Глутатіонові мікроголкові патчі без запаху для відбілювання шкіри

Анотація:

Глутатіон - це природна речовина, що запобігає старінню, яка запобігає окисленню білкових тіолів активними формами кисню. У фармацевтичній промисловості відновлений глутатіон (GSH) широко використовується для відбілювання шкіри завдяки його здатності інгібувати тирозиназу.

Однак його погана проникність і неприємний запах обмежують його використання на шкірі. У цьому документі ми повідомляємо про пластир з розчинною мікроголкою (MN), наповнений GSH, виготовлений з гіалуронової кислоти (HA), який забезпечує покращене проникнення через шкіру та зменшує неприємний запах GSH. HA було обрано для приготування розчинів GSH без запаху та використано для виготовлення MN як носій GSH. Масиви MN (GSH-MN), наповнені GSH, виготовлені з розчину, що утворює MN, що містить до 10 відсотків GSH, продемонстрували хорошу однорідність малюнка та відповідні механічні властивості для введення в шкіру. GSH-MN з місткістю завантаження 17,4 відсотка розчиняються протягом 10 хвилин після введення в шкіру свині та вивільняють завантажений GSH без окислення. Цей новий підхід поєднує в собі функціональні біополімери для зменшення характерного запаху GSH і передову трансдермальну доставку на основі технології MN для покращення проникнення шкіри без болю. Ми вважаємо, що ця методика може розширити застосування GSH у багатьох галузях космецевтики.

Для відбілювання ми виявили, що цистанхе має дуже хороший відбілюючий ефект, а екстракт загальних глікозидів фенілетанолу цистанхе має значний вплив на регуляцію активності тирозинази, основного ферменту, що обмежує швидкість синтезу меланіну в шкірі. Активна дія може зменшити вміст гранул меланіну в шкірі (Yang Jianhua, et al. West China Pharmaceutical Journal, 2010, 25(05):533-535); досліджували основні п’ять мономерів фенілетанол глікозидів у Cistanche deserticola та очищеному бензолі Cistanche deserticola. Встановлено, що вплив загальних глікозидів етанолу на вміст гранул меланіну в первинно культивованих меланоцитах шкіри людини має значний інгібуючий ефект на синтез меланіну шкіри; ультрафіолетовий спектр глікозидів фенілетанолу з Cistanche deserticola було відскановано, і було виявлено, що він може ефективно поглинати ультрафіолетове випромінювання в областях UVA та UVB (Yang Jianhua та ін. West China Pharmaceutical Journal, 2011, 26(3):{{9 }}); Було досліджено антиоксидантну активність фенілетанолглікозидів з Cistanche deserticola, і результати показали, що всі вони мають сильну свободу поглинання Основа активна, має відбілюючий ефект.

Натисніть тут, щоб купити цистанчу трубчасту

Ключові слова:

глутатіон; трансдермальна доставка ліків; гіалуронова кислота; мікроголка; відбілювання шкіри.

1. Введення

Глутатіон, природний тіоловий трипептид глутаміл-цистеїніл-гліцину, відіграє важливу роль у клітинних окисно-відновних реакціях і бере участь у інгібуванні синтезу меланіну, захисті від активних форм кисню та детоксикації клітин [1,2]. Хоча глутатіон присутній як в окисленій, так і в відновленій формах в організмі, відновлений глутатіон (GSH) є сполукою з високим ступенем біологічної корисності [3,4].

Наприклад, його здатність пригнічувати синтез меланіну шляхом інгібування тирозинази дозволяє використовувати його як засіб для відбілювання шкіри в космецевтиці [5–7]. Крім того, GSH може бути використаний як стимулятор імунітету, протиотрута при отруєнні металами та лікування таких захворювань, як фіброз, глаукома та артрит [8–11]. На жаль, його низька біодоступність і неприємний запах обмежують використання GSH у клініках, незважаючи на його численні терапевтичні застосування.

Лікарські пептиди зазвичай вводять парентеральними шляхами з використанням підшкірних голок. Однак цей шлях потребує медичної допомоги під час введення кожної дози та має погану комплаєнс пацієнта через біль, який відчувається під час ін’єкції [12,13]. Хоча місцеве застосування використовувалося для доставки GSH через шкіру, його неприємний запах і нездатність проходити через роговий шар (SC, зовнішній бар’єр шкіри) обмежують його використання [14].

Останнім часом мінімально інвазивна система трансдермальної доставки з використанням мікроголок (МН) привернула велику увагу практикуючих лікарів, особливо для доставки біологічно активних агентів, таких як пептиди та білки, які є лабільними до шлунково-кишкового рН і чутливі до ферментативної деградації [15].

Щоб подолати обмеження, пов’язані з існуючими методами доставки GSH, ми передбачили швидкорозчинний пластир MN, виготовлений шляхом дезодорації біополімерів, щоб підвищити ефективність GSH і дотримання пацієнтом режиму. Висока біосумісність і регульовані фізико-хімічні властивості біополімерів, таких як гіалуронова кислота (ГА), роблять їх придатними кандидатами в якості матеріалів MN [16,17]. Крім того, біополімери з багатофункціональними групами можуть взаємодіяти з молекулами через оборотні іонні взаємодії, водневі зв’язки та сили Ван-дер-Ваала, тим самим сприяючи їх високій навантажувальній здатності та хорошим властивостям адсорбенту [18]. Оскільки кінетику вивільнення ліків, завантажених у MN, можна контролювати за допомогою розчинення або швидкості деградації використовуваних полімерів, платформи MN, що розчиняються, можна застосовувати для тривалого та тривалого вивільнення ліків трансдермальним шляхом [19–22].

