США). Після зростання до 70% конфлюентності клітини трансфікували siRNA з використанням трансфекційного реагенту Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) згідно з інструкціями виробника.

2.5. Аналіз проліферації клітин

Після того, як гіпоксичні клітини NRK-52E культивували протягом 24 годин, те саме середовище використовували для культивування клітин RAW264.7 у 96-лунковому планшеті (2000 клітин/лунку). Після 24 годин інкубації проліферацію клітин RAW264.7 аналізували за допомогою набору SRB Assay Kit (Abcam, кат. № ab235935) відповідно до інструкцій виробника.

2.6. Тести на антигенність CD44

Рекомбінантний щурячий CD44 був отриманий від R&D Systems (Міннеаполіс, Міннесота, США, кат. № 6577-CD) і використаний для отримання реакції зв’язування з ГК відповідно до інструкцій виробника. Коротше кажучи, 20 нг/мл рекомбінантного CD44 щурів змішували з різними концентраціями FC, FOS або GOS протягом 10 хвилин, щоб дослідити вплив олігосахаридів на антигенність CD44. Суміші аналізували за допомогою набору CD44 ELISA (Abcam, кат. № ab213928) згідно з інструкціями виробника.

2.7. Експериментальні тварини та нирковий ІРІ

Восьмитижневих самців мишей 129S1/SvImJ придбали у Lasco Technology (Тайпей, Тайвань). Усі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом Тайбейського медичного університету з догляду та використання експериментальних тварин (номер схвалення LAC-2019-0511) і сформовані Керівництвом NIH з догляду та використання лабораторних тварин. Для індукції ІРІ мишей (масою 21–23 г) піддавали двосторонньому перетисканню ниркової ніжки протягом 30 хв шляхом проведення розрізу з боку бока [20]. Перед операцією мишей анестезували за допомогою інгаляційної анестезії ізофлураном. Фальшивооперованим мишам проводили аналогічну операцію, за винятком перетискання ниркових ніжок. Усіх мишей годували олігосахаридами через ротовий зонд від 1 дня до до 2 днів після операції IRI. Піддослідні миші були розділені на наступні п’ять груп з n=8 для результатів на 3-й і 7-й день: (1) фіктивна група; (2) група AKI; (3) Група AKI, яку годували FC (10 мг/кг/день); (4) група AKI, яку годували ФОС (10 мг/кг/день); і (5) група AKI, яку годували GOS (10 мг/кг/день). Мишей умертвляли через 3 або 7 днів після операції, а кров збирали та аналізували за допомогою біохімічного аналізатора та наборів ELISA. Рівень креатиніну в сироватці крові кожної миші аналізували для оцінки розвитку AKI. Морфологію нирок досліджували за допомогою фарбування періодичною кислотою-Шиффом (PAS) та імуногістохімічного фарбування (IHC) у фіксованих формаліном 2 мкм парафінових зрізах.

2.8. Імуногістохімічне фарбування

Тканини нирок фіксували 4% забуференим параформальдегідом, заливали в парафін і розрізали на зрізи 2 мкм для фарбування за допомогою наборів UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific, Фремонт, Каліфорнія, США) і гібридизації з первинним антитілом згідно з інструкціями виробника. .

2.9. Фарбування PAS

Зрізи нирок фарбували за допомогою набору PAS Stain Kit (Abcam, кат. № ab150680) відповідно до інструкцій виробника.

2.10. Аналіз ELISA

Культивне середовище клітин NRK-52E та зразки сироватки піддослідних мишей збирали та аналізували за допомогою набору MCP-1 ELISA (Abcam, кат. № ab208979) та IL-1 Набір для ELISA (Abcam, кат. № ab197742). Зразки сироватки також аналізували за допомогою набору TNF-ELISA (R&D Systems, кат. № MTA00B) і набору ELISA, асоційованого з нейтрофільною желатиназою ліпокаліну (NGAL) (R&D Systems, кат. № MLCN20) інструкції виробника.

2.11. Статистичні тести

Достовірні відмінності між двома групами були визначені за допомогою t-критерію Стьюдента. Відмінності вважалися значущими для значень р<0.05

3. Результати

3.1. Олігосахариди пригнічують збільшення CD44 і цитокінів у гіпоксичних клітинах NRK{3}}E