Тут ми повідомляємо про новий підхід до ефективної трансдермальної доставки GSH без запаху за допомогою розчинних пластирів MN, виготовлених з дезодорованих біополімерів. Після скринінгу кількох біополімерів на склади GSH без запаху, ГК було обрано як матеріал для MN і використано для виготовлення пластирів MN, завантажених GSH. Було визначено, що кількість GSH, завантаженого в HA MN, має оптимальний антимеланогенний ефект і нижчу цитотоксичність, що підтверджено дослідженнями цитотоксичності та інгібування тирозинази. Масиви HA MN (GSH-HA MN), навантажені GSH, оцінювали на предмет однорідної текстури, геометрії, бажаної механічної міцності та здатності проникати через шкіру. Після нанесення пластирів GSH-HA MN на тканину шкіри тварин вивчали їхню здатність до розчинення та закономірності вивільнення ліків.

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

Відновлений глутатіон (GSH), желатин (із свинячої шкіри), 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5- дифенілтетразолію бромід (MTT) , а койєва кислота (KA) була придбана у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США), гіалуронат натрію (100 k, HA) був придбаний у SNVIA (Пусан, Корея). Хондроїтину сульфат (ХС) був придбаний у Wako Chemicals (Осака, Японія). -Меланоцитстимулюючий гормон (-MSH) був придбаний у TOCRIS (Брістоль, Великобританія), а набір для виявлення апоптозу з використанням FITC (флуоресцеїн ізотіоціанат)-міченого аннексину V був придбаний у BD Biosciences (Бедфорд, Массачусетс, США). Рідкий преполімер (Sylgard 184A) і затверджувач (Sylgard 184B) для формування полідиметилсилоксану (PDMS) були придбані у Dow Corning (Midland, MI, USA). Усі хімікати використовували без додаткового очищення. Свинячу шкіру (з видаленою шерстю) закуповували в місцевій м’ясній крамниці та зберігали при -20 ◦C до використання в експериментах.

2.2. Культура клітин

Кератиноцити людини (клітини HaCaT) і клітинні лінії меланоми мишачого походження (B16F10), які використовувалися для досліджень in vitro, були отримані від ATCC (Манассас, Вірджинія, США). Клітини вирощували в середовищі DMEM без GSH (Hyclone, Logan, UT, США), доповненому 10% фетальної бичачої сироватки (FBS, Hyclone), 2 мМ глутаміну (Sigma-Aldrich), 100 ОД/мл пеніциліну (Hyclone), і 100 мкг/мл стрептоміцину (GenDEPOT, Баркер, Техас, США) при 37 ◦C у зволоженій атмосфері з 5 відсотками CO2.

2.3. Тести на запах

Для оцінки відновного ефекту біополімерів на запах GSH було проведено метод оцінки запаху [4]. Кількість біополімеру (гіалуронат натрію, желатин і хондроїтинсульфат) фіксували на рівні 10 відсотка від маси в загальному розчині, а GSH змішували в різних концентраціях (1.0 відсотка, 2.{ {9}} відсотків, 2,5 відсотка та 5,0 відсотка за масою) у деіонізованій (Di) воді. Після 30 хвилин змішування група з 10 добровольців відчула запах розчину, що містить суміш біополімеру та GSH. Розчин GSH без біополімеру використовувався як еталон для порівняння запаху сірки змішаних зразків.

Кожного добровольця попросили вказати своє сприйняття запаху змішаного розчину за такою 5-бальною шкалою: 1: відсутність запаху, 2: впізнаваний запах, 3: легко помітний запах, 4: сильний запах і 5: інтенсивний запах .

2.4. Вимірювання газовою хроматографією (ГХ).

На основі результатів підрахунку кількість вивільненого H2S було визначено для всіх складів GSH-HA за допомогою газової хроматографії (Shimadzu, Токіо, Японія) з використанням фотометричного детектора з імпульсною рамкою (PFPD) [23,24]. Розчини 1 відсотка, 2,5 відсотка та 5 відсотків (за вагою) GSH змішували з 10 відсотками (за вагою) ГК і 1 мл вводили в коричневий вакуумний флакон на 10 мл. Флакон зберігали в духовці при 40 ◦C протягом 1 години, а потім виймали. Утворений газ (100 мкл) збирали за допомогою шприца та вводили в Shimadzu GC, обладнаний PFPD. Розділення основних сполук сірки було досягнуто на скляній колонці з внутрішнім діаметром 30 м × 0,25 мм (DB-1, J&W) при 90 ◦C і потоці носія (азоту) 1 мл/хв. Температури детектування та інжекції становили 250 та 150 ◦C відповідно. Кількість H2S вимірювали за стандартними пробами. Чутливість PFPD становила 10 ppb для H2S. Було підтверджено, що дані всіх зразків знаходяться в діапазоні стандартної кривої.

2.5. Тести на цитотоксичність

Цитотоксичність GSH оцінювали за допомогою аналізу MTT і фарбування аннексином V-FITC. Коротко кажучи, клітини HaCaT (кількість клітин: 1 × 104 ) обробляли 0.1, 0.25, {{10}}.5 і 1.0 мг/мл GSH у середовищі DMEM. Через 24, 48 і 72 години обробки до клітини додавали 50 мкл розчину МТТ та інкубували протягом 1 години перед аспірацією середовища. Після цього додавали 100 мкл диметилсульфоксиду (ДМСО) і обчислювали відсоток життєздатних клітин шляхом вимірювання поглинання 540 нм за допомогою зчитувача MULTISKAN GO (Thermo Scientific, Waltham, MA, США). Апоптоз вимірювали одночасним фарбуванням аннексином V-FITC і йодидом пропідію (PI). Клітини HaCaT (1 × 106) обробляли 0,1, 0,25, 0,5 та 1,0 мг/мл GSH. Після 72-годинної обробки клітини збирали, оброблювали трипсином, промивали холодним PBS і фарбували буфером для зв’язування 1X, що містить розчин аннексину V-FITC і PI. Згодом клітини інкубували при кімнатній температурі протягом 15 хв у темряві. Пофарбовані клітини аналізували за допомогою проточної цитометрії протягом 1 години. Як апоптотичні, так і живі клітини аналізували за допомогою проточного цитометра Becton Dickinson FACSscan і програмного забезпечення BD FACSDiva (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США).

2.6. Визначення вмісту клітинного меланіну та активності тирозинази

Пропонований відбілюючий ефект GSH оцінювали шляхом вимірювання його здатності інгібувати активність тирозинази. Коротше кажучи, клітини меланоми B16F10 мишачого походження висівали в 6-планшет для культури з лунками в концентрації 5.0 × 104 клітини/лунку та дозволяли прикріпити на ніч. Клітини обробляли {{10}} (порожній), 0.1, 0.25, 0,5 та 1,0 мг/мл GSH та 10 мкМ койєвої кислоти ( KA) як позитивний контроль протягом 4 годин, а потім стимулював -MSH (1 мкМ) протягом 72 годин, щоб індукувати активність тирозинази. Після видалення середовища клітини розчиняли в 500 мкл 1N NaOH та інкубували протягом 1 години при 60 ◦C для солюбілізації меланіну. Вміст меланіну визначали шляхом вимірювання абсорбції при 405 нм. Для визначення тирозиназної активності клітини лізували в 100 мкл 50 мМ натрій-фосфатного буфера (pH 6,5), що містив 5 мкл 1% тритону X-100 і 5 мкл 0,1 мМ фенілметилсульфонілфториду. Після центрифугування при 10,000 g (30 хв, 4 ◦C) супернатанти з 20 мкл l-3,4-дигідроксифенілаланіну (l-DOPA) були завантажені в {{ 44}}планшет з лунками, і поглинання вимірювали при 492 нм при 37 ◦C.

2.7. Виготовлення накладок ГШ-МН

Масиви GSH-MN у формі кулі (10 × 10 MNs/см2) були виготовлені за допомогою багаторазової форми PDMS шляхом відливання з розчинника водного розчину 10 відсотків ГК розчини з різними концентраціями GSH (0 відсотка, 1,0 відсотка, 2,5 відсотка та 5,0 відсотка за вагою). Негативні форми PDMS з кулеподібними порожнинами були відтворені з металевих масивів MN, виготовлених за допомогою мікрообробки [16]. MN-утворювальні розчини (350 мкл розчинів HA або HA/GSH) вносили піпеткою у форму PDMS і сушили при 40 ◦C протягом 12 годин після дегазації під вакуумом. Висушені масиви MN обережно відшаровувалися від форми. Морфологію виготовлених MN-матриць охарактеризували за допомогою цифрової (AM413ZT, Dino-Lite, Тайвань) та оптичної (Eclipse TS100, Nikon, Японія) мікроскопії. HA MN, що містять 0, 1, 2,5 і 5 мг/мл GSH, називали GSH0-HA MN, GSH1-HA MN, GSH2.5-HA MN та GSH5-HA MN відповідно.

2.8. Випробування на руйнування

Одиночний HA MN і GSH-навантажений HA MN (GSH0-HA MN, GSH1-HA MN і GSH2.5-HA MN) були закріплені за допомогою ціаноакрилатного клею (Loctite 4{{ 7}}1, Loctite Corp, Дублін, Ірландія), щоб закріпити монтажний штифт, розміщений на нижній ручці універсальної випробувальної машини (UTM, A&D 5000H, A&D Sales Corp, Тегу, Корея). Верхню рукоятку механічного тестера переміщали аксіально вниз до наконечника MN зі швидкістю 0,1 мм/хв. Силу текучості вимірювали як функцію швидкості переміщення зонда та виражали в Ньютонах (Н).

2.9. Тест на введення шкіри

Тест на введення шкіри проводився для перевірки проникаючої здатності МН, ймовірного ступеня викривлення та можливого відхилення тканин під час його введення. GSH0-HA MN, GSH1-HA MN і GSH2.5-HA MN були закріплені ціаноакрилатним клеєм до металевої поверхні за допомогою кріплення за допомогою верхньої ручки UTM і вставлені за допомогою силу 10 мм/хв на вирізану свинячу шкіру (3 × 3 см2, ~2 мм товщиною), розміщену біля основи механічного тестера [25]. Свинячу шкіру використовували після видалення скальпелем підшкірного жирового шару.

2.10. Тест на розчинення

GSH2.5-HA MN наносили на свинячу шкіру (3 × 3 см2) у кілька заздалегідь визначених моментів часу (3, 5, 7 і 10 хв). Після видалення плям MN висоту розчинення кінчиків MN вимірювали за допомогою оптичного мікроскопа (Eclipse TS100, Nikon, Токіо, Японія).