Експресію CD44 у клітинах NRK-52E, оброблених FC, FOS і GOS, спочатку відстежували, щоб оцінити вплив олігосахаридів на клітини ниркових канальців. Експресія CD44, викликана гіпоксією, пригнічувалася всіма трьома олігосахаридами в діапазоні 0.05–0,5 мг/мл (рис. 1A). Таким чином, дозування олігосахариду 0,1 мг/мл використовувалася в наступних клітинних експериментах. У підготовленій системі лікування гіпоксією значною мірою викликало експресію маркера гіпоксії HIF-1 у клітинах NRK-52E, що вказує на те, що клітини перебували в стані гіпоксії (Малюнок 1B). Гіпоксія підвищувала рівень фосфорильованих JNK, MCP-1, IL-1 і TNF-, але не в клітинах, оброблених олігосахаридами (рис. 1B, C). Експресія JNK зросла в гіпоксичних клітинах, але не в клітинах, оброблених FC або FOS. GOS не впливав на експресію JNK в гіпоксичних клітинах, але пригнічував регуляцію фосфорильованого JNK. Таким чином, олігосахариди можуть інгібувати спричинену гіпоксією передачу сигналів JNK і експресію цитокінів у клітинах ниркових канальців. Хоча FC і GOS посилювали фосфорильований p38 у гіпоксичних клітинах, експресія цього білка не збільшувалася в гіпоксичних клітинах. Це відкриття вказує на те, що р38 не відіграє ключової ролі у відповідях, спричинених гіпоксією, у клітинах NRK-52E.

3.2. CD44 і JNK відіграють вирішальну роль у збільшенні кількості цитокінів у гіпоксичних клітинах NRK{3}}E

На експресію CD44, фосфорильованого JNK і цитокінів у клітинах ниркових канальців впливають олігосахариди, але їх зв’язок ще належить з’ясувати. Щоб дослідити роль CD44 у трансдукції сигналу JNK та експресії цитокінів у гіпоксичних клітинах, клітини NRK-52E трансфікували різними дозами siRNA CD44. МіРНК CD44 при 50 і 100 хв ефективно блокувала посилену гіпоксією експресію CD44 і значно пригнічувала індуковане гіпоксією підвищення рівнів фосфорильованих JNK, MCP- 1, IL-1 і TNF- (рис. 2A). Вплив блокування CD44 на експресію JNK був пов'язаний з дозами siRNA. Експресія JNK у гіпоксичних клітинах була індукована CD44 siRNA при 50 пМ, але інгібована при 100 пМ. Обидві дози пригнічували регуляцію фосфорильованого JNK. Селективний інгібітор JNK, SP600125, значно знижував експресію MCP-1, IL-1 і TNF- у гіпоксичних клітинах NRK-52E (рис. 2B). Ці результати свідчать про те, що інгібуючий ефект трансфекції siRNA CD44 на індуковані гіпоксією цитокіни пояснюється зниженням фосфорильованого JNK.

Рисунок 1. Інгібуюча дія олігосахаридів на трансдукцію сигналу CD44 у гіпоксичних клітинах NRK-52E. Клітини попередньо обробляли FC, FOS або GOS протягом 30 хв, а потім піддавали гіпоксичному культивуванню. Експресію білка аналізували Вестерн-блоттингом. (A) Дозозалежні ефекти олігосахаридів на експресію CD44. (B) Вплив олігосахаридів на сигнали, пов’язані з CD44-. Концентрація олігосахаридів була встановлена ​​як 0,1 мг/мл. Відносне збільшення білкових смуг також представлено у вигляді гістограми (C). Результати виражені як середнє значення ± SD (n=4).

Рисунок 2. Роль CD44 і JNK у спричинених гіпоксією запальних реакціях у клітинах NRK-52E. Експресію білка аналізували Вестерн-блоттингом. (A) Інгібуючий ефект трансфекції siRNA CD44 на фосфорильований JNK і цитокіни. (B) Інгібуюча дія SP600125 на цитокіни. Клітини попередньо обробляли 20 мкМ SP600125 протягом 30 хвилин перед обробкою гіпоксією. Відносне збільшення білкових смуг також представлено у вигляді гістограми. Результати виражені як середнє значення ± SD (n=4).

3.3. Індукована гіпоксією секреція цитокінів у клітинах ниркових канальців сприяє проліферації макрофагів

Запалення є медіатором ураження нирок при ГПН. Тому досліджували вплив олігосахарів на лейкоцити. На малюнку 3A показано, що FC, FOS і GOS не впливають на проліферацію клітин макрофагів RAW264.7. Проліферації клітин RAW264.7 сприяло 24-годинне культуральне середовище для гіпоксичних NRK-52E клітин (рис. 3B), але не середовище для гіпоксичних NRK-52E клітин, оброблених олігосахариди. Перший мав вищі рівні MCP-1 та IL-1, ніж останній (рис. 3C, D). Усі три олігосахариди значно знижували MCP-1 та IL-1 у культуральному середовищі гіпоксичних клітин NRK-52E. Таким чином, FC, FOS і GOS можуть знижувати експресію та секрецію цитокінів у гіпоксичних клітинах ниркових канальців і, отже, зменшувати запалення, викликане пошкодженими клітинами ниркових канальців.