Для підтвердження проби GSH2.5-HA MN пластирів 0.5 мг барвника (родаміну B) додавали до 1 мл 2,5% (за масою) змішаних розчинів GSH для приготування MN . Згодом виготовлення масиву MN з використанням розчину, змішаного з барвником, було виготовлено за допомогою того самого методу, який описано вище. Знак удару, сформований з масивів MN, їх положення під час трансляції в шкіру свині та ступінь відхилення тканини аналізували під цифровим мікроскопом (AM413ZT, Dino-Lite, Тайвань). Будь-які зміни в морфології MN після введення досліджували під оптичним мікроскопом.

2.11. Ємність завантаження та ефективність інкапсуляції

Щоб визначити кількість GSH, завантаженого в HA MN, кінчики MN з GSH{{0}}HA MN і GSH2.5-HA MN відповідно були розрізані та повністю розчинені в PBS (pH 7,4). ) протягом 24 год. Кількість GSH у наконечниках MN визначали шляхом аналізу 10 мкл розчину зразка за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (HPLC, e2695, Waters, США) на колонці SunFire C18 (100Å, 5 мкм, 4,6 × 250 мм, Води). ВЕРХ проводили, використовуючи водний ацетонітрил (5:95) і 0,1% трифтороцтової кислоти (TFA) як рухому фазу зі швидкістю потоку 0,8 мл/хв. На основі даних ВЕРХ місткість навантаження (LC) і ефективність інкапсуляції (EE) були розраховані за допомогою таких рівнянь: Ємність навантаження (відсотки)=men mtot × 100 (1). Ефективність інкапсуляції (відсотки)=чоловік хв × 100 (2)

де men представляє кількість інкапсульованої лікарської речовини в наконечниках MN, most — це загальна маса наконечників MN, а min — кількість лікарського засобу в розчинах, що утворюють MN [26].

2.12. Тести на проникнення через шкіру in vitro GSH

Щоб дослідити кінетику проникнення ex vivo через шкіру відновленого GSH, що вивільняється з GSH2.5-HA MN-пластини, були проведені статичні дифузійні тести на клітинах Франца, щоб обчислити швидкість залежного від часу вивільнення GSH через GSH2.5- {5}}HA MNs та його дифузія через шкіру разом із еталонним розчином GSH-HA. Пластирі GSH2.5-HA MN і 350 мкл GSH2.5-розчину HA, який використовувався для виготовлення MN, наносили на вирізану шкіру щура Sprague-Dawley (SD) (товщиною ~2 мм) розміщені між донорною та рецепторною камерами в дифузійній комірці Франца відповідно. Після вставлення пластирів GSH2.5-HA MN у шкіру щурів гідроколоїдний клейовий пластир (NeoDerm Roll, EVERAID, Yangsan, Корея) наклали на підкладку MN під час доставки ліків. Рецепторну камеру з бічним плечем заповнювали 22 мл свіжого буфера PBS (pH 7,4) і підтримували при 37 ◦C [27]. Один мілілітр зразка відбирали в кожну часову точку (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 і 48 годин) із камери клітинного рецептора Франца та знову заповнювали рівною кількістю свіжого PBS (pH 7,4). ). Пластирі GSH2.5-HA MN видаляли зі шкіри щурів через 1 год. Кількість GSH, яка була вивільнена з кінчика MN і проникла через шкіру щурів, аналізували за допомогою ВЕРХ з використанням протоколу, описаного вище. GSH виявляли шляхом вимірювання поглинання при 385 нм і концентрацію препарату виражали в мг.

2.13. Статистичний аналіз

Усі результати виражаються як середнє ± стандартне відхилення (SD) і аналізуються за допомогою t-критерію Стьюдента. Рівень значущості був встановлений на р < 0.05.

3. Результати та їх обговорення

3.1. Скринінгові тести для вибору дезодоруючих полімерів

Базуючись на інтенсивності запаху, аналіз балів проводився за шкалою від 1 до 5 для оцінки вивільнення H2S в результаті автодеградації вільних GSH і біополімерних композицій GSH. Експеримент проводився шляхом включення 10 випадково відібраних здорових добровольців будь-якої статі. Сильний запах був пов’язаний з більшою кількістю виділеного H2S і навпаки. Усі концентрації (1.0–5.0 відсотків за масою) желатину (4,75 ± 0.2) і CS-GSH (3,25 ± 0.95) композиції отримали вищу оцінку, тоді як HA-GSH (1,5 ± 0.35) набрав нижчу оцінку, ніж лише GSH (2,75 ± 0,61; рис. 1а). Високі бали для композицій желатин-GSH і CS-GSH порівняно з лише GSH були зумовлені їхніми характерними запахами на додаток до запаху вивільненого H2S.

Пізніше на основі показників запаху було проведено кількісну оцінку вивільненого H2S (у ppm) за допомогою ГХ для складу GSH-HA при різних концентраціях. Було встановлено, що кількість вивільненого H2S становить щонайменше 1.0 відсоток і 2,5 відсотка (0.55 ± 0.01 і {{13} }.49 ± 0.03 ppm) і максимум 5.0 відсотків (1.03 ± 0.{{27} }1 ppm) GSH у рецептурі. У всіх концентраціях значення були нижчими, ніж у GSH окремо (0,59 ± 0.03, 0,75 ± 0,04 і 1,15 ± 0,05 для 1,0 відсотка, 2,5 відсотка та 5 відсотків GSH відповідно; рисунок 1b). Причиною цього результату було те, що заміщений Na плюс у HA реагує з тіоловою групою GSH за формулою реакції, показаною на додатковому малюнку S1. Було підтверджено, що зменшення запаху було спричинене зменшенням виробництва H2S (додатковий малюнок S1) [28,29]. Ці результати показують, що ГК має кращий дезодоруючий ефект порівняно з желатином і КС, тому її було обрано для виготовлення МН у цьому дослідженні. Оскільки максимальна дезодоруюча здатність HA для вивільненого H2S спостерігалася з 1,0 відсотками, 2,5 відсотками та 5,0 відсотками GSH-HA (рисунок 1b), ці три концентрації були обрані для виготовлення MN.

3.2. Вплив GSH на цитотоксичність і активність тирозинази

Аналіз МТТ використовувався, щоб визначити, чи є GSH цитотоксичним для HaCal. Аналіз флуоресцентно-активованого сортувальника клітин (FACS) проводили з використанням анексину V, який спеціально та сильним вітром на поверхні клітин PI, щоб підтвердити, чи спостерігалася апоптотична чи некротична загибель клітин (30Обробка GSH0 .2-1.0 мг/мл суттєво не змінив частку життєздатних клітин при 72 порівняно з клітинами, обробленими носієм (рис. 2a). Цитотоксичний вплив GSH на клітини HaCaT не підтверджено потоком цитометричний аналіз з використанням аннексину V. Вплив на клітини HaCaT 0, 0.1, 0.25, 0.5 або 1 мг мл GSH протягом 72 годин призводив до залежна від концентрації індукція апоптозу (рис. 2b,c) Вплив GSH не викликав значного збільшення кількості апоптотичних клітин (7,90 плюс 1.02-13.99 плюс 0.37 відсотків ) і зменшення частки живих клітин (88,38 плюс 1.02-80.81 плюс 0.67 відсотка) порівняно з клітинами, обробленими носієм (4,85 плюс 0,72 відсотка та 90,47 плюс 0,93 відсотка для апоптичних і живі клітини відповідно; малюнок 2b,c). Ці результати свідчать про те, що GSH не є токсичним для кератиноцитів людини і може безпечно використовуватися на шкірі людини.

Тирозиназа - це фермент, який відповідає за синтез меланіну. Відбілюючий ефект GSH оцінювали шляхом вимірювання швидкості інгібування виробництва меланіну та активності ферменту, що обмежує швидкість тирозинази, у меланогенезі. Клітини B16F10 попередньо обробляли 10 мкМ KA і GSH (0,1–1,0 мг/мл) протягом 4 годин, а потім стимулювали -MSH (1 мкМ) протягом 72 годин. Лікування GSH значно пригнічувало вироблення меланіну, викликане -MSH (рис. 3a). Згідно з цим висновком, активність -MSH-індукованої тирозинази (345,60 ± 18,29 відсотка без лікування GSH) була значно знижена до 207.34 2020 ± 2,78 відсотка при лікуванні 1 мг/мл GSH (рис. 3b).

3.3. Виготовлення GSH-навантажених HA MN та їх механічні властивості

Щоб доставити GSH через шкіру мінімально інвазивним способом, ми вибрали HA як матеріал MN на основі його здатності зменшувати H2S, що було підтверджено оціночними тестами та даними газової хроматографії (рис. 1). MN-утворюючі розчини, що містять HA та GSH, використовувалися для приготування масивів HA MN (GSH-HA MN), навантажених GSH. Масиви були підготовлені за допомогою методу лиття з розчинника з використанням прес-форми PDMS, що має порожнини у формі кулі. Матриці GSH-MN (100 MNs/см2) показали рівномірний малюнок з висотою 770 ± 5 мкм, діаметром основи 172,25 ± 2,5 мкм і діаметром кінчика 7,8 ± 2,5 мкм з кутом 40 ± 2,5 ◦ (Малюнок 4а). Геометрія MN була визначена таким чином, щоб забезпечити проникнення через шар SC і трансдермальну доставку GSH з мінімальним пошкодженням судин або нейронів, щоб уникнути болю та капілярної кровотечі в місці застосування. Однорідні характеристики GSH-HA MN були отримані, коли MN були виготовлені з використанням MN-утворюючих розчинів, що містили 2,5 відсотка GSH, але деякі зігнуті MN спостерігалися при виготовленні з високою концентрацією (5 відсотків) GSH (додатковий малюнок S2).

Механічні властивості МН ГШ-ГА досліджували в режимі стиснення. Один MN, прикріплений ціаноакрилатним клеєм на нижній поверхні UTM, був аксіально стиснутий плоскою металевою пластиною, прикріпленою за допомогою верхньої рукоятки машини зі швидкістю 0.1 мм/хв (Рис. 4a–c) . Сила текучості або сила, необхідна для того, щоб матеріал втратив свою еластичність, була визначена як 0.25, 0.39 і 0.4{{1{{17 }}}} N з відхиленням ±0.03 для GSH0-HA MN, GSH1-HA MN і GSH2.5-HA MNs відповідно (рис. 4d). Встановлено, що сила введення становить 0.36 ± 0.003, 0,39 ± 0,015 і 0,37 ± 0,005 для GSH0-HA MN, GSH{{30 }}HA MNs і GSH2.5-HA MNs відповідно. Було виявлено, що як сили текучості, так і сили введення достатньо для введення MN у свинячу шкіру без будь-яких переломів, спотворень або відхилень тканини.

3.4. Тести на розчинення GSH-HA MNs in vitro

Час розчинення біополімеру визначає схему вивільнення ліків і початок дії будь-якої форми. Щоб передбачити час, необхідний для вивільнення GSH, єдиний MN (GSH, 5-HA) був вставлений у свинячу шкіру, яка структурно схожа на шкіру людини. Мікроскопічний аналіз показав залежне від часу розчинення MN. Після нанесення GSH-MN на шкіру протягом 12 хвилин наконечники MN були повністю розчинені, що ініціювало його швидке вивільнення (рис. 5a, b). Щоб підтвердити проникнення в шкіру пластирів GSH 5-HA MN, пластирі MN (1,5 x 1,5 см), наповнені родаміновим барвником, наносили на шкіру свині із силою введення 20 Н протягом 1 хв. Після видалення наповнених барвником MN-патчів ми спостерігали ряд плям барвника, що відповідають кожній голці, що підтверджує введення MN GSH 5-HA у шкіру (рис. 5c).

Місткість завантаження відноситься до максимальної кількості лікарського засобу, яка може бути піддана носії доставки, і визначає його ефективність завантаження. Ємність завантаження пластирів GSH-HA MN визначається як маса завантаженого препарату (GSH) у наконечниках MN, поділена на загальну масу наконечників GSH-HA MN. Щоб перевірити ефективність завантаження, наконечники MN, завантажені GSH, розрізали та розчиняли в PBS (pH 7,4), а кількість GSH, завантаженого в наконечники, аналізували за допомогою ВЕРХ. Величина завантаження GSH у 100 наконечниках MN становила {{10}}.29 ± {{20}}.03 мг і 0,56 ± 0,03 мг для пластирів GSH1-HA MN і GSH2.5-HA MN пластирів відповідно. Враховуючи загальну масу наконечників GSH-MN (100 MN, 2 ± 0,2 мг), навантажувальна ємність становила 11,26 ± 1,24 відсотка та 21,33 ± 1,13 відсотка, а ефективність інкапсуляції становила 8,36 ± 0,92 відсотка та 6,34 ± 0,34 відсотка для GSH1-HA MN і GSH2.5-HA MNs відповідно (табл. 1). Подібні значення між ваговим співвідношенням HA: GSH (10:1 або 10:2,5) у розчинах, що утворюють MN, і здатністю навантаження GSH у шматках MN свідчать про рівномірний розподіл GSH у пластирі MN.

3.5. Тест на проникнення пластирів GSH-HA MN Ex Vivo через шкіру

Щоб оцінити початок і тривалість вивільнення GSH з GSH, 5-HA MNs, було проведено дослідження клітин Франца протягом 48 годин, помістивши шкіру щура SD у змодельовані фізіологічні умови (рис. 6). GSH 5-HA MNs показали відносно швидку лінійну кінетику вивільнення для початкового етапу12 год з подальшим повільним вивільненням з часом.

Кількість GSH, що проникає через шкіру після нанесення MN, становила ~1,4 мг протягом перших 12 годин експерименту і досягла ~1,6 мг протягом 48 годин. Було доставлено кількість GSH, що перевищує завантажену кількість у наконечниках MN. Ця кількість включає не лише GSH, завантажений у наконечники GSH2.5-HA MN, але й GSH, який міститься в базовому шарі як резервуар ліків. Навпаки, розчин GSH-HA повільно доставлявся в невеликих кількостях (~0,2 мг) через погане проникнення GSH через шкіру. Оскільки трансдермальна доставка людського гормону росту з використанням МН, виготовлених на основі карбоксиметилцелюлози та трегалози, продемонструвала короткий tmax (~30 хв) після застосування МН і показала подібні фармакокінетичні профілі, як і під час підшкірної ін’єкції [19], пластир GSH-HA з швидкою водою- абсорбційні властивості будуть застосовні для системної доставки GSH. Виходячи з досліджень in vitro, лікування 1 мг/мл GSH значно пригнічувало вироблення меланіну та активність тирозинази. Враховуючи невеликий об’єм (~150 мкл/см2) інтерстиціальної рідини в шкірі [31], локально доставлений GSH пластирами HA MN (1,6 мг GSH/1 см2 пластиру MN) може діяти як антиоксидант під час процесу розчинення MN. Оскільки кінетику вивільнення GSH, завантаженого в MN, можна контролювати щільністю зшивання матеріалу MN [32,33], платформа MN, що розбухає, буде корисною для ефективної доставки GSH з мінімальними побічними ефектами.

4. Висновки

На основі дезодоруючої здатності (балове значення) і результатів ГХ ми вибрали ГК для розробки біорозкладаних пластирів MN для трансдермальної доставки GSH без запаху. HA маскувала неприємний запах GSH ефективніше, ніж желатин і CS. Пластир HA-MNs (GSH2.5-HA) мав достатню міцність, щоб проникнути крізь шкіру, не пошкоджуючись. Вивільнення GSH із патчів HA-MN (GSH1-HA та GSH2.5-HA) виявилося рівномірним протягом певного періоду, як показали відповідні експерименти. Дослідження цитотоксичності та інгібування тирозинази показали, що концентрація GSH 1 мг/мл є безпечною та ефективною для цілей відбілювання шкіри. Загалом доцільність розроблених пластирів HA MN як багатообіцяючої платформи для трансдермальної доставки GSH або препаратів із шкідливими або неприйнятними органолептичними властивостями була продемонстрована на основі експериментальних даних, заявлених у цьому дослідженні.

Додаткові матеріали:

Рисунок S1: Вплив гіалуронату натрію на зменшення запаху, Рисунок S2: Зображення масиву GSH5 -HA MN.

Авторські внески:

Концептуалізація, YL, Y.-SJ та SYY; Методологія, Ю.Л., Ш.К., К.-Ю.С., С.К.; Керування даними, CK і HL; Написання — оригінальна чернетка, YL, SK, SYY; рецензія та редагування С.К., Ю.-С.Й., К.-Й.С., С.Ю.; Supervision, SYY Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.

Фінансування:

Це дослідження було підтримано Національним дослідницьким фондом Кореї (NRF), що фінансується Міністерством науки та ІКТ (NRF-2018R1A4A1025623), а також Національною програмою творчих дослідницьких ініціатив через Національний дослідницький фонд Кореї (NRF) фінансується Міністерством науки, ІКТ та майбутнього планування (NRF-2017R1D1A3B03035360).

Конфлікт інтересів:

SYY є винахідником ліцензії на патент компанії (SNVIA), що розробляє косметичні продукти GSH без запаху. Цей потенційний конфлікт інтересів контролюється Національним університетом Пусана.

Список літератури

1. Форман, Г. Дж.; Чжан, Х.; Рінна, А. Глутатіон: огляд його захисних ролей, вимірювання та біосинтезу. мол. Asp. Мед. 2009, 30, 1–12. [CrossRef].

2. Хейс, Дж. Д.; Маклеллан, Л. І. Глутатіон і глутатіон-залежні ферменти являють собою координовано регульований захист від окислювального стресу. Вільний радикал. рез. 1999, 31, 273–300. [CrossRef].

3. Рахман І.; Коде, А.; Бісвас, С. К. Аналіз для кількісного визначення рівнів глутатіону та дисульфіду глутатіону за допомогою ферментативного методу рециркуляції. Нац. Protoc. 2006, 1, 3159. [CrossRef].

4. Yano, H. Порівняння окисленого та відновленого глутатіону в хлібопекарських якостях рисового тіста. J. Food Sci. 2012, 77, C182–C188. [CrossRef] [PubMed].

5. Вешхаваліт, С.; Тонгтіп, С.; Футракул, П.; Асаванонда, П. Глутатіон і його антистаріння та антимеланогенні ефекти. Clin. Космет. Розслідувати. Дерматол. 2017, 10, 147. [CrossRef] [PubMed].

6. Вільярама, CD; Maibach, HI Глутатіон як депігментуючий агент: огляд. Міжн. Я. Космет. Sci. 2005, 27, 147–153. [CrossRef] [PubMed].

7. Арджінпатхана, Н.; Асаванонда, П. Глутатіон як оральний відбілюючий засіб: рандомізоване, подвійне сліпе, плацебо-контрольоване дослідження. J. Dermatol. Пригощати. 2012, 23, 97–102. [CrossRef] [PubMed].

8. Дроге, В.; Breitkreutz, R. Глутатіон і імунна функція. Proc. Nutr. Соц. 2000, 59, 595–600. [CrossRef] [PubMed].

9. Патрік, Л. Токсичність ртуттю та антиоксиданти: Частина 1: Роль глутатіону та альфа-ліпоєвої кислоти в лікуванні токсичності ртуттю. Чергувати. Мед. 2002, 7, 456–472.

10. Чен, Дж. З.; Kadlubar, FF Новий ключ до патогенезу глаукоми. Am. J. Med. 2003, 114, 697–698. [CrossRef].

11. Хасан, MQ; Хаді, Р.А.; Аль-Раві, ZS; Падрон В.А.; Stohs, SJ Система захисту глутатіону в патогенезі ревматоїдного артриту. J. Appl. Токсикол. 2001, 21, 69–73. [CrossRef] [PubMed].

12. Сон, Кентуккі; Seo, MS; Хван, DY; O'Cearbhaill, ED; Срінан, С.; Карп, Я.М.; Yang, SY Самоклеючий пластир з мікроголкою у формі кулі для контрольованої трансдермальної доставки інсуліну. Ж. Контроль. Випуск 2017, 265, 48–56. [CrossRef] [PubMed].

13. Джин, Дж.; Жу, Л.Л.; Чен, М.; Сюй, ХМ; Ван, HF; Фенг, XQ; Чжу, XP; Zhou, Q. Оптимальний вибір шляху введення ліків щодо внутрішньовенних, внутрішньом'язових та підшкірних ін'єкцій. Перевага пацієнта. Прихильність 2015, 9, 923–942. [PubMed].

14. Bouwstra, JA; Honeywell-Nguyen, PL; Гуріс, Г.С.; Понец, М. Структура шкірного бар'єру та її модуляція везикулярними препаратами. Прог. Lipid Res. 2003, 42, 1–36. [CrossRef].

15. Джіскут, В.; Рендольф, TW; Волкін Д.Б.; Middaugh, CR; Schöneich, C.; Вінтер, Г.; Фрісс, В.; Кроммелін, DJ; Карпентер, Дж. Ф. Нестабільність білка та імуногенність: перепони на шляху клінічного застосування ін’єкційних систем доставки білка для тривалого вивільнення. J. Pharm. Sci. 2002, 101, 946–954. [CrossRef].

16. Лю, С.; Jin, MN; Quan, YS; Каміяма, Ф.; Кацумі, Х.; Сакане, Т.; Ямамото, А. Розробка та характеристики нових масивів мікроголок, виготовлених з гіалуронової кислоти, та їх застосування для трансдермальної доставки інсуліну. Ж. Контроль. Випуск 2012, 161, 933–941. [CrossRef].

17. Wang, C.; Є, Ю.; Хочу, Г.М.; Sadeghifar, H.; Gu, Z. Покращена імунотерапія раку шляхом доставки антитіла до PD1 за допомогою мікроголок. Nano Lett. 2016, 16, 2334–2340. [CrossRef].

18. Дассанаяке, Р.С.; Ачарія, С.; Абіді, Н. Матеріали на основі біополімерів із полісахаридів: властивості, обробка, характеристика та застосування для сорбції. У вдосконалених процесах сорбції; Едебалі, С., ред.; IntechOpen: Лондон, Великобританія, 2018; С. 1–24.

19. Лі, JW; Чой, С.О.; Фельнер, Е.І.; Prausnitz, MR Розчинний мікроголковий пластир для трансдермальної доставки людського гормону росту. Малий 2011, 7, 531–539. [CrossRef].

20. Доннеллі, РФ; Сінгх, TRR; Гарленд, MJ; Мигальська, К.; Маджітія, Р.; МакКрудден, CM; Коле, П.Л.; Махмуд, ТМТ; Маккарті, HO; Woolfson, AD. Гідрогелеутворюючі масиви мікроголок для покращеної трансдермальної доставки ліків. Adv. Функція. Матер. 2012, 22, 4879–4890. [CrossRef].

21. Кім, Дж. Д.; Кім, М.; Ян, Х.; Лі, К.; Юнг, Г. Видування повітрям, що народжується краплями: нове виготовлення розчинних мікроголок. Ж. Контроль. Випуск 2013, 170, 430–436. [CrossRef].

22. Кім Х.; Сон, Кентуккі; Лі, Дж. Х.; Парк, В.; Ян, С.Й.; Hahn, SK Біорозкладаний пластир з мікроголками, що доставляє антигенний пептид-гіалуронатний кон’югат для імунотерапії раку. АСУ Біоматер. Sci. інж. 2019, 5, 5150–5158. [CrossRef].

23. Ду, X.; Пісня, М.; Rouseff, R. Ідентифікація нових летючих речовин сірки полуниці та змін під час дозрівання. Дж. Агрік. Харчова хім. 2011, 59, 1293–1300. [CrossRef] [PubMed].

24. Бочкай, Г.; Камінські, М.; Przyjazny, A. Контроль процесу та дослідження кінетики окиснення постокислювальних стоків за допомогою газової хроматографії з імпульсним полум’яним фотометричним детектуванням (GC-PFPD). Інд. інж. Chem. рез. 2010, 49, 12654–12662. [CrossRef].

25. Девіс, С.П.; Landis, BJ; Адамс, ZH; Аллен, М.Г.; Prausnitz, MR Введення мікроголок у шкіру: вимірювання та прогнозування сили введення та сили зламу голки. J. Biomech. 2004, 37, 1155–1163. [CrossRef] [PubMed].

26. Чандрасехаран, А.; Хван Ю.Дж.; Сон, Кентуккі; Парк, С.; Кім, С.; Yang, SY Водорозчинний хітозан, оброблений кислотою, підходить для внутрішньошкірної доставки ліків за допомогою мікроголок. Pharmaceutics 2019, 11, 209. [CrossRef] [PubMed].

27. Кім, Б.; Сон, Кентуккі; Ви, І.; Селварадж, В.; Їм, С.Г.; O'Cearbhaill, ED; Чон, У.; Yang, SY Трансдермальний пластир із дотиком для кількісного контролю проникнення через шкіру. Sens. Actuators B Chem. 2018, 256, 18–26. [CrossRef].

28. Дженсен, Джорджія; Адамс, Д.Ф.; Stern, H. Поглинання сірководню та метилмеркаптану з розбавлених газових сумішей. J. Забруднення повітря. Контроль доц. 1966, 16, 248–253. [CrossRef].

29. Онда, К.; Такеучі, Х.; Кобаяші, Т.; Йокота, К. Одночасне поглинання сірководню та вуглекислого газу у водних розчинах гідроксиду натрію. J. Chem. інж. Японія 1972, 5, 27–33. [CrossRef].

30. Кабаков А.Е.; Gavai, VL Тести загибелі та виживання клітин. В Шаперони; Humana Press: Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2018; С. 107–127.

31. Самант, П.П.; Prausnitz, MR Механізми відбору інтерстиціальної рідини зі шкіри за допомогою пластиру з мікроголками. Proc. Natl. акад. Sci. США 2018, 115, 4583–4588. [CrossRef].

32. Ян, С.Й.; O'Cearbhaill, ED; Сіск, Г.К.; Парк, КМ; Чо, WK; Віллігер, М.; Боума, Бельгія; Помахач, Б.; Карп, Дж. М. Набухаючий мікроголковий клей для механічного зчеплення з тканиною. Нац. Комун. 2013, 4, 1702. [CrossRef].

33. Мігдаді, Є.М.; Кортні, AJ; Текко, І. А.; МакКрудден, Монтана; Kearney, MC; МакАлістер, Е.; Маккарті, HO; Donnelly, RF Гідрогелеутворюючі мікроголки покращують трансдермальну доставку метформіну гідрохлориду. Ж. Контроль. Випуск 2018, 285, 142–151. [CrossRef] [PubMed].

Yechan Lee 1, Sujeet Kumar 1, Sou Hyun Kim 2, Keum-Yong Seong 1, Hyeseon Lee 1, Chaerin Kim 1, Young-Suk Jung 2,* і Seung Yun Yang 1,*

1 Відділ науки про біоматеріали, Інститут конвергенції життя та промисловості, Національний університет Пусана, Мірьян 50463, Корея.

2 Фармацевтичний коледж Пусанського національного університету, Пусан 46241, Корея.

Отримано: 31 грудня 2019 р.; Прийнято: 22 січня 2020 р.; Опубліковано: 27 січня 2020 р

For more information:1950477648nn@gmail.com